Summary
우리는 살아있는 유기체의 합병증 없이 모계 염증에 태아 노출을 시뮬레이션하기 위하여 chorioamnionitis의 모형을 개발했습니다 자손의 창자 발달에 FEMI의 효력을 검토합니다. 이것은 chorioamnionitis 다음 장 상해의 발달을 위한 기계론적인 원인의 연구를 허용합니다.
Abstract
Chorioamnionitis는 조산의 일반적인 침전물이고 괴사 장염 (NEC)을 포함하여 미숙아의 이환의 많은 것과 연관됩니다. 그러나, 이 두 조건 사이 기계적인 링크는 아직 발견되지 않았습니다. 우리는 모성 염증 (FEMI)에 리포 폴리삭차라이드 (LPS)유도 태아 노출을 포함하는 chorioamnionitis의 뮤린 모델을 채택했습니다. FEMI의 이 모형은 또한 임상 chorioamnionitis의 많은 경우에 존재하는 멸균 모계, 태반 및 태아 선동적인 폭포를 유도합니다. 살아있는 박테리아를 이용하고 더 정확하게 chorioamnionitis의 결과로 상승 감염의 병리 생리학을 모방하는 모형이 존재하더라도, 이 방법은 미숙한 창자 및 관련 개발 microbiome의 발달에 간접적인 효력을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 LPS 유도 FEMI가 임신 손실및 조산에 있는 복용량 의존적인 증가, 뿐만 아니라 자손에 있는 일반적인 장 발달의 중단에 초래한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 우리는 FEMI가 자손에 있는 장 상해 및 혈청 사이토카인을 현저하게 증가시키는 것을 보여주었습니다, 동시에 진보와 Paneth 세포를 감소시키면서, 둘 다 장 염증에 대하여 선천적인 면역의 첫번째 줄을 제공하는. LPS 유도 FEMI의 유사한 모형은 chorioamnionitis와 중추 신경계의 후속 이상 사이 협회를 모델링하기 위하여 이용되었지만, 우리의 지식에, 이 프로토콜은 chorioamnionitis와 NEC 사이 잠재적인 링크로 chorioamnionitis 및 NEC 사이 기계적인 링크를 해명하기 위하여 시도하는 첫번째입니다.
Introduction
융경막은 포유류 임신에 필수적인 역할을 합니다. 그들은 여러 기능을 제공하는 초리온과 양상을 포함한다. 그들은 태아를 둘러싸고 보호하고, 모계와 태아 구획1사이의 파라크리니 신호를 용이하게하고, 파리오닉 멤브레인 내에서 로컬 피드백 루프를 생성하여 parturition1을시동하는 데 관여할 수 있다. 멤브레인의 현재 이해는 양막이 구조적 장벽 기능을 제공한다는 것을 나타내며, 초리온은 주로 모계 면역 계통2로부터발전하는 태아를 보호하기 위해 면역학적 완충제를 제공한다. 이 막의 염증은 chorioamnionitis로 알려져 있습니다. 역사적으로, 임상 초리오암니온염의 진단은 모계 열플러스 하나 이상의 태아 또는 모계 임상발견의존재에 따라 만들어졌으며3,4. 그러나, 이 정의는 임상적으로 유용하지만, 정밀도의 부족은 chorioamnionitis 연구를 도전하게 했습니다. 2015년, 진단을 명확히 하기 위해 유니스 케네디 슈리버 국립아동보건연구원의 전문가 패널 워크숍은 충야염염을 자궁내 염증 또는 감염 또는 둘 다(트리플 I)3로정의했다. 이러한 설명은 미생물 유도 감염이 자궁/양수 염증의 중요한 원인이지만 멸균 자궁/양수 염증5,6,7보다덜 일반적으로 발생하기 때문에 중요하다. 전반적으로, chorioamnionitis는 기간 납품의 2\u20124%와 조산 납품의 25\u201230%에서 볼 수 있듯이 중요한 공중 위생 문제점 남아 있습니다8,9.
Chorioamnionitis 태아와 신천에 중요 한 영향을 미칠 수 있습니다. 그것은 잘 충진성 측량 이형성증을 포함하여 미숙아의 많은 이환의 증가 리스크와 연관된다는 것을 문헌에서 잘 문서화되었습니다10,뇌백색 물질 상해11,정맥 내 출혈12,미숙아 출혈13의망막 출혈, 및 모두 의외및 신생아14, 14의초기확인. 미숙한 장내 부상 및 수리 메커니즘에 관심이 있기 때문에, 초리오암니온염은 또한 괴사장염(NEC)15,16의나중에 개발과 연관된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. NEC는 염증 및 후속 장 괴사(17)에대한 난독증 숙주 반응을 초래하는 조산 유아의 치명적인 위장 질환이다. NEC는 매년 미국에서 4,000명 이상의 유아에게 영향을 미치고 있으며, 이들 유아의 3분의 1은18세질병으로 사망합니다. NEC의 발병기는 아마도 장 미성숙의 조합을 포함, 미성숙 면역 체계의 dysregulation, 장 염증, 세균성 전좌19,장 괴사의 최종 일반적인 경로에 절정. 중요한 것은, NEC의 개시는 수시로 출생 후에 주 및 chorioamnionitis에 잠재적인 노출을, chorioamnionitis와 NEC의 후속 발달 사이 기계론링크를 불분명하게만듭니다. chorioamnionitis가 NEC의 병리 생리학에 기여할 수 있는 1개의 잠재적인 기계장치는 모계 면역 계통의 강화 조절을 통해서, 그 후에 정상 태아 발달 패턴을 방해할 수 있는 강한 태아 선동반응을생성합니다(21,22,23).
초리오암니온염의 다중 포유류 모델은 설치류 및 양24,25,26,27,28,29,30,31,32에존재한다. 그러나, 모성 염증에 대한 초암니염 유도 태아 노출(FEMI)에 이어 초기 신생아 기간을 넘어 장내 발병에 관한 몇 가지 데이터가 존재한다. FEMI와 미숙한 장의 부상의 후속 개발 사이의 관계를 탐구하기 위해, 우리는 리포 폴리사카라이드 (LPS)유도 FEMI 모델을 적응했다. 리포폴리사카라이드는 그람 음성 박테리아에 세포 외 표면의 주요 구성 요소이며 인간을 포함한 다중 진핵종의 타고난 면역 계통의 강력한자극제(33)이다. 모계 LPS 주사는 살아있는 박테리아의 혼동 효과 없이 멸균 염증 폭포를 초래하고, 조산34의유도를 위한 잘 확립된 모델일 뿐만 아니라 급성 초리암니온염 및 태아 염증 반응 증후군(FIRS)의 모델, 이는 가장 심한 형태의 초리오암니온염(24,35)이다. 또한 양모델(36)과 뮤린모델(37, 38,39,40)에서대뇌 백색 및 회색 물질 상해를 유도하는 것으로 나타났다. 그러나, 우리의 지식에, 우리는 chorioamnionitis와 FEMI의이 모델을 사용하여 출생 과거 위장의 발달에 미치는 영향을 조사하고, chorioamnionitis및 NEC41의나중에 개발 사이의 가능한 기계론적 링크를 조사하기위해.
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Protocol
모든 동물 절차는 아이오와 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 #8041401)에 의해 승인되었다. 모든 동물은 아이오와 대학에서 승인 된 실험실 동물 관리 (AALAC)의 평가 및 인증 협회에 보관되었습니다. 모든 마우스는 야생 형 균주 C57Bl/6J였다.
1. 임신 한 쥐에 FEMI의 설립
- LPS 준비
- 에샤리치아 대장균 O55:B5(재고 농도 2 mg/mL)에서 파생된 LPS를 사용하십시오.
- 20 μg/mL의 작동 농도에 대한 멸균 식염수로 LPS 재고 농도 1:100을 희석합니다.
- 모계 LPS 주입
- 임신 일 e15에 임신 한 댐을 주입하십시오. 이 시점은 뮤린 임신을 통해 약 75%이며, 이 모델은 초리암니온염으로 인한 조산의 대부분이 발생하는 인간 임신의 초기 세 번째 삼보격과 발달적으로 유사합니다.
- 적절한 LPS 주입을 결정하기 위해 주사 직전에 임신 한 마우스를 무게.
- 다음 공식을 사용하여 작업 농도의 용량을 계산합니다: 5 μL x 그램 체중(gbw), 100 μg/kg의 LPS의 총 용량. 제어 동물의 경우, 주사에 대한 일반 식염수의 동등한 볼륨을 사용합니다.
- 소용돌이 LPS 용액은 각 주입 전에 높은 15 초 동안 세 번.
- LPS 볼륨을 1mL 주사기로 그립니다.
- 스크러핑 기술로 임신 한 마우스를 억제하십시오. 등대 반수 위치에 잡고 주사를 수행합니다.
- 30\u201240° 각도에서 복부의 오른쪽 아래 사분면(방광 및 복부 혈관을 피하기 위해)을 위에 30 게이지 8mm 바늘 벨을 삽입합니다. 바늘의 길이를 약 1/4 ~ 1/2로 삽입합니다.
- 주사기 플런저에 다시 당겨 주입하기 전에 부정적인 압력을 보장합니다. 음압이 존재하는 경우 주사를 진행합니다.
- 주사 후, 약 30 분 동안 마우스를 모니터링 한 다음 임신의 나머지 부분에 대한 케이지로 돌아갑니다.
2. 자손의 납품 및 관리, 장 수확
- e20에서 질 전달을 통해 일반적으로 새끼를 전달합니다.
참고: 이 모델은 그림 1에서 볼 수 있는 예상 복용량 의존 태아 손실 률을 가지고 있으며 아래 결과에서 논의 됩니다. - 새끼가 어머니와 함께 남아 광고 리비툼 피드를받을 수 있습니다.
- 수확당일, 일반적으로 산후 14일(P14)은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜에 따라 자궁 경부 탈구를 통해 새끼를 안락사시합니다.
- 가위와 집게를 사용하여 복부의 중간선 아래로 수직 절개를 하고, 피부와 복막을 통해 복부의 전체 길이를 만듭니다. 가위로 소장을 위장에서 cecum에 게 이 음 하 고 집게와 장간을 제거 합니다.
- 소장의 1/3(인간 일루를 대표하는 부분)를 분리하고 유지하여 근위 소장, cecum 및 결장을 폐기한다.
- 가위를 사용하여 일레움 부분을 반으로 나눕니다.
- 이후 RNA 정량화를 위해 RNA 안정화 용액에 근위 절반을 놓는다.
- 슬라이드 준비를 위해 10% 중립 버퍼링 포름틴에 탈반 절반을 배치합니다.
3. 장 부상 득점
- 섹션 파라핀 은 5 μm 두께의 슬라이스에 조직을 내장하고 유리 슬라이드에 마운트.
참고: 우리는 파라핀 포함, 단면 및 슬라이드에 장착을 위한 히스토로지 코어로 표본을 보냅니다. - 표준 절차에 따라 슬라이드를 분리합니다.
- 표준 절차에 따라 헤마톡슬린과 에신을 가진 얼룩 섹션.
- 앞서 설명한 바와 같이 장 내 부상에 대한 3점 척도의 점수섹션은 42,43.
- 경현미경검사를 사용하여, 지하멤브레인(43)으로부터의 고루 무결성 및 분리를 평가하는 3점 척도에서 2명의 별도 맹목적인 수사관에 의한 일반화된 장 손상을 평가한다(보충도1). 장 내 부상은 20배율 및 수치 조리개 0.50에서 가장 잘 평가됩니다.
- 일반 점막을 설명하기 위해 점수0을 할당합니다.
- 1의 점수를 할당하는 것은 부피 그루엔하겐의 공간, vacuolization 또는 빌리의 팁에 국한 된 피상적 인 리프팅의 개발을 포함하는 가벼운 부상을 설명합니다.
- 심한 부상을 설명하기 위해 2의 점수를 할당, 상피 리프팅 및 바이크 올무의 절반 이상 큰 vacuolization에 의해 표시, 빌리 왜곡, 또는 점막 궤양 및 라미나 프로프리아의 붕괴.
4. 창과 잔 세포의 정량화
- deparaffinization 다음, 알시안 블루/주기산 쉬프 얼룩을 가진 단계 2.8에서 조직 섹션의 얼룩 슬라이드는 이전에 설명된 바와 같이 잔과 창세포 모두를 나타내기 위하여44,45 다음 단계에 따라.
참고: 알시안 블루/주기성 산 쉬프 얼룩은 창이나 잔 세포에 만연하지 않지만, 우리의 경험에서, 맹목적인 숙련 된 조사자는 세포 표적 항체에 비해이 얼룩을 사용하여 동등한 세포 정량화를 가지고 있으며, 훨씬 적은 배경 염색46. - 다음과 같이 탈수 슬라이드를 분리, 얼룩 및 탈수합니다.
- 자일렌에 있는 슬라이드를 10분 동안 두 번 잠급합니다.
주의: 자일렌은 연기 후드에 사용해야합니다. - 100% EtOH로 헹구는 다.
- 3분 동안 100% EtOH로 슬라이드를 3분 동안 100% EtOH, 3분 동안 90% EtOH, 3분 동안 70% EtOH, 마지막으로 3분 동안 50%의 EtOH를 침수합니다.
- 흐르는 수돗물 에서 5 분 동안 씻으시면 하십시오.
주의: 티슈 샘플의 손실을 방지하기 위해 흐르는 물에서 멀리 부분을 가리킵니다. - 표준 커피 필터로 알시안 블루 스테인 솔루션을 필터링합니다.
- 알시안 블루 스테인에서 15분 동안 스테인슬라이드를 한 다음 흐르는 수돗물 아래에서 2분 간 세척합니다.
- 이중 증류수 200mL에 1 mg의 주기산을 희석합니다. 이 솔루션의 슬라이드를 5분 동안 잠수합니다. 그런 다음 흐르는 수돗물 에서 1 분 동안 씻으릅니다.
- 10 분 동안 쉬프의 시약으로 얼룩. 흐르는 수돗물 에서 5 분 동안 씻으시면 하십시오.
- 헤마톡슬린으로 슬라이드를 1분 동안 묻은 다음 흐르는 수돗물 에서 2분 동안 세척합니다.
- 산성 알코올 (1 mL의 염산 혼합 99 mL에서 70 % EtOH)에 1 분 동안 담급니다.
- 스콧의 수돗물(수돗물에 NaHCO3 농도 0.1%)에 1분 동안 담근 다음 흐르는 수돗물 에서 1분 동안 세척합니다.
- 슬라이드를 탈수합니다.
- 각 슬라이드를 70% EtOH로 10회 찍어 90% EtOH에서 10회, EtOH100%로 10회 찍어 보세요.
- 10분 동안 100% EtOH로 슬라이드를 잠그고, 신선한 자일렌에 두 번 잠급하여 각각 3분 동안 잠급됩니다.
- 시편에 장착 용지 한 방울을 놓고 덮개 슬립을 위에 놓습니다.
- 자일렌에 있는 슬라이드를 10분 동안 두 번 잠급합니다.
- 잔 세포 계산
- 가벼운 현미경 검사를 사용하여 잔 세포를 계산합니다(보충 도 2). 장 조직의 각 조각에 대 한, 잔 세포의 수를 계산 하 고 500 상피 세포 와 표현 잔 세포 비율을 100 상피 세포 당 비율로. 잔 세포는 20배율 및 수치 조리개 0.5에서 가장 잘 계산됩니다.
- 창세포 계수
- 가벼운 현미경 검사를 사용하여창세포(보충도 2)를계산합니다. 장 조직의 각 조각에 대 한, 창 자 지하실 당 창 세포의 비율로 표현. 장 조직의 각 조각당 100개의 장 내 지하실을 계산합니다. 창세포는 20x-60x 배율 및 수치 조리개 0.50-1.30으로 가장 잘 계산됩니다.
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Representative Results
배아 일째에 FEMI에 노출15 임신의 용량 의존손실과 조산 노동의 투여 의존율로 이어집니다(그림 1)42. 실험을 위해, 우리는 중요한 선동적인 모욕에 태아를 드러내면서 임신 손실 및 미숙아 (미숙아와 자궁 내 태아 죽음 둘 다 사이 50% 손실)를 극소화하기 위하여 100 μg/kg의 LPS 복용량을 사용하기로 결정했습니다.
이 방법을 사용하여, 우리는 다음 자손의 후속 상해에 FEMI의 효력을 검토했습니다. 일반화 된 장 상해를 측정하기 위해 3 점 조직학적 척도를 사용하여 출생 시 (P0) 및 성인기 (P56 또는 8 주)(그림 2)에서상당한 부상을 발견했습니다. 이 부상은 FEMI 이외의 동물에 대한 추가 자극이없는 경우 발생한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 마우스는 생활의 첫번째 4 주 동안 계속 하는 상대적으로 미숙한 장으로 태어났기 때문에47,48,이것은 또한 미숙한 창자 기관을 가진 preterm 유아와 관련이 있습니다.
FEMI가 장 상피의 정상적인 발달과 미숙한 장의 방어 메커니즘에 대한 효과를 더욱 이해하기 위해, 우리는 인간과 유사한 작은 장내 항로의 황산 제 3에서 뮤신 생성 잔 세포 및 항균 펩타이드 생산 창추 세포의 수를 정량화하였다. 우리는 FEMI가 FEMI가없는 동물에 비해 잔세포와 창세포 모두의 손실을 유도하여 장 상피의 정상적인 조성을 방해한다는 것을 발견했습니다(도 3).
전기 화학 발광을 가진 ELISA를 사용하여 신생아 염증 반응에 대한 FEMI의 효과를 조사하기 위해 IL-1β, IL-10, KC-GRO (IL-8의 뮤린 상당), IL-6을 포함하는 다양한 혈청 염증 마커를 FEMI없이 pups의 혈청에서 정량화했습니다(그림4). 우리는 FEMI가 P0의 모든 사이토카인에 대한 염증성 폭포를 크게 증가시켰다는 것을 발견했습니다. 후기의 염증 성 폭포 (P7\u2012P56)는 시점과 사이토카인에 따라 달랐다. 가장 흥미롭게도, IL-6의 경우 FEMI 및 sham 그룹에서 P7\u2012P28에서 비슷한 수준이 있었지만 보조 개입에도 불구하고 P56의 FEMI 그룹에서 상당히 높은 수준이 있었습니다. 이것은 우리가 IL-6이 FEMI 모형에 있는 산후 장 상해의 발달을 위한 중요한 사이토카인이다는 것을 보여주었기 때문에 특히 중요합니다.
그림 1: 임신 결과에 FEMI 복용량의 효과. 임신 쓰레기의 생존은 임신 손실(A)의높은 비율과 조산의 높은 비율을 일으키는 원인이 되는 더 높은 복용량에 의존하는 복용량(B). 그림은 Fricke 외42의허가로 조정됩니다. 100 μg/kg의 LPS 복용량을 사용하여 FEMI는 생활의 1 주일까지 새끼를 위한 50% 생존을 만듭니다. 각 데이터 포인트는 n > 8개의 임신 및 적어도 3개의 개별적인 실험을 대표합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 시간이 지남에 따라 작은 장 부상 패턴에 FEMI의 효과. 장 내 샘플은 출생 시 수확, 1주, 생수 2주, FEMI(LPS 100μg/kg) 또는 샴 컨트롤에 노출된 마우스로부터 8주간의 수명을 받았다. 샘플은 맹목적인 수사관(42,43)에의해 3 점 부상 척도를 사용하여 득점되었다. FEMI 만으로는 더 이상 모욕없이 출생 시 상당한 양의 상해를 입히었으며, 1 주일의 삶과 8 주 생에서. 그림은 Fricke 외42의허가로 조정되었습니다. 각 데이터 포인트는 n > 10 새끼와 적어도 3 개의 임신 한 댐에서 적어도 3 개의 개별 실험을 대표합니다. Mann-Whitney 비 파라메트릭 T-테스트는 각 시점에서 장 내 부상 점수를 비교하는 데 사용되었습니다. 별표는 p < 0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: FEMI는 개발 중에 소장에서 정상 잔 및 창세포 수량의 변화를 유도한다. 장 내 샘플은 FEMI(100 μg/kg LPS) 또는 샴 컨트롤에 노출된 마우스로부터 출생 시, 1, 2, 4 및 8주 동안 수확하였다. 샘플은 알시안 블루/주기성 산 쉬프 얼룩으로 얼룩져 서 잔과 창구 세포를 모두 검출했으며 이들은 맹목적인 조사자들에 의해 정량화되었다. FEMI를 가진 동물에서 잔 세포와 창세포 둘 다 동향 또는 모든 연령대에 가짜 통제에 비해 유의한 감소를 보여주었습니다. 엘진 외41의허가로 조정된 그림. 각 데이터 포인트는 n > 10 새끼와 적어도 세 개의 개별 실험을 대표합니다. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. 학생 T 테스트는 매 시점에서 잔과 창세포의 양을 비교하는 데 사용되었다. 별표는 p < 0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: FEMI는 P56에서 IL-6의 늦은 서지와 함께 P0에서 출생 직후 모든 사이토카인에 대한 글로벌 신생아 염증 파동을 유도합니다. 혈청 사이토카인은 P0, P7, P14 및 P28에서 제조 업체의 지시에 따라 전기 화학 발광을 가진 ELISA를 사용하여 정량화되었으며 플레이트는 620 nm에서 판독되었습니다. 사이토카인 값은 레이더 플롯에서 여기에 표시되며 모든 사이토카인은 최대 값의 백분율로 플롯됩니다. FEMI 군에서 P0에서 모든 사이토카인(IL-1β, IL-10, KC-GRO 및 IL-6)에서 대조군(모든 p < 0.05)에 비해 상당한 증가가 있었다. 또한 FEMI를 가진 새끼에 있는 P56에서 IL-6 수준이 비 파라메트릭 크루스칼-월리스 시험에 < 비해, 이는 이 늦은 시점에서 대조군에 비해 FEMI 단에서 현저하게 상승한 유일한 사이토카인이었습니다. 엘진 외41의허가로 조정된 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: H&E 염색 된 장 조직 조직의 장 손상 점수. 부상 점수는 앞서설명한바와 같이 빌리 바쿠올화, 점막 궤양, 라미나 프로프리아 손상 및 불모의 출혈의 존재 정도에 따라 3점 장 손상 점수 척도(0=보통, 1=경미한 부상, 2=중증 상해)에 의해 결정된다. 엘진 외41의허가로 조정된 그림. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 2: 알시안 블루/PAS 잔 및 창세포의 염색의 대표적인 모습. 장 조직의 Alcian Blue/PAS 염색은 장 내 비방 (흰색 화살표로 표시된 상단 패널, 20 배율로 찍은 이미지)에 존재하는 잔 세포의 명확한 시각화를 허용하며, 라미나 프로프리아의 장 내 악고 아래에 위치한 Lieberkuhn의 토굴에 존재하는 Paneth 세포 (아래 바닥 패널, 6 개의 화살로 표시된). 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Chorioamnionitis 영향 2\u20124% 기간의 및 25\u201230% preterm 납품의8,9. 그러나, 초리오암니온염의 영향은 태아와신생아10,11,12,13,14,15,16에중요한 영향을 미치는 것으로 나타났기 때문에 오래 전해질 수 있다. 중요한 것은, chorioamnionitis는 NEC15,16의후속 발달과 연관되는 것으로 나타났습니다. 아직 불완전하게 이해되고 있지만, NEC의 발병기는 장 내 미성숙, 미성숙면역체계의 장애 조절, 장 염증 및 세균전의 조합을 수반하여 장 괴사19의최종 일반적인 통로에서 절정을 이룬다. 그러나, chorioamnionitis와 NEC의 후속 발달 사이 기계론적인 링크는 불분명한남아 20,chorioamnionis의 이전 동물 모형은 이 관계를 검토하기에 부족했습니다. 지식의 이 격차를 해결하기 위하여는, 우리는 신생아 출생과 생존을 허용하기 위하여 chorioamnionitis 및조산34,37,38,39,40의 일반적으로 이용된 LPS 유도한 뮤린 모형을 수정했습니다. 이렇게, 우리는 후속 장 발달에 모계 염증 (FEMI)에 태아 노출의 충격을 연구하기 위하여 chorioamnionitis42에서 보인 선동적인 조건을 근사하는 모형을 만들었습니다.
이 프로토콜을 통해, 우리는 LPS 유도 FEMI를 사용하여 chorioamnionitis의 이 뮤린 모형이 단기 및 장기 장 손상뿐만 아니라 정상 장 발달의 중단, 특히 진보와 Paneth 세포의 중단을 초래한다는 것을 보여주었습니다, 둘 다 장 염증에 대하여 선천성 면역의 첫번째 선을 제공하는 둘 다. 이 모델로 볼 수 있는 장 내 부상 및 조직학적 세포 변화는 NEC에서 볼 수 있는 부상을 모방하는 효과적인 모델임을 나타냅니다. 이는 주로 Paneth 세포와 잔 세포의 다운규제가 NEC의 발병기전에 연루되어 있고, 조직학적 상해의 패턴은 NEC41,42,49의인간사례에서 볼 수 있는 것과 유사하기 때문이다. 따라서, 이러한 LPS 유도 FEMI 모델은 초리오암니온염과 후기 장 손상, 특히 NEC의 개발, 그리고 살아있는 박테리아를 활용하는 기존 모델에서는 불가능할 수 없는 미생물군유전체에 대한 초리오암니온염의 잠재적 효과를 조사하기 위한 이상적인 모델이다.
생체 내에서, chorioamnionitis는 종종 막의 조혈 및 chorioamnionitis의 임상 표현형귀착되는 상승세균감염을 수반하며, 초리오암니온염의 동물 모델은 이러한 병리생리학25,28,30,32를보다 정확하게 반영한다. 그러나, 우리의 실험실 연구 장 개발 때문에, 개발 미생물군유전체를 포함 하 여, chorioamnionitis의 모델에 살아있는 박테리아의 존재 는 미생물 군수 분석을 혼동 것 이다. 따라서, 살아있는 박테리아를 이용한 초리오암니염의 기존 모델은 초리오암니염과 NEC의 후기 개발 사이의 기계적 연관성을 조사하기 위한 비실용적이다. 또한, LPS 유도된 초리오암니온염 모델은 이미 출생 시 초리암니온염에 대한 노출과 관련된 미숙아의 이환성을 모델링하는 효과적인 방법임을 입증하는 산후 백색 및 회색 물질 뇌손상(36)을모델링하는 데 효과적이었다.
이 모델은 FEMI를 유도하는 데 사용되는 LPS의 용량에 크게 의존한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜의 주요 중요한 단계는 LPS의 복막 주사를 가진 임신 한 댐에서 FEMI의 유도입니다. 따라서, 당연히, 우리는 FEMI를 유도하는 데 사용되는 LPS의 복용량이 이러한 실험의 결과에 매우 중요하다는 것을 발견했다. 초기 실험으로, LPS의 100 μg/kg의 투여량이 사용되었고, 이 LPS 투여량은 모성 사망률과 관련이 없으며 자손41,42에서의중요한 장 손상뿐만 아니라 약 50%의 신생아 생존을 초래하였다.
LPS는 톨과 같은 수용체 4(TLR4) 복합체에 결합하여 세포내 신호 단백질, 사이토카인 생성 및 프로 염증 신호 신호50의개시를 초래한다. TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 및 TLR9을 포함한 톨유사 수용체(TLR)는 바이러스, 박테리아 및곰팡이(51)와같은 다양한 병원체 및 미생물로 보이는 염증 반응의 유도에 중요하다. 흥미롭게도, TLR3의 상향 조절은 또한 신생아 뮤린 로타바이러스 모델에서 증가된 조직학적 장 손상 및 바이러스 흘리기와 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다. 또한, TLR3의 녹아웃은 이러한 효과를 개선52. 따라서 모델은 TLR4 경로를 사용하는 동안 다른 TLR의 자극이 유사한 결과를 부여 할 수 있다고 가정하는 것이 합리적입니다.
이러한 방법론을 이용하여, 임산부 댐에서 LPS 주사로 양수, 태아 염증마커의 증가를 유발하고태반(42)에직접적인 손상을 유도하는 것을 보여줄 수 있었다. 흥미롭게도, 이 방법론은 자궁 동맥에 있는 저항의 아무 변경도 보여주지 않았습니다. FEMI 모델은 또한 노출된 새끼가 IL-6 의존경로(41)를 통해 장내부상(42)을 가지며, 잔세포 및창세포(41)와 같은 장의 중요한 방어 메커니즘에영향을 미칠 수 있음을 보여주었기 때문에 자식에 큰 영향을 미친다. 이 상해는 신생아 자손이 연속LPS 유도한 장 상해 및 염증41에 점점 더 영향을 받기 쉽게 하고 있는 chorioamnionitis에 드러낸 유아가 NEC를 개발하기 위하여 증가한 감수성이 있는 이유를 설명할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국립 연구소 (DK097335 및 T32AI007260)와 아이오와 스테드 소아과의 대학을 통해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| Alcian blue stain | Newcomer supply | 1003A | |
| C57Bl6/J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| Ethanol | Decon labs | 2701 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| Hematoxylin stain | Leica | 381562 | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Nikon Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 2CE-MQVJ-1 | |
| Periodic Acid | ACROS | H5106 | CAS# 10450-59-9 |
| RNAlater | Thermofisher | Am7021 | |
| Schiff's reagent | Sigma | S5133 | |
| Secor Imager 2400 | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| V-Plex Assay | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| Xylene | Sigma | 534056 |
References
- Myatt, L., Sun, K. Role of fetal membranes in signaling of fetal maturation and parturition. International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 545-553 (2010).
- Verbruggen, S. W., Oyen, M. L., Phillips, A. T., Nowlan, N. C. Function and failure of the fetal membrane: Modelling the mechanics of the chorion and amnion. PLoS One. 12 (3), 0171588 (2017).
- Higgins, R. D., et al. Evaluation and Management of Women and Newborns With a Maternal Diagnosis of Chorioamnionitis: Summary of a Workshop. Obstetrics & Gynecology. 127 (3), 426-436 (2016).
- Peng, C. C., Chang, J. H., Lin, H. Y., Cheng, P. J., Su, B. H. Intrauterine inflammation, infection, or both (Triple I): A new concept for chorioamnionitis. Pediatrics and Neonatology. 59 (3), 231-237 (2018).
- Romero, R., et al. Prevalence and clinical significance of sterile intra-amniotic inflammation in patients with preterm labor and intact membranes. American Journal of Reproductive Immunology. 72 (5), 458-474 (2014).
- Romero, R., et al. Sterile intra-amniotic inflammation in asymptomatic patients with a sonographic short cervix: prevalence and clinical significance. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal. , 1-17 (2014).
- Romero, R., et al. Sterile and microbial-associated intra-amniotic inflammation in preterm prelabor rupture of membranes. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 28 (12), 1394-1409 (2015).
- Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
- Erdemir, G., et al. Histological chorioamnionitis: effects on premature delivery and neonatal prognosis. Pediatrics and Neonatology. 54 (4), 267-274 (2013).
- Metcalfe, A., Lisonkova, S., Sabr, Y., Stritzke, A., Joseph, K. S. Neonatal respiratory morbidity following exposure to chorioamnionitis. BMC Pediatrics. 17 (1), 128 (2017).
- Anblagan, D., et al. Association between preterm brain injury and exposure to chorioamnionitis during fetal life. Scientific Reports. 6, 37932 (2016).
- Villamor-Martinez, E., et al. Corrigendum: Chorioamnionitis Is a Risk Factor for Intraventricular Hemorrhage in Preterm Infants: A Systematic Review and Meta-Analysis. Frontiers in Physiology. 10, 102 (2019).
- Villamor-Martinez, E., et al. Chorioamnionitis as a risk factor for retinopathy of prematurity: An updated systematic review and meta-analysis. PLoS One. 13 (10), 0205838 (2018).
- Randis, T. M., et al. Incidence of early-onset sepsis in infants born to women with clinical chorioamnionitis. Journal of Perinatal Medicine. 46 (8), 926-933 (2018).
- Rodrigo, F. G. M., Henriquez F, G. G., Aloy, F. J., Perez, G. A. A. Outcomes of very-low-birth-weight infants exposed to maternal clinical chorioamnionitis: a multicentre study. Neonatology. 106 (3), 229-234 (2014).
- Been, J. V., Lievense, S., Zimmermann, L. J., Kramer, B. W., Wolfs, T. G. Chorioamnionitis as a risk factor for necrotizing enterocolitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Pediatrics. 162 (2), 236-242 (2013).
- Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: modeling the innate immune response. American Journal of Pathology. 185 (1), 4-16 (2015).
- Fitzgibbons, S. C., et al. Mortality of necrotizing enterocolitis expressed by birth weight categories. Journal of Pediatric Surgery. 44 (6), 1075-1076 (2009).
- Vongbhavit, K., Underwood, M. A. Prevention of Necrotizing Enterocolitis Through Manipulation of the Intestinal Microbiota of the Premature Infant. Clinical Therapeutics. 38 (4), 716-732 (2016).
- Yee, W. H., et al. Incidence and timing of presentation of necrotizing enterocolitis in preterm infants. Pediatrics. 129 (2), 298-304 (2012).
- Gantert, M., et al. Chorioamnionitis: a multiorgan disease of the fetus. Journal of Perinatology. 30, 21-30 (2010).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Yamada, N., et al. Histological severity of fetal inflammation is useful in predicting neonatal outcome. Placenta. 36 (12), 1490-1493 (2015).
- Wolfe, K. B., et al. Modulation of lipopolysaccharide-induced chorioamnionitis in fetal sheep by maternal betamethasone. Reproductive Sciences. 20 (12), 1447-1454 (2013).
- Normann, E., et al. A novel mouse model of Ureaplasma-induced perinatal inflammation: effects on lung and brain injury. Pediatric Research. 65 (4), 430-436 (2009).
- Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis: unraveling causes of adverse neurological outcomes. Reproductive Sciences. 18 (9), 900-907 (2011).
- Dell'Ovo, V., et al. An animal model for chorioamnionitis at term. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 387 (2015).
- Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. Journal of Infectious Diseases. 210 (2), 265-273 (2014).
- Breen, K., et al. TLR-4-dependent and -independent mechanisms of fetal brain injury in the setting of preterm birth. Reproductive Sciences. 19 (8), 839-850 (2012).
- Burd, I., Balakrishnan, B., Kannan, S. Models of fetal brain injury, intrauterine inflammation, and preterm birth. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (4), 287-294 (2012).
- Agrawal, V., et al. Role of Notch signaling during lipopolysaccharide-induced preterm labor. Journal of Leukocyte Biology. 100 (2), 261-274 (2016).
- Filipovich, Y., Klein, J., Zhou, Y., Hirsch, E. Maternal and fetal roles in bacterially induced preterm labor in the mouse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 214 (3), 381-389 (2016).
- Alexander, C., Rietschel, E. T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. Journal of Endotoxin Research. 7 (3), 167-202 (2001).
- McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: suggested assessment and reporting guidelines. Biology of Reproduction. 99 (5), 922-937 (2018).
- Rueda, C. M., et al. Lipopolysaccharide-Induced Chorioamnionitis Promotes IL-1-Dependent Inflammatory FOXP3+ CD4+ T Cells in the Fetal Rhesus Macaque. Journal of Immunology. 196 (9), 3706-3715 (2016).
- Gavilanes, A. W., et al. Chorioamnionitis induced by intraamniotic lipopolysaccharide resulted in an interval-dependent increase in central nervous system injury in the fetal sheep. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 200 (4), 431-438 (2009).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 881-897 (2010).
- Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 10 (11), 643-660 (2014).
- Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain, Behavior, and Immunity. 31, 54-68 (2013).
- Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
- Elgin, T. G., et al. Fetal exposure to maternal inflammation interrupts murine intestinal development and increases susceptibility to neonatal intestinal injury. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Fricke, E. M., et al. Lipopolysaccharide-induced maternal inflammation induces direct placental injury without alteration in placental blood flow and induces a secondary fetal intestinal injury that persists into adulthood. American Journal of Reproductive Immunology. 79 (5), 12816 (2018).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2627-2635 (2016).
- Brown, K. S., et al. Tumor necrosis factor induces developmental stage-dependent structural changes in the immature small intestine. Mediators of Inflammation. 2014, 852378 (2014).
- McElroy, S. J., et al. The ErbB4 ligand neuregulin-4 protects against experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Pathology. 184 (10), 2768-2778 (2014).
- McElroy, S. J., et al. Tumor necrosis factor receptor 1-dependent depletion of mucus in immature small intestine: a potential role in neonatal necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (4), 656 (2011).
- Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. , (2019).
- McElroy, S. J., Weitkamp, J. H. Innate Immunity in the Small Intestine of the Preterm Infant. NeoReviews. 12 (9), 517-526 (2011).
- McElroy, S. J., Underwood, M. A., Sherman, M. P. Paneth cells and necrotizing enterocolitis: a novel hypothesis for disease pathogenesis. Neonatology. 103 (1), 10-20 (2013).
- Park, B. S., Lee, J. O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes. Experimental & Molecular Medicine. 45, 66 (2013).
- Lester, S. N., Li, K. Toll-like receptors in antiviral innate immunity. Journal of Molecular Biology. 426 (6), 1246-1264 (2014).
- Pott, J., et al. Age-dependent TLR3 expression of the intestinal epithelium contributes to rotavirus susceptibility. PLOS Pathogens. 8 (5), 1002670 (2012).
