Summary
Vi utvecklade en modell av chorioamnionitis för att simulera fetala exponering för moderns inflammation (FEMI) utan komplikationer av levande organismer för att undersöka effekterna av FEMI på utvecklingen av avkommans tarmkanalen. Detta möjliggör studier av mekanistiska orsaker till utveckling av tarmskada efter chorioamnionitis.
Abstract
Chorioamnionitis är en vanlig fällning av prematur födsel och är associerad med många av sjukligheterna av prematurity, inklusive necrotizing enterocolitis (NEC). En mekanistisk koppling mellan dessa två villkor återstår dock att upptäcka. Vi har antagit en murin modell av chorioamnionitis omfattar lipopolysackarid (LPS)-inducerad fetala exponering för moderns inflammation (FEMI). Denna modell av FEMI inducerar en steril moderns, placenta och fetala inflammatoriska kaskad, som också finns i många fall av klinisk chorioamnionitis. Även om modeller finns som använder levande bakterier och mer exakt efterliknar patofysiologin hos en stigande infektion som resulterar i chorioamnionitis, kan dessa metoder orsaka indirekta effekter på utvecklingen av det omogna tarmkanalen och det tillhörande utvecklande mikrobiomet. Med hjälp av detta protokoll har vi visat att LPS-inducerad FEMI resulterar i en dosberoende ökning av graviditetsförlust och prematur födsel, samt störningar av normal tarmutveckling hos avkommor. Vidare har vi visat att FEMI avsevärt ökar tarmskada och serumcytokiner hos avkommor, samtidigt som bägare och Paneth-celler minskar, som båda ger en första rad av medfödd immunitet mot tarminflammation. Även om en liknande modell av LPS-inducerad FEMI har använts för att modellera associeringen mellan chorioamnionitis och efterföljande avvikelser i centrala nervsystemet, till vår kunskap, är detta protokoll den första att försöka klargöra en mekanistisk länk mellan chorioamnionitis och senare störningar i tarmutveckling som en potentiell länk mellan chorioamnionitis och NEC.
Introduction
De chorionic membranen spelar en integrerad roll i däggdjur graviditet. De inkluderar chorion och amnion, som tjänar flera funktioner. De omger och skyddar fostret, underlättar parakrina signalering mellan moderns och fostretsfack 1, och skapar lokala återkopplingsöglor i de korrioniska membranen, som kan vara involverade i att initiera förlossning1. Nuvarande förståelse av membranen indikerar att amnion ger strukturell barriärfunktion, och chorion ger en immunologisk buffert främst för att skydda det utvecklande fostret från moderns immunsystem2. Inflammation i dessa membran är känd som chorioamnionitis. Historiskt gjordes diagnos av kliniska chorioamnionitis efter förekomsten av moderns feber plus en eller flera fetala eller moderns kliniska resultat3,4. Men även om denna definition är kliniskt användbar, dess brist på precision har gjort chorioamnionitis forskning utmanande. I ett försök att klargöra diagnosen definierade eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development chorioamnionitis som intrauterin inflammation eller infektion, eller båda (trippel I)3. Detta klargörande är viktigt eftersom medan mikrobiell inducerad infektion är en viktig orsak till livmoder/fosterhinneinflammation, förekommer det mindre vanligt än steril livmoder/fosterhinnan inflammation5,6,7. Sammantaget är chorioamnionitis fortfarande ett betydande folkhälsoproblem, som det ses i 2\u20124% av termleveranserna och 25\u201230% av prematurleveranserna8,9.
Chorioamnionitis kan ha betydande effekter på fostret och hos. Det har dokumenterats väl i litteraturen att chorioamnionitis är associerad med ökad risk för många av sjukligheterna av mödraskap, inklusive bronchopulmonary dysplasi10,cerebral vit frågaskada 11,intraventricular blödning12,retinopati av prematuritet13, och både misstänkt och bekräftade tidigt insjukna neonatal sepsis14,15. Eftersom vi är intresserade av skade- och reparationsmekanismer i det omogna tarmkanalen är det viktigt att notera att chorioamnionitis också är förknippad med senare utveckling av nekrotiserande enterokolit (NEC)15,16. NEC är en förödande gastrointestinal sjukdom hos prematura spädbarn som resulterar i ett dysreglerat värdsvar på inflammation och efterföljande tarmnekros17. Varje år drabbar NEC över 4000 spädbarn i USA, och upp till en tredjedel av dessa spädbarn dör av sjukdomen18. Patogenesen vid NEC innebär sannolikt en kombination av tarmomognad, dysregulering av det omogna immunsystemet, tarminflammation och bakteriellflyttning 19, vilket kulminerar i en slutlig gemensam väg för tarmnekros. Viktigt är att uppkomsten av NEC ofta inträffar veckor efter födseln och potentiell exponering för chorioamnionitis, vilket gör den mekanistiska länken mellan chorioamnionitis och efterföljande utveckling av NEC oklart20. En potentiell mekanism genom vilken chorioamnionitis kan bidra till pathophysiology av NEC är genom uppreglering av moderns immunsystem, därefter producerar en stark fetala inflammatoriska svar som kan störa normala fetala utvecklingsmönster21,22,23.
Flera däggdjursmodeller av chorioamnionitis finns hos gnagare och får24,25,26,27,28,29,30,31,32. Det finns dock få data om utvecklingen av tarmkanalen efter den första nyfödda perioden efter chorioamnionitis-inducerad fetala exponering för moderns inflammation (FEMI). För att utforska förhållandet mellan FEMI och efterföljande utveckling av skada i det omogna tarmkanalen har vi anpassat lipopolysackarid (LPS)-inducerad FEMI-modell. Lipopolysackarider är en viktig komponent i den extracellulära ytan på gramnegativa bakterier och är ett potent stimulerande medel för det medfödda immunsystemet hos flera eukaryota arter, inklusive människor33. Moderns LPS injektion resulterar i en steril inflammatorisk kaskad utan förvirrande effekter av levande bakterier, och det är en väletablerad modell för induktion av prematur födsel34, liksom en modell av akut chorioamnionitis och fetala inflammatoriska svar syndrom (FIRS), som är den allvarligaste formen av chorioamnionitis24,35. Det har också visat sig inducera både cerebral vit och grå materia skada i en får modell36 och en murin modell37,38,39,40. Men till vår kunskap är vi de första att använda denna modell av chorioamnionitis och FEMI för att undersöka dess effekter på utvecklingen av mag-tarmkanalen tidigare födseln, liksom att undersöka en möjlig mekanistisk länk mellan chorioamnionitis och senare utveckling av NEC41,42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #8041401). Alla djur inrymdes i ett association för bedömning och ackreditering av laboratoriedjurvård (AALAC) godkänt vivarium vid University of Iowa. Alla möss var vilda typ stam C57Bl/6J.
1. Etablering av FEMI hos dräktiga möss
- LPS-förberedelse
- Använd LPS som härrör från Escherichia coli O55:B5 (stamkoncentration 2 mg/ml).
- Späd LPS-stamkoncentration 1:100 med steril saltlösning för en arbetskoncentration på 20 μg/ml.
- Moderns LPS injektion
- Injicera gravida dammar på graviditetsdag e15. Denna tidspunkt är ungefär 75% genom murin graviditet, vilket gör denna modell utvecklingsmässigt liknar den tidiga tredje trimestaren av mänskliga graviditeter, vilket är när majoriteten av prematur födslar på grund av att chorioamnionitis uppstår.
- Väg gravida möss omedelbart före injektionen för att bestämma lämplig LPS-dosering.
- Beräkna dosen av arbetskoncentrationen med hjälp av följande formel: 5 μL x gram kroppsvikt (gbw), för en total dos LPS på 100 μg/kg. För kontrolldjur, använd en motsvarande volym normal saltlösning för injektion.
- Vortex LPS-lösning tre gånger i 15 sekunder hög före varje injektion.
- Dra upp LPS-volymen i en 1 ml spruta.
- Håll fast gravid mus med scruffing teknik. Håll i dorsala liggande läge och utför injektionen.
- Sätt in en 30 gauge 8 mm nål som fasar upp över den högra nedre kvadranten i buken (för att undvika blås- och bukkärl) i 30\u201240° vinkel. Sätt in nållängden ca 1/4 till 1/2.
- Dra tillbaka sprutkolven för att säkerställa undertryck innan du injicerar. Fortsätt med injektionen om det finns ett undertryck.
- Efter injektionen, övervaka möss i cirka 30 min och återvänd sedan till burar under resten av graviditeten.
2. Leverans och vård av avkommor och tarmskörd
- Leverera valpar normalt via vaginal förlossning på e20.
OBS: Denna modell har en förväntad dosberoende fosterförlust som kan ses i figur 1 och diskuteras i resultaten nedan. - Låt valpar stanna kvar hos mödrar och få ad libitum-flöden.
- På skördedagen, vanligtvis postnatal dag 14 (P14), avliva valpar via livmoderhalsförskjutning i enlighet med institutionella djurvårds- och användningskommittéprotokoll.
- Använd sax och tång, gör ett vertikalt snitt ner i bukens mittlinje, genom huden och bukhinnan, under hela bukens längd. Punktskatt tunntarmen från magen till cecum med sax och ta bort tarmen med tång.
- Isolera och håll tunntarmens distala 1/3 (sektionsrepresentant för humant tarmben), kassera den proximala tunntarmen, cecum och tjocktarmen.
- Dela ileumdelen i hälften med sax.
- Placera den proximala halvan i en RNA-stabiliseringslösning för senare RNA-kvantifiering.
- Placera den distala halvan i 10% neutral buffrad formalin för glidberedning.
3. Poäng för tarmskada
- Dela upp paraffin inbäddad vävnad i 5 μm tjocka skivor och montera på glasrutschbanor.
OBS: Vi skickar proverna till en histologikärna för paraffininbäddning, sektionering och montering på diabilder. - Avdefiniera bilder enligt standardprocedurer.
- Fläcksektioner med hematoxylin och eosin enligt standardprocedurer.
- Poängavsnitt på en 3-gradsskala för tarmskada som tidigarebeskrivits 42,43.
- Med hjälp av ljusmikroskopi, bedöma generaliserad tarmskada av två separata blindade utredare på en 3-punktsskala som utvärderar villus integritet och separation från källarmembranet43 (Kompletterande figur 1). Tarmskada bedöms bäst vid 20x förstoring och numerisk bländare 0,50.
- Tilldela en poäng på 0 för att beskriva normal slemhinna.
- Tilldela en poäng på 1 beskriva mild skada som omfattar utvecklingen av subepithelial Gruenhagens utrymme, vacuolization eller subepithelial lyft begränsas till lamina propria eller tips av villi.
- Tilldela en poäng på 2 för att beskriva allvarlig skada, anges genom epitelial lyft och vacuolization större än hälften av villi, villi snedvridning eller mucosal ulceration och sönderfall av lamina propria.
4. Kvantifiering av paneth- och bägareceller
- Efter deparaffinization, fläck bilder av vävnad avsnitt från steg 2,8 med alcian blå /periodisk syra Schiff fläck för att beteckna både bägare och Paneth celler som tidigarebeskrivits 44,45 enligt följande steg.
OBS: Medan Alcian Blue/Periodic Acid Schiff fläcken inte är specifik för antingen Paneth eller bägare celler, enligt vår erfarenhet, blinda erfarna utredare har motsvarande cellulär kvantifiering med denna fläck jämfört med cellulära riktade antikroppar, med betydligt mindre bakgrund färgning46. - Deparaffinisera, fläcka och dehydrera bilder enligt följande.
- Dränk glider i xylen i 10 minuter två gånger.
VARNING: Xylen ska användas i en rökhuv. - Skölj med 100% EtOH.
- Dränk ned diabilder i 100 % EtOH i 3 min, sedan i 90% EtOH i 3 min, följt av 70% EtOH i 3 min och slutligen nedsänka bilder i 50% EtOH i 3 min.
- Tvätta under rinnande kranvatten i 5 minuter.
VARNING: Peka bort sektionen från det rinnande vattnet för att förhindra förlust av vävnadsprov. - Filtrera Alcian blå fläcklösning med ett vanligt kaffefilter.
- Fläck glider i alciansk blå fläck i 15 min och tvätta sedan under rinnande kranvatten i 2 min.
- Späd 1 mg periodisk syra i 200 ml dubbeldestillerat vatten. Dränk glider i denna lösning i 5 minuter. Tvätta sedan under rinnande kranvatten i 1 min.
- Fläck med Schiffs reagens i 10 minuter. Tvätta under rinnande kranvatten i 5 minuter.
- Färga rutschkanorna med hematoxylin i 1 min och tvätta sedan under rinnande kranvatten i 2 min.
- Dränk dem i sur alkohol (1 ml saltsyra blandat i 99 ml 70% EtOH) i 1 min.
- Dränk i Scotts kranvatten (0,1% koncentration av NaHCO3 i kranvatten) i 1 min och tvätta sedan under rinnande kranvatten i 1 min.
- Torka av rutschkanorna.
- Doppa varje bild 10 gånger i 70% EtOH, doppa sedan 10 gånger i 90% EtOH och 10 gånger i 100% EtOH.
- Dränk ned diabilder i 100% EtOH i 10 min, följt av nedsänkning två gånger i färsk xylen i 3 min vardera.
- Placera en droppe monteringsmedier på provet och placera ett täckglas över det.
- Dränk glider i xylen i 10 minuter två gånger.
- Räknar bägare
- Använd lätta mikroskopi och räkna bägareceller (kompletterandefigur 2). För varje bit av tarmvävnad, räkna antalet bägare celler och 500 epitelial celler och express bägare cellförhållande som ett förhållande per 100 epitelceller. Bägare celler räknas bäst vid 20x förstoring och numerisk bländare 0,5.
- Paneth cellräkning
- Använd ljusmikroskopi, räkna Paneth-celler (kompletterande figur 2). För varje bit av tarmvävnad, uttryck som ett förhållande mellan Paneth-celler per tarmkryp. Räkna 100 intestinala krypter per varje bit tarmvävnad. Paneth celler räknas bäst på 20x-60x förstoring och numerisk bländare 0,50-1,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exponering för FEMI på embryonal dag 15 leder till en dosberoende förlust av graviditet och en dosberoende frekvens av prematurt arbete (figur 1)42. För experimenten valde vi att använda en LPS-dos på 100 μg/kg för att minimera graviditetsförlust och prematuritet (50% förlust mellan både prematuritet och intrauterin fosteravgång) samtidigt som fostret utsattes för en betydande inflammatorisk förolämpning.
Med hjälp av detta tillvägagångssätt undersökte vi nästa effekterna av FEMI på efterföljande skada av avkomman. Med hjälp av en 3-punkts histologic skala för att mäta generaliserade intestinala skador, fann vi betydande skada vid födseln (P0) och vid vuxen ålder (P56 eller 8 veckor av livet) (Figur 2). Det är viktigt att notera att denna skada inträffade i avsaknad av ytterligare stimuli till andra djur än FEMI, vilket tyder på att FEMI ensam stör den normala homeostasen i det nyfödda tarmkanalen murin. Eftersom musen är född med en relativt omogen tarm som fortsätter att utvecklas under de första 4 veckorna av livet47,48, är detta relevant för prematura spädbarn som också har omogna tarmområden.
För att ytterligare förstå effekten av FEMI på både den normala utvecklingen av intestinala epitel och på försvarsmekanismerna i det omogna tarmkanalen kvantifierade vi antalet mucinproducerande bägare celler och antimikrobiell peptid-producerande Paneth celler i den distala tredjedelen av det lilla tarmkanalen som liknar det mänskliga tarmhinnan. Vi fann att FEMI störde den normala sammansättningen av intestinala epitel genom att inducera förlust av både bägare celler och Paneth celler jämfört med djur utan FEMI (Figur 3).
För att undersöka effekterna av FEMI på neonatal inflammatoriska svar, med ELISA med elektrokemistinscens, kvantifierade vi en mängd olika seruminflammatoriska markörer, som inkluderade IL-1β, IL-10, KC-GRO (murin motsvarigheten till IL-8) och IL-6, från serum av valpar med och utan FEMI (Figur 4). Vi fann att FEMI avsevärt ökade den inflammatoriska kaskaden för alla cytokiner vid P0. Den inflammatoriska kaskaden i senare åldrar (P7\u2012P56) skilde sig åt beroende på tidspunkt och cytokin. Mest intressant, för IL-6, fanns det liknande nivåer på P7\u2012P28 i FEMI och sham grupper, men trots ingen sekundär intervention, det fanns betydligt högre nivåer i FEMI gruppen på P56. Detta är särskilt viktigt eftersom vi har visat att IL-6 är en kritisk cytokin för utvecklingen av postnatala intestinala skada i FEMI-modellen.
Figur 1: Effekten av FEMI- dosen på graviditetsutfallen. Överlevnad av graviditetsskräp är dosberoende med högre doser som orsakar högre frekvens av graviditetsförlust (A) och högre frekvens av för tidig födsel (B). Figuren är anpassad med tillstånd från Fricke et al42. FEMI med en LPS-dos på 100 μg/kg skapar en överlevnad på 50 % för ungar med en veckas livslängd. Varje datapunkt är representativ för en n > 8 graviditeter och minst tre individuella experiment. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Femi:s effekt på distala små tarmskademönster över tid. Tarmprover skördades vid födseln, 1 veckas liv, 2 veckors liv och 8 veckors liv från möss som exponerades för FEMI (100 μg/kg LPS) eller sham control. Prover gjordes med hjälp av en 3-punkts skadeskala av blinda utredare42,43. FEMI ensam med ingen ytterligare förolämpning inducerad betydande mängd skada vid födseln, 1 vecka av livet och vid 8 veckors liv. Figuren har anpassats med tillstånd från Fricke et al.42. Varje datapunkt är representativ för en n > 10 valpar och minst tre enskilda experiment från minst 3 gravida dammar. Mann-Whitney icke-parametriska T-testning användes för att jämföra intestinala skada poäng vid varje tidpunkt. Asterisken indikerar p < 0,05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: FEMI inducerar förändringar av normala bägare och panethcellkvantiteter i tunntarmen under utvecklingen. Tarmprover skördades vid födseln, 1, 2, 4 och 8 veckors liv från möss som exponerades för FEMI (100 μg/kg LPS) eller sham control. Prover var färgade med alcian blå/periodisk syra Schiff fläck för att upptäcka både bägare och Paneth celler och dessa kvantifierades av en blinded utredare. Både bägare celler och Paneth celler från djur med FEMI visade antingen en trend eller en betydande minskning jämfört med falska kontroller i alla åldrar. Figur anpassad med tillstånd från Elgin et al.41. Varje datapunkt är representativ för en n > 10 valpar och minst tre enskilda experiment. Felstaplar representerar standardfel för medelvärdet. Student T-testning användes för att jämföra mängder bägare och Paneth celler vid varje tidpunkt. Asterisken indikerar p < 0,05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: FEMI inducerar en global neonatal inflammatorisk ökning för alla cytokiner omedelbart efter födseln vid P0, med en sen ökning av IL-6 vid P56. Serum cytokiner kvantifierades vid P0, P7, P14 och P28 med ELISA med elektrokemiskauminescens enligt tillverkarens instruktioner, och plattor lästes vid 620 nm. Cytokinvärden representeras här i en radarplott, och alla cytokiner plottas som procent av maximalt värde. Det fanns signifikanta ökningar av alla cytokiner (IL-1β, IL-10, KC-GRO och IL-6) vid P0 i FEMI-gruppen jämfört med kontrollgruppen (alla p < 0,05). Det fanns också en återuppstånden ökning av IL-6 nivåer vid P56 hos valparna med FEMI jämfört med ingen FEMI (p < 0,05 genom icke-parametriska Kruskal-Wallis testning), som var den enda cytokin som var betydligt förhöjd i FEMI-gruppen jämfört med kontroll vid denna sena tidpunkt. Figur anpassad med tillstånd från Elgin et al.41. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Poängsättning av tarmskador i H&E-färgad ilealvävnad. Skadepoäng bestäms av en trepunkts tarmskada poängskala (0=normal, 1=mild skada, 2=allvarlig skada) baserat på graden av villi vacuolization, mucosal ulceration, lamina propria skador och förekomsten av blödning inom villi som tidigarebeskrivits 43. Figur anpassad med tillstånd från Elgin et al.41. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 2: Representativt utseende av Alcian Blue/PAS färgning av bägare och Paneth celler. Alcian Blue/PAS färgning av tarmvävnader möjliggör tydlig visualisering av bägare celler, närvarande i intestinala villi (övre panelen markerad med vita pilar, bild tagen vid 20x förstoring) och Paneth celler, närvarande i krypter av Lieberkuhn, ligger under intestinala villi i lamina propria (bottenpanelen markerad med gula pilar, bild tagen vid 60x förstoring). Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chorioamnionitis påverkar 2\u20124% av löptiden och 25\u201230% av prematur leveranser8,9. Effekten av chorioamnionitis kan dock förlänga lång efter födseln eftersom det har visat sig ha betydande effekter på fostret och nyfödda10,11,12,13,14,15,16. Viktigt, chorioamnionitis har visat sig vara associerad med efterföljande utveckling av NEC15,16. Medan det fortfarande är ofullständigt förstått, innebär patogenesen vid NEC sannolikt en kombination av intestinal omognad, dysregulering av det omogna immunsystemet, tarminflammation och bakteriell flyttning, vilket kulminerar i en slutlig gemensam väg av intestinal nekros19. En mekanistisk koppling mellan chorioamnionitis och efterföljande utveckling av NEC är dock fortfarandeoklart 20, och tidigare djurmodeller av chorioamnionitis har varit otillräckliga för att undersöka detta förhållande. För att ta itu med denna kunskapslucka modifierade vi den vanliga LPS-inducerade murinmodellen av chorioamnionitis och prematurfödsel 34,37,38,39,40 för att möjliggöra neonatal födsel och överlevnad. Genom att göra det har vi skapat en modell som approximerar det inflammatoriska tillståndet som ses i chorioamnionitis42 för att studera effekten av fetala exponering för moderns inflammation (FEMI) på efterföljande tarmutveckling.
Med detta protokoll har vi visat att denna murinmodell av chorioamnionitis, med hjälp av LPS-inducerad FEMI, resulterar i både kort och långsiktig tarmskada samt avbrott i normal tarmutveckling, särskilt nedreglering av både bägare och Paneth celler, som båda ger en första rad av medfödd immunitet mot intestinala inflammation. Tarmskadan och histologic cellulära förändringar som ses med denna modell indikerar att det är en effektiv modell att efterlikna den skada som ses i NEC. Detta beror främst på att nedregleringen av Paneth-celler och bägare celler båda har varit inblandade i patogenesen vid NEC, och mönstren för histologic skada liknar vad som ses i mänskliga fall av NEC41,42,49. Därför är denna LPS-inducerad FEMI-modell av chorioamnionitis en idealisk modell för att undersöka den mekanistiska länken mellan chorioamnionitis och senare tarmskada, särskilt utvecklingen av NEC, liksom potentiella effekter av chorioamnionitis på det utvecklande mikrobiomet, vilket inte skulle vara möjligt med befintliga modeller som använder levande bakterier.
In vivo, chorioamnionitis innebär ofta en stigande bakteriell infektion som ofta resulterar i prematur bristning av membran och den kliniska fenotypen av chorioamnionitis, och djurmodeller av chorioamnionitis finns som mer exakt återspeglar denna patofysiologi25,28,30,32. Men eftersom vårt laboratorium studerar tarmutveckling, inklusive det utvecklande mikrobiomet, skulle närvaron av levande bakterier i en modell av chorioamnionitis förvirra mikrobiomanalysen. Därför är befintliga modeller av chorioamnionitis som använder levande bakterier opraktiska för att undersöka den mekanistiska länken mellan chorioamnionitis och senare utveckling av NEC. Dessutom har LPS-inducerade modeller av chorioamnionitis redan varit effektiva vid modellering postnatala vita och grå materia hjärnskada36, visar att denna metod är ett effektivt sätt att modellera sjukligheter av prematuritet som är förknippade med exponering för chorioamnionitis vid tidpunkten för födseln.
Det är också viktigt att notera att denna modell är mycket beroende av den dos av LPS som används för att inducera FEMI. Det primära kritiska steget i detta protokoll är induktion av FEMI i de gravida dammarna med intraperitoneal injektion av LPS; Därför, inte överraskande, har vi funnit att dosen av LPS som används för att inducera FEMI är extremt viktig i resultaten av dessa experiment. Med inledande experiment användes en dos på 100 μg/kg LPS, eftersom denna LPS-dos inte var förknippad med mödradödlighet och resulterade i cirka 50% neonatal överlevnad samt betydande tarmskada hosavkomma 41,42.
LPS binder till det Toll-liknande receptor 4 (TLR4) komplexet, vilket resulterar i aggregering av intracellulära signalproteiner, cytokinproduktion och initiering av proinflammatorisk signalering50. Toll-liknande receptorer (TLR) inklusive TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 och TLR9 är viktiga vid induktion av det inflammatoriska svaret som ses med en mängd olika patogener och mikroorganismer som virus, bakterier ochsvampar 51. Intressant nog har uppreglering av TLR3 också visat sig korrelera med ökad histologic intestinala skador och viral shedding i en neonatal murine rotavirus modell; dessutom, knockout av TLR3 förbättrat dessa effekter52. Även om modellen använder sig av TLR4-vägar är det därför rimligt att anta att stimulering av andra TLR kan ge liknande resultat.
Med hjälp av denna metodik har vi kunnat visa att LPS injektion i gravida dammar orsakar ökningar i moderns, moderkakan och fetala inflammatoriska markörer samtidigt som man sparar fostervatten, samt inducerar direkta skador på moderkakan42. Intressant nog visade denna metod ingen förändring av resistens i livmoderartärerna. FEMI-modellen har också en betydande inverkan på avkomman eftersom vi har visat att exponerade valpar har betydandetarmskada 42 genom en IL-6-beroendeväg 41 och kan påverka viktiga försvarsmekanismer i tarmarna som bägare och Paneth-celler41. Denna skada gör neonatal avkomma alltmer mottagliga för efterföljande LPS-inducerad intestinala skada och inflammation41 som kan förklara varför spädbarn utsätts för chorioamnionitis har en ökad mottaglighet att utveckla NEC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis genom National Institutes of Health (DK097335 & T32AI007260) och University of Iowa Stead Family Department of Pediatrics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| Alcian blue stain | Newcomer supply | 1003A | |
| C57Bl6/J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| Ethanol | Decon labs | 2701 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| Hematoxylin stain | Leica | 381562 | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Nikon Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 2CE-MQVJ-1 | |
| Periodic Acid | ACROS | H5106 | CAS# 10450-59-9 |
| RNAlater | Thermofisher | Am7021 | |
| Schiff's reagent | Sigma | S5133 | |
| Secor Imager 2400 | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| V-Plex Assay | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| Xylene | Sigma | 534056 |
References
- Myatt, L., Sun, K. Role of fetal membranes in signaling of fetal maturation and parturition. International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 545-553 (2010).
- Verbruggen, S. W., Oyen, M. L., Phillips, A. T., Nowlan, N. C. Function and failure of the fetal membrane: Modelling the mechanics of the chorion and amnion. PLoS One. 12 (3), 0171588 (2017).
- Higgins, R. D., et al. Evaluation and Management of Women and Newborns With a Maternal Diagnosis of Chorioamnionitis: Summary of a Workshop. Obstetrics & Gynecology. 127 (3), 426-436 (2016).
- Peng, C. C., Chang, J. H., Lin, H. Y., Cheng, P. J., Su, B. H. Intrauterine inflammation, infection, or both (Triple I): A new concept for chorioamnionitis. Pediatrics and Neonatology. 59 (3), 231-237 (2018).
- Romero, R., et al. Prevalence and clinical significance of sterile intra-amniotic inflammation in patients with preterm labor and intact membranes. American Journal of Reproductive Immunology. 72 (5), 458-474 (2014).
- Romero, R., et al. Sterile intra-amniotic inflammation in asymptomatic patients with a sonographic short cervix: prevalence and clinical significance. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal. , 1-17 (2014).
- Romero, R., et al. Sterile and microbial-associated intra-amniotic inflammation in preterm prelabor rupture of membranes. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 28 (12), 1394-1409 (2015).
- Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
- Erdemir, G., et al. Histological chorioamnionitis: effects on premature delivery and neonatal prognosis. Pediatrics and Neonatology. 54 (4), 267-274 (2013).
- Metcalfe, A., Lisonkova, S., Sabr, Y., Stritzke, A., Joseph, K. S. Neonatal respiratory morbidity following exposure to chorioamnionitis. BMC Pediatrics. 17 (1), 128 (2017).
- Anblagan, D., et al. Association between preterm brain injury and exposure to chorioamnionitis during fetal life. Scientific Reports. 6, 37932 (2016).
- Villamor-Martinez, E., et al. Corrigendum: Chorioamnionitis Is a Risk Factor for Intraventricular Hemorrhage in Preterm Infants: A Systematic Review and Meta-Analysis. Frontiers in Physiology. 10, 102 (2019).
- Villamor-Martinez, E., et al. Chorioamnionitis as a risk factor for retinopathy of prematurity: An updated systematic review and meta-analysis. PLoS One. 13 (10), 0205838 (2018).
- Randis, T. M., et al. Incidence of early-onset sepsis in infants born to women with clinical chorioamnionitis. Journal of Perinatal Medicine. 46 (8), 926-933 (2018).
- Rodrigo, F. G. M., Henriquez F, G. G., Aloy, F. J., Perez, G. A. A. Outcomes of very-low-birth-weight infants exposed to maternal clinical chorioamnionitis: a multicentre study. Neonatology. 106 (3), 229-234 (2014).
- Been, J. V., Lievense, S., Zimmermann, L. J., Kramer, B. W., Wolfs, T. G. Chorioamnionitis as a risk factor for necrotizing enterocolitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Pediatrics. 162 (2), 236-242 (2013).
- Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: modeling the innate immune response. American Journal of Pathology. 185 (1), 4-16 (2015).
- Fitzgibbons, S. C., et al. Mortality of necrotizing enterocolitis expressed by birth weight categories. Journal of Pediatric Surgery. 44 (6), 1075-1076 (2009).
- Vongbhavit, K., Underwood, M. A. Prevention of Necrotizing Enterocolitis Through Manipulation of the Intestinal Microbiota of the Premature Infant. Clinical Therapeutics. 38 (4), 716-732 (2016).
- Yee, W. H., et al. Incidence and timing of presentation of necrotizing enterocolitis in preterm infants. Pediatrics. 129 (2), 298-304 (2012).
- Gantert, M., et al. Chorioamnionitis: a multiorgan disease of the fetus. Journal of Perinatology. 30, 21-30 (2010).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Yamada, N., et al. Histological severity of fetal inflammation is useful in predicting neonatal outcome. Placenta. 36 (12), 1490-1493 (2015).
- Wolfe, K. B., et al. Modulation of lipopolysaccharide-induced chorioamnionitis in fetal sheep by maternal betamethasone. Reproductive Sciences. 20 (12), 1447-1454 (2013).
- Normann, E., et al. A novel mouse model of Ureaplasma-induced perinatal inflammation: effects on lung and brain injury. Pediatric Research. 65 (4), 430-436 (2009).
- Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis: unraveling causes of adverse neurological outcomes. Reproductive Sciences. 18 (9), 900-907 (2011).
- Dell'Ovo, V., et al. An animal model for chorioamnionitis at term. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 387 (2015).
- Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. Journal of Infectious Diseases. 210 (2), 265-273 (2014).
- Breen, K., et al. TLR-4-dependent and -independent mechanisms of fetal brain injury in the setting of preterm birth. Reproductive Sciences. 19 (8), 839-850 (2012).
- Burd, I., Balakrishnan, B., Kannan, S. Models of fetal brain injury, intrauterine inflammation, and preterm birth. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (4), 287-294 (2012).
- Agrawal, V., et al. Role of Notch signaling during lipopolysaccharide-induced preterm labor. Journal of Leukocyte Biology. 100 (2), 261-274 (2016).
- Filipovich, Y., Klein, J., Zhou, Y., Hirsch, E. Maternal and fetal roles in bacterially induced preterm labor in the mouse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 214 (3), 381-389 (2016).
- Alexander, C., Rietschel, E. T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. Journal of Endotoxin Research. 7 (3), 167-202 (2001).
- McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: suggested assessment and reporting guidelines. Biology of Reproduction. 99 (5), 922-937 (2018).
- Rueda, C. M., et al. Lipopolysaccharide-Induced Chorioamnionitis Promotes IL-1-Dependent Inflammatory FOXP3+ CD4+ T Cells in the Fetal Rhesus Macaque. Journal of Immunology. 196 (9), 3706-3715 (2016).
- Gavilanes, A. W., et al. Chorioamnionitis induced by intraamniotic lipopolysaccharide resulted in an interval-dependent increase in central nervous system injury in the fetal sheep. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 200 (4), 431-438 (2009).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 881-897 (2010).
- Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 10 (11), 643-660 (2014).
- Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain, Behavior, and Immunity. 31, 54-68 (2013).
- Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
- Elgin, T. G., et al. Fetal exposure to maternal inflammation interrupts murine intestinal development and increases susceptibility to neonatal intestinal injury. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Fricke, E. M., et al. Lipopolysaccharide-induced maternal inflammation induces direct placental injury without alteration in placental blood flow and induces a secondary fetal intestinal injury that persists into adulthood. American Journal of Reproductive Immunology. 79 (5), 12816 (2018).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2627-2635 (2016).
- Brown, K. S., et al. Tumor necrosis factor induces developmental stage-dependent structural changes in the immature small intestine. Mediators of Inflammation. 2014, 852378 (2014).
- McElroy, S. J., et al. The ErbB4 ligand neuregulin-4 protects against experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Pathology. 184 (10), 2768-2778 (2014).
- McElroy, S. J., et al. Tumor necrosis factor receptor 1-dependent depletion of mucus in immature small intestine: a potential role in neonatal necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (4), 656 (2011).
- Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. , (2019).
- McElroy, S. J., Weitkamp, J. H. Innate Immunity in the Small Intestine of the Preterm Infant. NeoReviews. 12 (9), 517-526 (2011).
- McElroy, S. J., Underwood, M. A., Sherman, M. P. Paneth cells and necrotizing enterocolitis: a novel hypothesis for disease pathogenesis. Neonatology. 103 (1), 10-20 (2013).
- Park, B. S., Lee, J. O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes. Experimental & Molecular Medicine. 45, 66 (2013).
- Lester, S. N., Li, K. Toll-like receptors in antiviral innate immunity. Journal of Molecular Biology. 426 (6), 1246-1264 (2014).
- Pott, J., et al. Age-dependent TLR3 expression of the intestinal epithelium contributes to rotavirus susceptibility. PLOS Pathogens. 8 (5), 1002670 (2012).
