Summary
Vi udviklede en model af chorioamnionitis at simulere fostereksponering for moderens inflammation (FEMI) uden komplikationer af levende organismer til at undersøge virkningerne af FEMI på udviklingen af afkom tarmkanalen. Dette giver mulighed for undersøgelse af mekanistiske årsager til udvikling af tarmskade efter chorioamnionitis.
Abstract
Chorioamnionitis er en almindelig foregribelse af præmature fødsel og er forbundet med mange af de sygeligheder af prematurity, herunder nekrotiserende enterocolitis (NEC). Der er dog endnu ikke fundet en mekanistisk forbindelse mellem disse to betingelser. Vi har vedtaget en murin model af chorioamnionitis involverer lipopolysaccharid (LPS)-induceret foster eksponering for moderens inflammation (FEMI). Denne model af FEMI fremkalder en steril moderlig, placental og føtal inflammatorisk kaskade, som også er til stede i mange tilfælde af klinisk chorioamnionitis. Selv om der findes modeller, der udnytter levende bakterier og mere præcist efterligner patofysiologien af en stigende infektion, der resulterer i chorioamnionitis, kan disse metoder forårsage indirekte virkninger på udviklingen af den umodne tarmkanal og det tilknyttede udviklende mikrobiom. Ved hjælp af denne protokol har vi vist, at LPS-induceret FEMI resulterer i en dosisafhængig stigning i graviditetstab og præmature fødsel samt forstyrrelse af normal tarmudvikling hos afkom. Desuden har vi vist, at FEMI øger tarmskade og serumcytokiner hos afkom betydeligt, samtidig med at de reducerer bæger- og Paneth-celler, som begge giver en første linje med medfødt immunitet mod tarmbetændelse. Selv om en lignende model af LPS-induceret FEMI er blevet brugt til at modellere sammenhængen mellem chorioamnionitis og efterfølgende abnormiteter i centralnervesystemet, så vidt vi ved, denne protokol er den første til at forsøge at belyse en mekanistisk sammenhæng mellem chorioamnionitis og senere forstyrrelser i tarm udvikling som en potentiel forbindelse mellem chorioamnionitis og NEC.
Introduction
De chorionic membraner spiller en integreret rolle i pattedyr graviditet. De omfatter chorion og amnion, som tjener flere funktioner. De omgiver og beskytter fosteret, letter parakrine signalering mellem moderens og fosterrum1, og skaber lokale feedback loops i de chorioniske membraner, som kan være involveret i at indlede parturition1. Den nuværende forståelse af membranerne indikerer, at amnionen giver strukturel barrierefunktion, og chorion giver en immunologisk buffer primært for at beskytte det udviklende foster mod moderens immunsystem2. Betændelse i disse membraner er kendt som chorioamnionitis. Historisk set blev diagnosen klinisk chorioamnionitis foretaget efter tilstedeværelsen af moderens feber plus en eller flere foster- eller moderlige kliniske fund3,4. Men selv om denne definition er klinisk nyttig, dens manglende præcision har gjort chorioamnionitis forskning udfordrende. I 2015 definerede et ekspertpanelværksted af Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development chorioamnionitis som intrauterin inflammation eller infektion eller begge dele (triple I)3. Denne afklaring er vigtig, fordi mens mikrobiel induceret infektion er en vigtig årsag til livmoder / fosterbetændelse, det forekommer mindre almindeligt end steril livmoder / fosterbetændelse5,6,7. Samlet set chorioamnionitis fortsat et betydeligt folkesundhedsproblem, som det ses i 2\u20124% af sigt leverancer og 25\u201230% af præmature leverancer8,9.
Chorioamnionitis kan have betydelige virkninger på fosteret og nyfødte. Det er veldokumenteret i litteraturen, at chorioamnionitis er forbundet med øget risiko for mange af sygeligheden af prematurity, herunder bronchopulmonal dysplasi10, cerebral hvidt stof skade11, intraventricular blødning12, retinopati af prematurity13, og både mistænkt og bekræftet tidlig debut neonatal sepsis14,15. Da vi er interesseret i skades- og reparationsmekanismer i tarmkanalen, er det vigtigt at bemærke, at chorioamnionitis også er forbundet med senere udvikling af nekrotiserende enterocolitis (NEC)15,16. NEC er en ødelæggende gastrointestinale sygdom hos for tidligt fødte spædbørn, der resulterer i en dysreguleret værtsrespons på inflammation og efterfølgende tarmnekrose17. Hvert år, NEC påvirker over 4000 spædbørn i USA, og op til en tredjedel af disse spædbørn dør af sygdommen18. Den patogenese af NEC sandsynligvis indebærer en kombination af tarm umodenhed, dysregulering af det umodne immunsystem, tarmbetændelse, og bakteriel translokation19, der kulminerede i en endelig fælles vej tarmnekrose. Vigtigere, starten af NEC ofte opstår uger efter fødslen og potentiel eksponering for chorioamnionitis, hvilket gør den mekanistiske sammenhæng mellem chorioamnionitis og efterfølgende udvikling af NEC uklar20. En potentiel mekanisme, hvormed chorioamnionitis kan bidrage til nec's patofysiologi, er gennem opregulering af moderens immunsystem, der efterfølgende producerer en stærk fosterinflammatorisk reaktion, som kan forstyrre normale føtale udviklingsmønstre21,22,23.
Flere pattedyr modeller af chorioamnionitis findes i gnavere og får24,25,26,27,28,29,30,31,32. Der foreligger imidlertid kun få data om udviklingen af tarmkanalen ud over den første nyfødte periode efter chorioamnionitis-induceret fostereksponering for betændelse hos mødre (FEMI). For at undersøge forholdet mellem FEMI og den efterfølgende udvikling af skader på tarmkanalen har vi tilpasset lipopolysaccharid (LPS)-induceret FEMI-model. Lipopolysaccharider er en vigtig del af den ekstracellulære overflade på gram negative bakterier og er en potent stimulans af det medfødte immunsystem af flere eukaryote arter, herunder mennesker33. Maternal LPS injektion resulterer i en steril inflammatorisk kaskade uden de forvirrende virkninger af levende bakterier, og det er en veletableret model for induktion af præmature fødsel34, samt en model af akut chorioamnionitis og fosterinflammatorisk respons syndrom (FIRS), som er den mest alvorlige form for chorioamnionitis24,35. Det har også vist sig at fremkalde både cerebral hvid og grå stof skade i et får model36 og en murine model37,38,39,40. Men så vidt vi ved, er vi de første til at bruge denne model af chorioamnionitis og FEMI til at undersøge dens virkninger på udviklingen af mave-tarmkanalen tidligere fødsel, samt at undersøge en mulig mekanistisk forbindelse mellem chorioamnionitis og senere udvikling af NEC41,42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (protokol #8041401). Alle dyr blev anbragt i en sammenslutning for vurdering og akkreditering af laboratoriedyrpleje (AALAC) godkendt vivarium ved University of Iowa. Alle mus var vilde type stamme C57Bl/6J.
1. Etablering af FEMI hos gravide mus
- LPS-forberedelse
- Brug LPS afledt af Escherichia coli O55:B5 (lagerkoncentration 2 mg/mL).
- Lps-lagerkoncentrationen fortyndes 1:100 med steril saltvand for en arbejdskoncentration på 20 μg/mL.
- Injektion af LPS til mødre
- Injicere gravide dæmninger på drægtighedsdag e15. Dette tidspunkt er ca. 75% gennem muringraviditeten, hvilket gør denne model udviklingsmæssigt ligner det tidlige tredje trimester af menneskelige graviditeter, hvilket er, når størstedelen af præmature fødsler på grund af chorioamnionitis opstår.
- Afvejes gravide mus umiddelbart før injektionen for at bestemme passende LPS-dosering.
- Arbejdskoncentrationen beregnes ved hjælp af følgende formel: 5 μL x gram legemsvægt (gbw) for en samlet dosis LPS på 100 μg/kg. Til kontroldyr skal der anvendes et tilsvarende volumen normal saltvand til injektion.
- Vortex LPS-opløsning tre gange i 15 sekunder højt før hver injektion.
- Lps-lydstyrken trækkes op i en 1 mL sprøjte.
- Hold gravid mus med scruffing teknik. Hold i dorsal recumbency position og udføre injektionen.
- Sæt en 30 gauge 8 mm nål skrå op overliggende højre nederste kvadrant af maven (for at undgå blære og abdominal fartøjer) i en 30\u201240 ° vinkel. Sæt ca. 1/4 til 1/2 af nålens længde.
- Træk sprøjteskøjten tilbage for at sikre et undertryk inden injektionen. Fortsæt med injektionen, hvis der er et undertryk.
- Efter injektion skal du overvåge mus i ca. 30 minutter og derefter vende tilbage til bure i resten af graviditeten.
2. Levering og pleje af afkom og tarmhøst
- Levere hvalpe normalt via vaginal levering på e20.
BEMÆRK: Denne model har en forventet dosisafhængig fostertabsrate, der kan ses i figur 1 og diskuteres i nedenstående resultater. - Tillad hvalpe at forblive hos mødre og modtage ad libitum feeds.
- På høstdagen, typisk postnatal dag 14 (P14), aflive hvalpe via cervikal dislokation i overensstemmelse med institutionelle Animal Care and Use Committee protokoller.
- Brug saks og pincet, lav et lodret snit ned midt på maven, gennem huden og bughinden, i hele mavens længde. Punktafgift tyndtarmen fra maven til cecum med en saks og fjerne mesenteriet med pincet.
- Isoler og hold den distale 1/3 af tyndtarmen (sektion repræsentant for humant ileum), kassere den proksimale tyndtarmen, cecum, og tyktarmen.
- Del ileumdelen i halve ved hjælp af en saks.
- Placer den proksimale halvdel i en RNA-stabiliseringsopløsning til senere RNA-kvantificering.
- Placer distal halvdel i 10% neutral buffered formalin for dias forberedelse.
3. Tarm skade scoring
- Sektion paraffin indlejret væv i 5 μm tykke skiver og montere på glas dias.
BEMÆRK: Vi sender prøverne til en histologikerne til paraffinintegrering, sektion og montering på dias. - Deparaffinize dias i henhold til standardprocedurer.
- Pletsektioner med hematoxylin og eosin i henhold til standardprocedurer.
- Score sektioner på en 3-punkts skala for tarmskade som tidligere beskrevet42,43.
- Ved hjælp af lysmikroskopi skal du vurdere den generelle tarmskade af to separate blindede efterforskere på en 3-punkts skala, der evaluerer villus integritet og adskillelse fra kælderenmembranen43 (Supplerende figur 1). Tarmskade vurderes bedst ved 20x forstørrelse og numerisk blænde 0,50.
- Tildel en score på 0 for at beskrive normal slimhinde.
- Tildel en score på 1 beskrive mild skade, som omfatter udviklingen af subepithelial Gruenhagen plads, vacuolization eller subepithelial løft begrænset til lamina propria eller tips af villi.
- Tildel en score på 2 til at beskrive alvorlig skade, angivet ved epitelløft og vacuolisering over halvdelen af villi, villi forvrængning, eller slimhindesår og opløsning af lamina propria.
4. Kvantificering af Paneth- og bægerceller
- Efter deparaffinisering, plet dias af væv sektioner fra Trin 2,8 med Alcian Blå / Periodisk Acid Schiff pletten til at betegne både bæger og Paneth celler som tidligere beskrevet44,45 i henhold til følgende trin.
BEMÆRK: Mens Alcian Blue / Periodic Acid Schiff pletten ikke er specifik for hverken Paneth eller bæger celler, i vores erfaring, blindet erfarne efterforskere har tilsvarende cellulære kvantificering ved hjælp af denne plet i forhold til cellulære målrettede antistoffer, med betydeligt mindre baggrund farvning46. - Deparaffinize, pletten, og dehydrere dias som følger.
- Nedsænk rutsjebaner i xylen i 10 minutter to gange.
ADVARSEL: Xylen skal anvendes i en røghætte. - Skyl med 100% EtOH.
- Nedsænkningsdias i 100 % EtOH i 3 min. og derefter i 90 % EtOH i 3 min. efterfulgt af 70 % EtOH i 3 min. og til sidst nedsænkningsrutschebaner i 50 % EtOH i 3 min.
- Vask under rindende vand fra hanen i 5 min.
ADVARSEL: Peg sektionen væk fra rindende vand for at forhindre tab af vævsprøve. - Filter Alcian blå plet løsning med en standard kaffe filter.
- Pletten glider i Alcian blå plet i 15 min og derefter vaske under rindende vand fra hanen i 2 min.
- 1 mg periodisk syre fortyndes i 200 mL dobbeltdestilleret vand. Nedsænk rutsjebaner i denne opløsning i 5 min. Vask derefter under rindende ledningsvand i 1 minut.
- Plet med Schiffs reagens i 10 minutter. Vask under rindende vand fra hanen i 5 min.
- Plette dias med hematoxylin i 1 min og derefter vaske under rindende vand fra hanen i 2 min.
- De nedsænkes i syrealkohol (1 ml saltsyre blandet i 99 ml på 70% etoh) i 1 min.
- Nedsænk i Scotts vand fra hanen (0,1% koncentration af NaHCO3 i postevand) i 1 min og vask derefter under rindende vand fra hanen i 1 minut.
- Dehydrer rutsjebanerne.
- Dyp hvert dias 10 gange i 70% EtOH, og dyp derefter 10 gange i 90% EtOH og 10 gange i 100% EtOH.
- Nedsænk rutsjebaner i 100% EtOH i 10 min, efterfulgt af nedsænkning to gange i frisk xylen i 3 min hver.
- Placer en dråbe monteringsmedie på prøven, og placer et coverlip over det.
- Nedsænk rutsjebaner i xylen i 10 minutter to gange.
- Optælling af bægerceller
- Brug af lysmikroskopi, tælle bægerceller(supplerende figur 2). For hvert stykke tarmvæv skal du tælle antallet af bægerceller og 500 epitelceller og udtrykke bægercelleforholdet som et forhold pr. 100 epitelceller. Flammerne tælles bedst ved 20x forstørrelse og numerisk blænde 0,5.
- Celleoptælling i paneth
- Brug lysmikroskopi, tæl Paneth-celler(Supplerende figur 2). For hvert stykke tarmvæv udtrykkes som et forhold mellem Paneth-celler pr. tarmkrypt. Tæl 100 tarmkrypter pr. stykke tarmvæv. Paneth-celler tælles bedst ved forstørrelse på 20x-60x og numerisk blænde 0,50-1,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udsættelse for FEMI på fosterdag 15 fører til tab af graviditet, der er afhængig af dosis, og en dosisafhængig for tidlig fødsel (figur 1)42. Til forsøgene valgte vi at bruge en LPS-dosis på 100 μg/kg for at minimere graviditetstab og prematurity (50% tab mellem både prematurity og intrauterin fostergang), mens vi udsatte fostrene for en betydelig inflammatorisk fornærmelse.
Ved hjælp af denne tilgang undersøgte vi næste femi's virkninger på efterfølgende skade på afkommet. Ved hjælp af en 3-punkts histologiske skala til måling af generaliseret tarmskade fandt vi betydelig skade ved fødslen (P0) og i voksenalderen (P56 eller 8 uger af livet)(Figur 2). Det er vigtigt at bemærke, at denne skade opstod i mangel af yderligere stimuli til andre dyr end FEMI, hvilket tyder på, at FEMI alene forstyrrer den normale homøostase i den nyfødte murin tarmkanal. Da musen er født med en relativt umoden tarm, der fortsætter med at udvikle sig i løbet af de første 4 uger af livet47,48, dette er relevant for for tidligt fødte spædbørn, der også har umodne tarmkanaler.
For yderligere at forstå virkningen af FEMI på både den normale udvikling af tarmepitelet og på forsvarsmekanismerne i den umodne tarmkanal, kvantificerede vi antallet af mucinproducerende bægerceller og antimikrobielle peptidproducerende Paneth-celler i den distale tredjedel af den lille tarmkanal, der ligner det menneskelige ileum. Vi konstaterede, at FEMI forstyrrede tarmepitelets normale sammensætning ved at fremkalde tab af både bægerceller og Paneth-celler sammenlignet med dyr uden FEMI (figur 3).
For at undersøge FEMI's virkninger på neonatal inflammatorisk respons ved hjælp af ELISA med elektrokemiuminscens kvantificerede vi en række seruminflammatoriske markører, som omfattede IL-1β, IL-10, KC-GRO (murinækvivalenten af IL-8) og IL-6, fra serum af hvalpe med og uden FEMI (Figur 4). Vi fandt ud af, at FEMI øgede den inflammatoriske kaskade betydeligt for alle cytokiner ved P0. Den inflammatoriske kaskade i senere aldre (P7\u2012P56) afveg baseret på tidspunkt og cytokin. Mest interessant, for IL-6, var der lignende niveauer på P7 \u2012P28 i FEMI og fingeret grupper, men på trods af ingen sekundær intervention, var der betydeligt højere niveauer i FEMI-gruppen på P56. Dette er især vigtigt, da vi har vist, at IL-6 er en kritisk cytokin til udvikling af postnatal tarmskade i FEMI-modellen.
Figur 1: Virkningen af FEMI-dosis på graviditetsresultater. Overlevelse af graviditetskuld er dosisafhængig med højere doser, der forårsager højere graviditetstab (A) og højere for tidlig fødsel (B). Figur er tilpasset med tilladelse fra Fricke etal. 42. FEMI ved hjælp af en LPS-dosis på 100 μg/kg giver hvalpene en overlevelse på 50 % med en uges levetid. Hvert datapunkt er repræsentativt for en n > 8 graviditeter og mindst tre individuelle eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Femi's virkning på de distale små tarmskademønstre over tid. Tarmprøver blev høstet ved fødslen, 1 uges levetid, 2 uger af livet og 8 ugers liv fra mus udsat for FEMI (100 μg/kg LPS) eller fingeret kontrol. Prøver blev scoret ved hjælp af en 3-punkts skade skala af blindede efterforskere42,43. FEMI alene uden yderligere fornærmelse induceret betydelig mængde af skade ved fødslen, 1 uge af livet, og på 8 uger af livet. Figur er blevet tilpasset med tilladelse fra Fricke et al.42. Hvert datapunkt er repræsentativt for en n > 10 unger og mindst tre individuelle forsøg fra mindst 3 gravide dæmninger. Mann-Whitney ikke-parametrisk T-test blev brugt til at sammenligne tarm skade score på hvert tidspunkt. Stjernen angiver p < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: FEMI fremkalder ændringer af normale bæger- og Paneth-cellemængder i tyndtarmen under udviklingen. Tarmprøver blev høstet ved fødslen, 1, 2, 4 og 8 ugers levetid fra mus udsat for FEMI (100 μg/kg LPS) eller fingeret kontrol. Prøver blev farvet med Alcian blå / Periodisk Acid Schiff pletten til at opdage både bæger og Paneth celler, og disse blev kvantificeret af en blindet efterforsker. Både bægerceller og Paneth-celler fra dyr med FEMI viste enten en tendens eller et betydeligt fald sammenlignet med falske kontroller i alle aldre. Figur tilpasset med tilladelse fra Elgin et al.41. Hvert datapunkt er repræsentativt for en n > 10 unger og mindst tre individuelle forsøg. Fejllinjer repræsenterer standardfejl af middelværdien. Student T-test blev brugt til at sammenligne mængder af bæger og Paneth celler på hvert tidspunkt. Stjernen angiver p < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: FEMI fremkalder en global neonatal inflammatorisk bølge for alle cytokiner umiddelbart efter fødslen ved P0, med en sen stigning på IL-6 ved P56. Serumcytokiner blev kvantificeret ved P0, P7, P14 og P28 ved hjælp af ELISA med elektrokemiuminscens i henhold til producentens anvisninger, og plader blev læst ved 620 nm. Cytokinværdier er repræsenteret her i et radarplot, og alle cytokiner afbildes som procent af maksimal værdi. Der var betydelige stigninger i alle cytokiner (IL-1β, IL-10, KC-GRO og IL-6) ved P0 i FEMI-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen (alle p < 0,05). Der var også en genopblussen stigning i IL-6 niveauer på P56 i hvalpe med FEMI i forhold til ingen FEMI (p < 0,05 ved ikke-parametriske Kruskal-Wallis test), som var den eneste cytokin, der var betydeligt forhøjet i FEMI-gruppen i forhold til kontrol på dette sene tidspunkt. Figur tilpasset med tilladelse fra Elgin et al.41. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Tarmskade scoring af H &E farvet ileal væv. Skadesscore bestemmes af en trepunkts intestinale skadesscoreskala (0=normal, 1=mild skade, 2=alvorlig skade) baseret på graden af villi vacuolisering, slimhindesår, lamina propria-skader og tilstedeværelse af blødning i villi som tidligere beskrevet43. Figur tilpasset med tilladelse fra Elgin et al.41. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: Repræsentativt udseende af Alcian Blue/PAS farvning af bæger- og panethceller. Alcian Blue / PAS farvning af tarmvæv giver mulighed for klar visualisering af bægerceller, til stede i tarm villi (øverste panel markeret med hvide pile, billede taget ved 20x forstørrelse), og Paneth celler, til stede i krypter af Lieberkuhn, placeret under tarmen villi i lamina propria (nederste panel markeret med gule pile, billede taget ved 60x forstørrelse). Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chorioamnionitis virkninger 2\u20124% af sigt og 25\u201230% af præmature leverancer8,9. Virkningen af chorioamnionitis kan dog strække sig langt tidligere fødsel, da det har vist sig at have betydelige virkninger på fosteret og nyfødte10,11,12,13,14,15,16. Vigtigere, chorioamnionitis har vist sig at være forbundet med efterfølgende udvikling af NEC15,16. Mens det stadig er ufuldstændigt forstået, indebærer patogenese af NEC sandsynligvis en kombination af tarm immaturity, dysregulering af det umodne immunsystem, tarmbetændelse og bakteriel translokation, der kulminerer i en endelig fælles vej af tarmnekrose19. Men en mekanistisk sammenhæng mellem chorioamnionitis og efterfølgende udvikling af NEC er fortsat uklart20, og tidligere dyremodeller af chorioamnionitis har været utilstrækkelige til at undersøge dette forhold. For at løse dette hul i viden, vi har ændret den almindeligt anvendte LPS-induceret murin model af chorioamnionitis og præmature fødsel34,37,38,39,40 at give mulighed for neonatal fødsel og overlevelse. Dermed har vi skabt en model, der tilnærmer den inflammatoriske tilstand ses i chorioamnionitis42 for at studere virkningen af fostereksponering for moderens inflammation (FEMI) på efterfølgende tarm udvikling.
Med denne protokol har vi vist, at denne murinmodel af chorioamnionitis ved hjælp af LPS-induceret FEMI resulterer i både kort- og langvarig tarmskade samt afbrydelse af normal tarmudvikling, især nedregulering af både bæger- og Paneth-celler, som begge giver en første linje med medfødt immunitet mod tarmbetændelse. Tarmskaden og histologiske cellulære ændringer, der ses med denne model, indikerer, at det er en effektiv model til at efterligne den skade, der ses i NEC. Dette skyldes primært, at nedreguleringen af Paneth-celler og bægerceller begge har været impliceret i NEC's patogenese, og mønstrene for histologiske skader svarer til, hvad der ses i menneskelige tilfælde af NEC41,42,49. Derfor er denne LPS-inducerede FEMI-model af chorioamnionitis en ideel model til undersøgelse af den mekanistiske forbindelse mellem chorioamnionitis og senere tarmskade, specifikt udviklingen af NEC, samt potentielle virkninger af chorioamnionitis på det udviklende mikrobiom, hvilket ikke ville være muligt med eksisterende modeller, der udnytter levende bakterier.
In vivo, chorioamnionitis involverer ofte en stigende bakteriel infektion, der ofte resulterer i præmature brud på membraner og den kliniske fænotype af chorioamnionitis, og dyremodeller af chorioamnionitis findes som mere præcist afspejler denne patofysiologi25,28,30,32. Men fordi vores laboratorieundersøgelser tarmudvikling, herunder det udviklende mikrobiom, ville tilstedeværelsen af levende bakterier i en model af chorioamnionitis forvirre mikrobiomanalysen. Derfor eksisterende modeller af chorioamnionitis udnytte levende bakterier er upraktisk for at undersøge den mekanistiske sammenhæng mellem chorioamnionitis og senere udvikling af NEC. Derudover har LPS-inducerede modeller af chorioamnionitis allerede været effektive til modellering af postnatal hvid og grå stof hjerneskade36, hvilket viser, at denne metode er en effektiv måde at modellere sygelighed af prematurity, der er forbundet med eksponering for chorioamnionitis på fødselstidspunktet.
Det er også vigtigt at bemærke, at denne model er meget afhængig af den dosis LPS, der anvendes til at fremkalde FEMI. Det primære kritiske trin i denne protokol er induktion af FEMI i de gravide dæmninger med intraperitoneal injektion af LPS; Derfor har vi ikke overraskende konstateret, at den dosis LPS, der bruges til at fremkalde FEMI, er ekstremt vigtig i resultaterne af disse eksperimenter. Ved indledende forsøg blev der anvendt en dosis på 100 μg/kg LPS, da denne LPS-dosis ikke var forbundet med mødredødelighed og resulterede i ca. 50% neonatal overlevelse samt betydelig tarmskade hos afkom41,42.
LPS binder sig til Toll-lignende receptor 4 (TLR4) kompleks, hvilket resulterer i sammenlægning af intracellulære signalering proteiner, cytokin produktion, og indledningen af pro-inflammatoriske signalering50. Toll-lignende receptorer (TLR), herunder TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 og TLR9 er vigtige i induktionen af den inflammatoriske reaktion, der ses med en række patogener og mikroorganismer som vira, bakterier og svampe51. Interessant nok har opregulering af TLR3 også vist sig at korrelere med øget histologiske tarmskader og viral afgivelse i en neonatal murine rotavirus model; desuden har knockout af TLR3 forbedret disse virkninger52. Selv om modellen gør brug af TLR4-veje, er det derfor rimeligt at antage, at stimulering af andre TLR'er kan give lignende resultater.
Ved hjælp af denne metode har vi været i stand til at vise, at LPS-injektion i gravide dæmninger forårsager stigninger i moder-, placenta- og fosterinflammatoriske markører, mens vi skåner fostervandet, samt fremkalder direkte skade på moderkagen42. Interessant nok viste denne metode ingen ændring af resistens i livmoderarterierne. FEMI-modellen har også en betydelig indvirkning på afkommet, da vi har vist, at udsatte hvalpe har betydelig tarmskade42 gennem en IL-6 afhængig vej41 og kan påvirke vigtige forsvarsmekanismer i tarmen, såsom bægerceller og Paneth-celler41. Denne skade gør neonatal afkom i stigende grad modtagelige for efterfølgende LPS-induceret tarmskade ogbetændelse 41, hvilket kan forklare, hvorfor spædbørn, der udsættes for chorioamnionitis, har en øget modtagelighed for at udvikle NEC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet gennem National Institutes of Health (DK097335 & T32AI007260) og University of Iowa Stead Family Department of Pediatrics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| Alcian blue stain | Newcomer supply | 1003A | |
| C57Bl6/J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| Ethanol | Decon labs | 2701 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| Hematoxylin stain | Leica | 381562 | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Nikon Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 2CE-MQVJ-1 | |
| Periodic Acid | ACROS | H5106 | CAS# 10450-59-9 |
| RNAlater | Thermofisher | Am7021 | |
| Schiff's reagent | Sigma | S5133 | |
| Secor Imager 2400 | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| V-Plex Assay | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| Xylene | Sigma | 534056 |
References
- Myatt, L., Sun, K. Role of fetal membranes in signaling of fetal maturation and parturition. International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 545-553 (2010).
- Verbruggen, S. W., Oyen, M. L., Phillips, A. T., Nowlan, N. C. Function and failure of the fetal membrane: Modelling the mechanics of the chorion and amnion. PLoS One. 12 (3), 0171588 (2017).
- Higgins, R. D., et al. Evaluation and Management of Women and Newborns With a Maternal Diagnosis of Chorioamnionitis: Summary of a Workshop. Obstetrics & Gynecology. 127 (3), 426-436 (2016).
- Peng, C. C., Chang, J. H., Lin, H. Y., Cheng, P. J., Su, B. H. Intrauterine inflammation, infection, or both (Triple I): A new concept for chorioamnionitis. Pediatrics and Neonatology. 59 (3), 231-237 (2018).
- Romero, R., et al. Prevalence and clinical significance of sterile intra-amniotic inflammation in patients with preterm labor and intact membranes. American Journal of Reproductive Immunology. 72 (5), 458-474 (2014).
- Romero, R., et al. Sterile intra-amniotic inflammation in asymptomatic patients with a sonographic short cervix: prevalence and clinical significance. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal. , 1-17 (2014).
- Romero, R., et al. Sterile and microbial-associated intra-amniotic inflammation in preterm prelabor rupture of membranes. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 28 (12), 1394-1409 (2015).
- Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
- Erdemir, G., et al. Histological chorioamnionitis: effects on premature delivery and neonatal prognosis. Pediatrics and Neonatology. 54 (4), 267-274 (2013).
- Metcalfe, A., Lisonkova, S., Sabr, Y., Stritzke, A., Joseph, K. S. Neonatal respiratory morbidity following exposure to chorioamnionitis. BMC Pediatrics. 17 (1), 128 (2017).
- Anblagan, D., et al. Association between preterm brain injury and exposure to chorioamnionitis during fetal life. Scientific Reports. 6, 37932 (2016).
- Villamor-Martinez, E., et al. Corrigendum: Chorioamnionitis Is a Risk Factor for Intraventricular Hemorrhage in Preterm Infants: A Systematic Review and Meta-Analysis. Frontiers in Physiology. 10, 102 (2019).
- Villamor-Martinez, E., et al. Chorioamnionitis as a risk factor for retinopathy of prematurity: An updated systematic review and meta-analysis. PLoS One. 13 (10), 0205838 (2018).
- Randis, T. M., et al. Incidence of early-onset sepsis in infants born to women with clinical chorioamnionitis. Journal of Perinatal Medicine. 46 (8), 926-933 (2018).
- Rodrigo, F. G. M., Henriquez F, G. G., Aloy, F. J., Perez, G. A. A. Outcomes of very-low-birth-weight infants exposed to maternal clinical chorioamnionitis: a multicentre study. Neonatology. 106 (3), 229-234 (2014).
- Been, J. V., Lievense, S., Zimmermann, L. J., Kramer, B. W., Wolfs, T. G. Chorioamnionitis as a risk factor for necrotizing enterocolitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Pediatrics. 162 (2), 236-242 (2013).
- Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: modeling the innate immune response. American Journal of Pathology. 185 (1), 4-16 (2015).
- Fitzgibbons, S. C., et al. Mortality of necrotizing enterocolitis expressed by birth weight categories. Journal of Pediatric Surgery. 44 (6), 1075-1076 (2009).
- Vongbhavit, K., Underwood, M. A. Prevention of Necrotizing Enterocolitis Through Manipulation of the Intestinal Microbiota of the Premature Infant. Clinical Therapeutics. 38 (4), 716-732 (2016).
- Yee, W. H., et al. Incidence and timing of presentation of necrotizing enterocolitis in preterm infants. Pediatrics. 129 (2), 298-304 (2012).
- Gantert, M., et al. Chorioamnionitis: a multiorgan disease of the fetus. Journal of Perinatology. 30, 21-30 (2010).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Yamada, N., et al. Histological severity of fetal inflammation is useful in predicting neonatal outcome. Placenta. 36 (12), 1490-1493 (2015).
- Wolfe, K. B., et al. Modulation of lipopolysaccharide-induced chorioamnionitis in fetal sheep by maternal betamethasone. Reproductive Sciences. 20 (12), 1447-1454 (2013).
- Normann, E., et al. A novel mouse model of Ureaplasma-induced perinatal inflammation: effects on lung and brain injury. Pediatric Research. 65 (4), 430-436 (2009).
- Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis: unraveling causes of adverse neurological outcomes. Reproductive Sciences. 18 (9), 900-907 (2011).
- Dell'Ovo, V., et al. An animal model for chorioamnionitis at term. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 387 (2015).
- Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. Journal of Infectious Diseases. 210 (2), 265-273 (2014).
- Breen, K., et al. TLR-4-dependent and -independent mechanisms of fetal brain injury in the setting of preterm birth. Reproductive Sciences. 19 (8), 839-850 (2012).
- Burd, I., Balakrishnan, B., Kannan, S. Models of fetal brain injury, intrauterine inflammation, and preterm birth. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (4), 287-294 (2012).
- Agrawal, V., et al. Role of Notch signaling during lipopolysaccharide-induced preterm labor. Journal of Leukocyte Biology. 100 (2), 261-274 (2016).
- Filipovich, Y., Klein, J., Zhou, Y., Hirsch, E. Maternal and fetal roles in bacterially induced preterm labor in the mouse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 214 (3), 381-389 (2016).
- Alexander, C., Rietschel, E. T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. Journal of Endotoxin Research. 7 (3), 167-202 (2001).
- McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: suggested assessment and reporting guidelines. Biology of Reproduction. 99 (5), 922-937 (2018).
- Rueda, C. M., et al. Lipopolysaccharide-Induced Chorioamnionitis Promotes IL-1-Dependent Inflammatory FOXP3+ CD4+ T Cells in the Fetal Rhesus Macaque. Journal of Immunology. 196 (9), 3706-3715 (2016).
- Gavilanes, A. W., et al. Chorioamnionitis induced by intraamniotic lipopolysaccharide resulted in an interval-dependent increase in central nervous system injury in the fetal sheep. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 200 (4), 431-438 (2009).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 881-897 (2010).
- Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 10 (11), 643-660 (2014).
- Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain, Behavior, and Immunity. 31, 54-68 (2013).
- Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
- Elgin, T. G., et al. Fetal exposure to maternal inflammation interrupts murine intestinal development and increases susceptibility to neonatal intestinal injury. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Fricke, E. M., et al. Lipopolysaccharide-induced maternal inflammation induces direct placental injury without alteration in placental blood flow and induces a secondary fetal intestinal injury that persists into adulthood. American Journal of Reproductive Immunology. 79 (5), 12816 (2018).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2627-2635 (2016).
- Brown, K. S., et al. Tumor necrosis factor induces developmental stage-dependent structural changes in the immature small intestine. Mediators of Inflammation. 2014, 852378 (2014).
- McElroy, S. J., et al. The ErbB4 ligand neuregulin-4 protects against experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Pathology. 184 (10), 2768-2778 (2014).
- McElroy, S. J., et al. Tumor necrosis factor receptor 1-dependent depletion of mucus in immature small intestine: a potential role in neonatal necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (4), 656 (2011).
- Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. , (2019).
- McElroy, S. J., Weitkamp, J. H. Innate Immunity in the Small Intestine of the Preterm Infant. NeoReviews. 12 (9), 517-526 (2011).
- McElroy, S. J., Underwood, M. A., Sherman, M. P. Paneth cells and necrotizing enterocolitis: a novel hypothesis for disease pathogenesis. Neonatology. 103 (1), 10-20 (2013).
- Park, B. S., Lee, J. O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes. Experimental & Molecular Medicine. 45, 66 (2013).
- Lester, S. N., Li, K. Toll-like receptors in antiviral innate immunity. Journal of Molecular Biology. 426 (6), 1246-1264 (2014).
- Pott, J., et al. Age-dependent TLR3 expression of the intestinal epithelium contributes to rotavirus susceptibility. PLOS Pathogens. 8 (5), 1002670 (2012).
