Summary
Abbiamo sviluppato un modello di corioamionite per simulare l'esposizione fetale all'infiammazione materna (FEMI) senza complicazioni di organismi vivi per esaminare gli effetti del FEMI sullo sviluppo del tratto intestinale della prole. Ciò consente lo studio delle cause meccaniche per lo sviluppo di lesioni intestinali a seguito della corioamionite.
Abstract
La corioamionite è un precipitante comune di nascita pretermine ed è associata a molte delle morbilità della prematurità, inclusa l'enterocolite necrotizzante (NEC). Tuttavia, un legame meccanicistico tra queste due condizioni rimane ancora da scoprire. Abbiamo adottato un modello murino di corioamnionite che coinvolge l'esposizione fetale indotta dal lipoppiosaccaride (LPS) all'infiammazione materna (FEMI). Questo modello di FEMI induce una cascata infiammatoria sterile materna, placentare e fetale, che è presente anche in molti casi di corioamionite clinica. Sebbene esistano modelli che utilizzano batteri vivi e imitano più accuratamente la fisiopatologia di un'infezione ascendente con conseguente corioamionite, questi metodi possono causare effetti indiretti sullo sviluppo del tratto intestinale immaturo e del microbioma in via di sviluppo associato. Utilizzando questo protocollo, abbiamo dimostrato che il FEMI indotto dall'LPS si traduce in un aumento dose-dipendente della perdita della gravidanza e della nascita pretermine, nonché in interruzione del normale sviluppo intestinale nella prole. Inoltre, abbiamo dimostrato che il FEMI aumenta significativamente la lesione intestinale e le citochine siere nella prole, riducendo contemporaneamente calice e cellule di Paneth, entrambe forniscono una prima linea di immunità innata contro l'infiammazione intestinale. Sebbene un modello simile di FEMI indotto dall'LPS sia stato utilizzato per modellare l'associazione tra corioamionite e successive anomalie del sistema nervoso centrale, a nostra conoscenza, questo protocollo è il primo a tentare di chiarire un legame meccanicistico tra corioamionite e successive perturbazioni nello sviluppo intestinale come potenziale legame tra corioamninite e NEC.
Introduction
Le membrane corioniche svolgono un ruolo fondamentale nella gravidanza dei mammiferi. Includono il chorion e l'amnion, che servono più funzioni. Circondano e proteggono il feto, facilitano la segnalazione paracrina tra i compartimenti materno efetale 1e creano anelli di feedback locali all'interno delle membrane corioniche, che possono essere coinvolti nell'avvio della parto1. La comprensione attuale delle membrane indica che l'amnione fornisce una funzione di barriera strutturale e il corione fornisce un buffer immunologico principalmente per proteggere il feto in via di sviluppo dal sistema immunitariomaterno 2. L'infiammazione di queste membrane è nota come corioamionite. Storicamente, la diagnosi di corioamionite clinica è stata fatta in seguito alla presenza di febbre materna più uno o più risultati clinici fetali omaterni 3,4. Tuttavia, sebbene questa definizione sia clinicamente utile, la sua mancanza di precisione ha reso difficile la ricerca sulla corioamionite. Nel 2015, nel tentativo di chiarire la diagnosi, un workshop del gruppo di esperti dell'Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development ha definito la corioamniionite come infiammazione intrauterina, o infezione, o entrambi (tripla I)3. Questo chiarimento è importante perché mentre l'infezione indotta microbica è una causa importante di infiammazione uterina / amniotica, si verifica meno comunemente dell'infiammazione uterina / amniotica sterile5,6,7. Nel complesso, la corioamniionite rimane un problema significativo di salute pubblica, come si vede nel 2\u20124% delle consegne a termine e nel 25\u201230% delle consegne pretermine8,9.
La corioamionite può avere effetti significativi sul feto e sul neonato. È stato ben documentato in letteratura che la corioamionite è associata ad un aumento del rischio di molte delle morbilità della prematurità, tra cui la displasia broncopolmonare10,la lesione cerebrale della materia bianca11,l'emorragia intraventricolare12,la retinopatia della prematurità13e la sepsi neonatale ad esordio precoce sospetta e confermata14,15. Poiché siamo interessati a meccanismi di lesione e riparazione del tratto intestinale immaturo, è importante notare che la corioamniionite è anche associata a un successivo sviluppo di enterocolite necrotizzante (NEC)15,16. Il NEC è una devastante malattia gastrointestinale dei neonati pretermine che si traduce in una risposta dell'ospite disregolata all'infiammazione e alla successiva necrosiintestinale 17. Ogni anno, il NEC colpisce oltre 4000 neonati negli Stati Uniti e fino a un terzo di questi neonati muore a causa della malattia18. La patogenesi del NEC probabilmente comporta una combinazione di immaturità intestinale, disregolazione del sistema immunitario immaturo, infiammazione intestinale e traslocazionebatterica 19, che culmina in un ultimo percorso comune di necrosi intestinale. È importante sottolineare che l'insorgenza del NEC si verifica spesso settimane dopo la nascita e la potenziale esposizione alla corioamionite, rendendo poco chiaro il legame meccanicistico tra corioamniionite e successivo sviluppo del NEC20. Un potenziale meccanismo con cui la corioammintite può contribuire alla fisiopatologia del NEC è attraverso l'upregolazione del sistema immunitario materno, producendo successivamente una forte risposta infiammatoria fetale che può interrompere i normali modelli di sviluppofetale 21,22,23.
Nei roditori e nelle pecore esistono più modelli di corioamionite di mammiferi24,25,26,27,28,29,30,31,32. Tuttavia, esistono pochi dati relativi allo sviluppo del tratto intestinale oltre il periodo iniziale appena nato a seguito dell'esposizione fetale indotta dalla corioamnite all'infiammazione materna (FEMI). Al fine di esplorare la relazione tra il FEMI e il successivo sviluppo della lesione del tratto intestinale immaturo, abbiamo adattato il modello FEMI indotto dal lipoppiosaccaride (LPS). I lipopatolisaccaridi sono un componente importante della superficie extracellulare sui batteri gram negativi e sono un potente stimolante del sistema immunitario innato di più specie eucariotiche, compresi gli esseriumani 33. L'iniezione materna di LPS si traduce in una cascata infiammatoria sterile senza gli effetti confondenti dei batteri vivi, ed è un modello ben consolidato per l'induzione della nascita pretermine34, così come un modello di corioamionite acuta e la sindrome da risposta infiammatoria fetale (FIRS), che è la forma più grave di corioamniionite24,35. È stato anche dimostrato che induce lesioni cerebrali di materia bianca e grigia in una pecora modello36 e un murino modello37,38,39,40. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, siamo i primi a utilizzare questo modello di corioamionite e FEMI per indagare i suoi effetti sullo sviluppo del tratto gastrointestinale dopo la nascita, nonché per indagare un possibile legame meccanicistico tra corioamionite e successivo sviluppo di NEC41,42.
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Protocol
Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università dell'Iowa (Protocol #8041401). Tutti gli animali sono stati ospitati in un vivarium approvato dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) presso l'Università dell'Iowa. Tutti i topi erano ceppo di tipo selvatico C57Bl/6J.
1. Istituzione del FEMI nei topi gravidi
- Preparazione LPS
- Utilizzare LPS derivato da Escherichia coli O55:B5 (concentrazione di scorte 2 mg/mL).
- Diluire la concentrazione di materiale LPS 1:100 con salina sterile per una concentrazione di lavoro di 20 μg/mL.
- Iniezione materna di LPS
- Iniettare dighe gravide al giorno di gestazione e15. Questo punto di tempo è di circa il 75% attraverso la gravidanza murina, rendendo questo modello simile allo sviluppo del terzo trimestre precoce delle gravidanze umane, che è quando si verifica la maggior parte delle nascite pretermine a causa della corioamionite.
- Pesare i topi gravidi immediatamente prima dell'iniezione per determinare il dosing LPS appropriato.
- Calcolare la dose di concentrazione di lavoro utilizzando la seguente formula: 5 μL x grammo di peso corporeo (gbw), per una dose totale di LPS di 100 μg/kg. Per controllare gli animali, utilizzare un volume equivalente di soluzione salina normale per iniezione.
- Soluzione Vortex LPS tre volte per 15 secondi in altezza prima di ogni iniezione.
- Redigere il volume LPS in una siringa da 1 ml.
- Trattenere il topo incinta con la tecnica dello scruffing. Tenere premuto in posizione di reclinamento dorsale ed eseguire l'iniezione.
- Inserire un ago da 30 gauge da 8 mm che si smussa sovrascriva il quadrante inferiore destro dell'addome (per evitare vesciche e vasi addominali) con un angolo di 30\u201240°. Inserire circa 1/4 a 1/2 della lunghezza dell'ago.
- Tirare indietro sullo stantuffo della siringa per garantire una pressione negativa prima dell'iniezione. Procedere con l'iniezione se è presente una pressione negativa.
- Dopo l'iniezione, monitorare i topi per circa 30 minuti e quindi tornare in gabbia per il resto della gravidanza.
2. Consegna e cura della prole e raccolta intestinale
- Consegnare i cuccioli normalmente tramite parto vaginale a e20.
NOTA: Questo modello ha un tasso di perdita fetale dose-dipendente previsto che può essere visto nella figura 1 ed è discusso nei risultati seguenti. - Consenti ai cuccioli di rimanere con le madri e ricevere mangimi ad libitum.
- Il giorno della raccolta, tipicamente postnatale giorno 14 (P14), eutanasia i cuccioli tramite lussazione cervicale in conformità con i protocolli del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
- Usando forbici e forcette, fai un'incisione verticale lungo la linea mediana dell'addome, attraverso la pelle e il peritoneo, per l'intera lunghezza dell'addome. Asportare l'intestino tenue dallo stomaco al cieco con le forbici e rimuovere il mesentere con le forcep.
- Isolare e mantenere il distale 1/3 dell'intestino tenue (sezione rappresentativa dell'ileo umano), scartando l'intestino tenue prossimale, il cieco e il colon.
- Dividere la porzione di ileo a metà usando le forbici.
- Posizionare la metà prossimale in una soluzione di stabilizzazione dell'RNA per una successiva quantificazione dell'RNA.
- Posizionare la metà distale in formalina tamponata neutra al 10% per la preparazione dello scivolo.
3. Punteggio lesioni intestinali
- Sezionare il tessuto incorporato di paraffina in fette spesse 5 μm e montare su vetrini.
NOTA: Inviamo gli esemplari a un nucleo istologico per l'incorporamento, la sessatura e il montaggio di paraffina su diapositive. - Deparaffinizzare le diapositive secondo procedure standard.
- Sezioni di macchie con ematossilina ed eosina secondo procedure standard.
- Partitura di sezioni su una scala a 3 punti per lesioni intestinali come descrittoin precedenza 42,43.
- Utilizzando la microscopia ottica, valutare la lesione intestinale generalizzata da parte di due investigatori accecati separati su una scala a 3 punti che valuta l'integrità del villus e la separazione dalla membranabasale 43 (Figura complementare 1). La lesione intestinale è valutata al meglio con ingrandimento 20x e apertura numerica 0,50.
- Assegnare un punteggio di 0 per descrivere la mucosa normale.
- Assegnare un punteggio di 1 descrivere lesioni lievi che comprendono lo sviluppo dello spazio subepiteliale di Gruenhagen, la vacuolizzazione o il sollevamento subepiteliale limitato alla lamina propria o alle punte dei villi.
- Assegnare un punteggio di 2 per descrivere lesioni gravi, indicate dal sollevamento epiteliale e dalla vacuolizzazione superiore alla metà dei villi, distorsione villi o ulcerazione mucosa e disintegrazione della lamina propria.
4. Quantificazione delle cellule di Paneth e calice
- A seguito della deparaffinizzazione, le diapositive di macchie di sezioni tissutali del passaggio 2.8 con macchia di Schiff blu/acido periodico alciano per indicare sia il calice che le cellule di Panethcome descritto in precedenza 44,45 secondo i seguenti passaggi.
NOTA: Mentre la macchia di Schiff alcian Blue /Periodic Acid non è specifica né per le cellule paneth né per le cellule di calice, nella nostra esperienza, gli investigatori esperti accecati hanno una quantificazione cellulare equivalente utilizzando questa macchia rispetto agli anticorpi mirati cellulari, con una colorazione di fondo significativamenteinferiore 46. - Deparaffinizzare, macchiare e disidratare le diapositive come segue.
- Immergere gli scivoli in xilene per 10 minuti due volte.
ATTENZIONE: Lo xilene deve essere usato in una cappa aspirante. - Risciacquare con EtOH al 100%.
- Immergere le diapositive in EtOH al 100 % per 3 minuti, quindi in EtOH al 90% per 3 minuti, seguite da EtOH al 70% per 3 minuti, e infine immergere le diapositive nel 50% di EtOH per 3 minuti.
- Lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 5 minuti.
ATTENZIONE: Puntaree la sezione dall'acqua corrente per evitare la perdita del campione di tessuto. - Filtrare la soluzione di macchia blu alciana con un filtro da caffè standard.
- Le macchie scivolano nella macchia blu alciana per 15 minuti e quindi lavano sotto l'acqua corrente del rubinetto per 2 minuti.
- Diluire 1 mg di acido periodico in 200 mL di acqua distillata doppia. Immergere le diapositive in questa soluzione per 5 minuti. Quindi lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 1 minuto.
- Macchiare con il reagente di Schiff per 10 minuti. Lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 5 minuti.
- Colla gli scivoli con ematossilina per 1 minuto e quindi lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 2 minuti.
- Immergerli nell'alcole acido (1 mL di acido cloridrico miscelato in 99 mL del 70% di EtOH) per 1 min.
- Immergere nell'acqua del rubinetto di Scott (concentrazione dello 0,1% di NaHCO3 nell'acqua del rubinetto) per 1 minuto e quindi lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 1 minuto.
- Disidratare le diapositive.
- Immergere ogni diapositiva 10 volte in 70% EtOH, quindi immergere 10 volte in 90% EtOH e 10 volte in EtOH al 100%.
- Immergere le diapositive in EtOH al 100% per 10 minuti, seguite da immergersi due volte in xilene fresco per 3 minuti ciascuna.
- Posizionare una goccia di supporto di montaggio sul campione e posizionare una coverlip su di esso.
- Immergere gli scivoli in xilene per 10 minuti due volte.
- Conteggio delle celle di Calice
- Utilizzando la microscopia ottica, contare le cellule del calice (Figura complementare 2). Per ogni pezzo di tessuto intestinale, contare il numero di cellule calici e 500 cellule epiteliali e esprimere il rapporto cellulare del calice come rapporto per 100 cellule epiteliali. Le celle di calice sono conteggiate al meglio con ingrandimento 20x e apertura numerica 0,5.
- Conteggio delle celle di Paneth
- Utilizzando la microscopia ottica, contare le celle di Paneth (Figura complementare 2). Per ogni pezzo di tessuto intestinale, esprimere come un rapporto di cellule paneth per cripta intestinale. Conta 100 cripte intestinali per ogni pezzo di tessuto intestinale. Le celle paneth sono conteggiate al meglio con ingrandimento 20x-60x e apertura numerica 0,50-1,30.
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Representative Results
L'esposizione al FEMI il giorno 15 embrionale porta ad una perdita di gravidanza dose-dipendente e ad un'intensità dose-dipendente di lavoro pretermine (Figura 1)42. Per gli esperimenti, abbiamo scelto di utilizzare una dose LPS di 100 μg /kg per ridurre al minimo la perdita di gravidanza e la prematurità (perdita del 50% sia tra prematurità che per scomparsa fetale intrauterina) esponendo i feti a un significativo insulto infiammatorio.
Utilizzando questo approccio, abbiamo poi esaminato gli effetti del FEMI sulla successiva lesione della prole. Utilizzando una scala istologica a 3 punti per misurare la lesione intestinale generalizzata, abbiamo riscontrato lesioni significative alla nascita (P0) e all'età adulta (P56 o 8 settimane di vita)(Figura 2). È importante notare che questa lesione si è verificata in assenza di ulteriori stimoli agli animali diversi dal FEMI, suggerendo che il FEMI da solo interrompe la normale omeostasi del tratto intestinale murino appena nato. Poiché il topo nasce con un intestino relativamente immaturo che continua a svilupparsi durante le prime 4 settimane di vita47,48, questo è rilevante per i neonati pretermine che hanno anche tratti intestinali immaturi.
Per comprendere ulteriormente l'effetto del FEMI sia sul normale sviluppo dell'epitelio intestinale che sui meccanismi di difesa del tratto intestinale immaturo, abbiamo quantificato il numero di cellule calici che producono mucina e cellule paneth che producono peptidi antimicrobici nel terzo distale del piccolo tratto intestinale che è simile all'ileo umano. La Corte ha riscontrato che il FEMI ha interrotto la normale composizione dell'epitelio intestinale inducendo la perdita sia delle cellule del calice che delle cellule paneth rispetto agli animali senza FEMI(Figura 3).
Per studiare gli effetti del FEMI sulla risposta infiammatoria neonatale, utilizzando ELISA con elettrochimica, abbiamo quantificato una varietà di marcatori infiammatori sieri, che includevano IL-1β, IL-10, KC-GRO (l'equivalente murino di IL-8), e IL-6, dal siero dei cuccioli con e senza FEMI(Figura 4). Abbiamo scoperto che il FEMI ha aumentato significativamente la cascata infiammatoria per tutte le citochine in P0. La cascata infiammatoria in età successive (P7\u2012P56) differiva in base al punto di tempo e alla citochina. La cosa più interessante è che, per IL-6, c'erano livelli simili a P7\u2012P28 nei gruppi FEMI e sham, ma nonostante nessun intervento secondario, c'erano livelli significativamente più alti nel gruppo FEMI a P56. Ciò è particolarmente importante in quanto abbiamo dimostrato che IL-6 è una citochina critica per lo sviluppo di lesioni intestinali postnatali nel modello FEMI.
Figura 1: Effetto della dose femi sugli esiti della gravidanza. La sopravvivenza delle cucciolate di gravidanza dipende dalla dose con dosi più elevate che causano tassi più elevati di perdita della gravidanza (A) e tassi più elevati di parto prematuro (B). La figura è adattata con il permesso di Fricke et al42. Il FEMI che utilizza una dose LPS di 100 μg/kg crea una sopravvivenza del 50% per i cuccioli entro una settimana di vita. Ogni punto dati è rappresentativo di un numero > 8 gravidanze e almeno tre esperimenti individuali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetto del FEMI sui piccoli modelli di lesioni intestinali distali nel tempo. Campioni intestinali sono stati raccolti alla nascita, 1 settimana di vita, 2 settimane di vita e 8 settimane di vita da topi esposti al FEMI (100 μg / kg di LPS) o al controllo fittizio. I campioni sono stati segnati utilizzando una scala di lesioni da 3 punti dagli investigatoriaccecati 42,43. La FEMI da sola senza ulteriori insulti ha indotto una quantità significativa di lesioni alla nascita, 1 settimana di vita e 8 settimane di vita. La figura è stata adattata con il permesso di Fricke etal. Ogni punto dati è rappresentativo di un numero > 10 cuccioli e di almeno tre esperimenti individuali da almeno 3 dighe gravide. Il test T non parametrico mann-whitney è stato utilizzato per confrontare i punteggi delle lesioni intestinali ad ogni punto di tempo. L'asterisco indica p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il FEMI induce alterazioni delle normali quantità di calici e cellule paneth nell'intestino tenue durante lo sviluppo. Campioni intestinali sono stati raccolti alla nascita, 1, 2, 4 e 8 settimane di vita da topi esposti al FEMI (100 μg/ kg di LPS) o al controllo fittizio. I campioni sono stati macchiati con macchia di Schiff blu/acido periodico alciano per rilevare sia le cellule di calice che di Paneth e questi sono stati quantificati da un investigatore accecato. Sia le cellule di calice che le cellule paneth di animali con FEMI hanno mostrato una tendenza o una diminuzione significativa rispetto ai controlli fittizi a tutte le età. Figura adattata con il permesso di Elgin etal. Ogni punto dati è rappresentativo di un > 10 cuccioli e almeno tre esperimenti individuali. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Il test T degli studenti è stato utilizzato per confrontare quantità di goblet e celle Paneth in ogni momento. L'asterisco indica p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il FEMI induce un'impennata infiammatoria neonatale globale per tutte le citochine immediatamente dopo la nascita a P0, con un'impennata tardiva di IL-6 a P56. Le citochine siere sono state quantificate in P0, P7, P14 e P28 utilizzando ELISA con elettrochimica in base alle istruzioni del produttore e le piastre sono state lette a 620 nm. I valori delle citochine sono rappresentati qui in un grafico radar, e tutte le citochine sono tracciate come percentuale del valore massimo. Vi sono stati aumenti significativi in tutte le citochine (IL-1β, IL-10, KC-GRO e IL-6) a P0 nel gruppo FEMI rispetto al gruppo di controllo (tutti p < 0,05). C'è stato anche un aumento resurgente dei livelli di IL-6 a P56 nei cuccioli con FEMI rispetto a nessun FEMI (p < 0,05 da test Kruskal-Wallis non parametrici), che era l'unica citochina che era significativamente elevata nel gruppo FEMI rispetto al controllo in questo momento tardivo. Figura adattata con il permesso di Elgin etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura complementare 1: Punteggio di lesioni intestinali del tessuto ileale macchiato H&E. I punteggi delle lesioni sono determinati da una scala di punteggio di lesione intestinale di tre punti (0 = normale, 1 = lesione lieve, 2 = lesione grave) in base al grado di vacuolizzazione dei villi, ulcerazione della mucosa, danno alla lamina propria e presenza di emorragia all'interno di villi comedescritto in precedenza 43. Figura adattata con il permesso di Elgin etal. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 2: Aspetto rappresentativo della colorazione Alcian Blue/PAS delle cellule di calice e Paneth. La colorazione Alcian Blue/PAS dei tessuti intestinali consente una chiara visualizzazione delle cellule del calice, presenti nei villi intestinali (pannello superiore contrassegnato da frecce bianche, immagine scattata a ingrandimento 20x), e nelle cellule di Paneth, presenti nelle cripte di Lieberkuhn, situate sotto i villi intestinali nella lamina propria (pannello inferiore contrassegnato con frecce gialle, immagine scattata con ingrandimento 60x). Clicca qui per scaricare questa cifra.
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Discussion
La corioamniionite ha un impatto sul 2\u20124% del termine e sul 25\u201230% delle consegne pretermine8,9. Tuttavia, l'impatto della corioamionite può estendersi a lungo oltre la nascita in quanto ha dimostrato di avere effetti significativi sul feto e sul neonato10,11,12,13,14,15,16. È importante sottolineare che la corioamionite ha dimostrato di essere associata al successivo sviluppo di NEC15,16. Sebbene sia ancora incompletamente compresa, la patogenesi del NEC probabilmente comporta una combinazione di immaturità intestinale, disregolazione del sistema immunitario immaturo, infiammazione intestinale e traslocazione batterica, che culmina in una via comune finale di necrosi intestinale19. Tuttavia, un legame meccanicistico tra la corioamionite e il successivo sviluppo del NEC rimane poco chiaro20e i precedenti modelli animali di corioamniionite non sono stati sufficienti per esaminare questa relazione. Per colmare questo divario di conoscenza, abbiamo modificato il modello murino comunemente usato indotto da LPS di corioamionite e nascita pretermine34,37,38,39,40 per consentire la nascita neonatale e la sopravvivenza. In questo modo, abbiamo creato un modello che approssima la condizione infiammatoria osservata nella corioamniionite42 per studiare l'impatto dell'esposizione fetale all'infiammazione materna (FEMI) sul successivo sviluppo intestinale.
Con questo protocollo, abbiamo dimostrato che questo modello murino di corioamionite, utilizzando FEMI indotta da LPS, si traduce in lesioni intestinali sia a breve che a lungo termine e interruzione del normale sviluppo intestinale, in particolare la downregulation delle cellule di calice e paneth, che forniscono entrambe una prima linea di immunità innata contro l'infiammazione intestinale. La lesione intestinale e i cambiamenti cellulari istologici osservati con questo modello indicano che è un modello efficace per imitare la lesione osservata nel NEC. Ciò è dovuto principalmente al fatto che la downregolazione delle cellule paneth e delle cellule del calice è stata entrambe implicate nella patogenesi del NEC, e i modelli di lesione istologica sono simili a quelli osservati nei casi umani di NEC41,42,49. Pertanto, questo modello FEMI indotto da LPS di corioamionite è un modello ideale per indagare il legame meccanicistico tra corioamionite e successiva lesione intestinale, in particolare lo sviluppo di NEC, così come i potenziali effetti della corioamionite sul microbioma in via di sviluppo, che non sarebbe possibile con i modelli esistenti che utilizzano batteri vivi.
In vivo, la corioamniionite spesso comporta un'infezione batterica ascendente che spesso si traduce in rottura pretermine delle membrane e del fenotipo clinico della corioamionite, e esistono modelli animali di corioamionite che riflettono più accuratamente questa fisiopatologia25,28,30,32. Tuttavia, poiché il nostro laboratorio studia lo sviluppo intestinale, incluso il microbioma in via di sviluppo, la presenza di batteri vivi in un modello di corioamionite confonderebbe l'analisi del microbioma. Pertanto, i modelli esistenti di corioamniionite che utilizzano batteri vivi non sono pratici per indagare il legame meccanicistico tra corioamionite e successivo sviluppo del NEC. Inoltre, i modelli di corioamionite indotti da LPS sono già stati efficaci nella modellazione della lesione cerebrale postnatale di materia bianca egrigia 36, dimostrando che questo metodo è un modo efficace per modellare le morbilità della prematurità associate all'esposizione alla corioamionite al momento della nascita.
È anche importante notare che questo modello dipende fortemente dalla dose di LPS utilizzata per indurre il FEMI. Il primo passo critico in questo protocollo è l'induzione del FEMI nelle dighe gravide con iniezione intraperitoneale di LPS; pertanto, non sorprende che la dose di LPS utilizzata per indurre il FEMI sia estremamente importante nei risultati di questi esperimenti. Con gli esperimenti iniziali, è stata utilizzata una dose di 100 μg/kg di LPS, poiché questa dose di LPS non era associata alla mortalità materna e ha portato a circa il 50% di sopravvivenza neonatale e a lesioni intestinali significative nellaprole 41,42.
LPS si lega al complesso del recettore simile a Toll 4 (TLR4), con conseguente aggregazione di proteine di segnalazione intracellulare, produzione di citochine e l'inizio della segnalazione pro-infiammatoria50. I recettori simili a pedaggio (TLRR) tra cui TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 e TLR9 sono importanti nell'induzione della risposta infiammatoria che si vede con una varietà di agenti patogeni e microrganismi come virus, batteri e funghi51. È interessante notare che l'upregolazione della TLR3 ha anche dimostrato di essere correlata con l'aumento del danno intestinale istologico e lo spargimento virale in un modello di rotavirus murino neonatale; inoltre, il knockout di TLR3 ha migliorato questi effetti52. Pertanto, mentre il modello fa uso di percorsi TLR4, è ragionevole presumere che la stimolazione di altri TLR possa conferire risultati simili.
Utilizzando questa metodologia, siamo stati in grado di dimostrare che l'iniezione di LPS nelle dighe gravide causa aumenti nei marcatori infiammatori materni, placentari e fetali risparmiando il liquido amniotico, oltre a indurre danni diretti alla placenta42. È interessante notare che questa metodologia non ha mostrato alterazioni della resistenza nelle arterie uterine. Il modello FEMI ha anche un impatto significativo sulla prole in quanto abbiamo dimostrato che i cuccioli esposti hanno una lesione intestinalesignificativa 42 attraverso una via dipendente IL-641 e possono avere un impatto su importanti meccanismi di difesa dell'intestino come le cellule del calice e le cellule di Paneth41. Questa lesione rende la prole neonatale sempre più suscettibile alle successive lesioni intestinali indotte da LPSe all'infiammazione 41 che possono spiegare perché i bambini esposti alla corioamniionite hanno una maggiore suscettibilità allo sviluppo del NEC.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte attraverso il National Institutes of Health (DK097335 & T32AI007260) e il Dipartimento di Pediatria della Famiglia Stead dell'Università dell'Iowa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| Alcian blue stain | Newcomer supply | 1003A | |
| C57Bl6/J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| Ethanol | Decon labs | 2701 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| Hematoxylin stain | Leica | 381562 | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Nikon Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 2CE-MQVJ-1 | |
| Periodic Acid | ACROS | H5106 | CAS# 10450-59-9 |
| RNAlater | Thermofisher | Am7021 | |
| Schiff's reagent | Sigma | S5133 | |
| Secor Imager 2400 | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| V-Plex Assay | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| Xylene | Sigma | 534056 |
References
- Myatt, L., Sun, K. Role of fetal membranes in signaling of fetal maturation and parturition. International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 545-553 (2010).
- Verbruggen, S. W., Oyen, M. L., Phillips, A. T., Nowlan, N. C. Function and failure of the fetal membrane: Modelling the mechanics of the chorion and amnion. PLoS One. 12 (3), 0171588 (2017).
- Higgins, R. D., et al. Evaluation and Management of Women and Newborns With a Maternal Diagnosis of Chorioamnionitis: Summary of a Workshop. Obstetrics & Gynecology. 127 (3), 426-436 (2016).
- Peng, C. C., Chang, J. H., Lin, H. Y., Cheng, P. J., Su, B. H. Intrauterine inflammation, infection, or both (Triple I): A new concept for chorioamnionitis. Pediatrics and Neonatology. 59 (3), 231-237 (2018).
- Romero, R., et al. Prevalence and clinical significance of sterile intra-amniotic inflammation in patients with preterm labor and intact membranes. American Journal of Reproductive Immunology. 72 (5), 458-474 (2014).
- Romero, R., et al. Sterile intra-amniotic inflammation in asymptomatic patients with a sonographic short cervix: prevalence and clinical significance. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal. , 1-17 (2014).
- Romero, R., et al. Sterile and microbial-associated intra-amniotic inflammation in preterm prelabor rupture of membranes. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 28 (12), 1394-1409 (2015).
- Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
- Erdemir, G., et al. Histological chorioamnionitis: effects on premature delivery and neonatal prognosis. Pediatrics and Neonatology. 54 (4), 267-274 (2013).
- Metcalfe, A., Lisonkova, S., Sabr, Y., Stritzke, A., Joseph, K. S. Neonatal respiratory morbidity following exposure to chorioamnionitis. BMC Pediatrics. 17 (1), 128 (2017).
- Anblagan, D., et al. Association between preterm brain injury and exposure to chorioamnionitis during fetal life. Scientific Reports. 6, 37932 (2016).
- Villamor-Martinez, E., et al. Corrigendum: Chorioamnionitis Is a Risk Factor for Intraventricular Hemorrhage in Preterm Infants: A Systematic Review and Meta-Analysis. Frontiers in Physiology. 10, 102 (2019).
- Villamor-Martinez, E., et al. Chorioamnionitis as a risk factor for retinopathy of prematurity: An updated systematic review and meta-analysis. PLoS One. 13 (10), 0205838 (2018).
- Randis, T. M., et al. Incidence of early-onset sepsis in infants born to women with clinical chorioamnionitis. Journal of Perinatal Medicine. 46 (8), 926-933 (2018).
- Rodrigo, F. G. M., Henriquez F, G. G., Aloy, F. J., Perez, G. A. A. Outcomes of very-low-birth-weight infants exposed to maternal clinical chorioamnionitis: a multicentre study. Neonatology. 106 (3), 229-234 (2014).
- Been, J. V., Lievense, S., Zimmermann, L. J., Kramer, B. W., Wolfs, T. G. Chorioamnionitis as a risk factor for necrotizing enterocolitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Pediatrics. 162 (2), 236-242 (2013).
- Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: modeling the innate immune response. American Journal of Pathology. 185 (1), 4-16 (2015).
- Fitzgibbons, S. C., et al. Mortality of necrotizing enterocolitis expressed by birth weight categories. Journal of Pediatric Surgery. 44 (6), 1075-1076 (2009).
- Vongbhavit, K., Underwood, M. A. Prevention of Necrotizing Enterocolitis Through Manipulation of the Intestinal Microbiota of the Premature Infant. Clinical Therapeutics. 38 (4), 716-732 (2016).
- Yee, W. H., et al. Incidence and timing of presentation of necrotizing enterocolitis in preterm infants. Pediatrics. 129 (2), 298-304 (2012).
- Gantert, M., et al. Chorioamnionitis: a multiorgan disease of the fetus. Journal of Perinatology. 30, 21-30 (2010).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Yamada, N., et al. Histological severity of fetal inflammation is useful in predicting neonatal outcome. Placenta. 36 (12), 1490-1493 (2015).
- Wolfe, K. B., et al. Modulation of lipopolysaccharide-induced chorioamnionitis in fetal sheep by maternal betamethasone. Reproductive Sciences. 20 (12), 1447-1454 (2013).
- Normann, E., et al. A novel mouse model of Ureaplasma-induced perinatal inflammation: effects on lung and brain injury. Pediatric Research. 65 (4), 430-436 (2009).
- Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis: unraveling causes of adverse neurological outcomes. Reproductive Sciences. 18 (9), 900-907 (2011).
- Dell'Ovo, V., et al. An animal model for chorioamnionitis at term. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 387 (2015).
- Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. Journal of Infectious Diseases. 210 (2), 265-273 (2014).
- Breen, K., et al. TLR-4-dependent and -independent mechanisms of fetal brain injury in the setting of preterm birth. Reproductive Sciences. 19 (8), 839-850 (2012).
- Burd, I., Balakrishnan, B., Kannan, S. Models of fetal brain injury, intrauterine inflammation, and preterm birth. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (4), 287-294 (2012).
- Agrawal, V., et al. Role of Notch signaling during lipopolysaccharide-induced preterm labor. Journal of Leukocyte Biology. 100 (2), 261-274 (2016).
- Filipovich, Y., Klein, J., Zhou, Y., Hirsch, E. Maternal and fetal roles in bacterially induced preterm labor in the mouse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 214 (3), 381-389 (2016).
- Alexander, C., Rietschel, E. T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. Journal of Endotoxin Research. 7 (3), 167-202 (2001).
- McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: suggested assessment and reporting guidelines. Biology of Reproduction. 99 (5), 922-937 (2018).
- Rueda, C. M., et al. Lipopolysaccharide-Induced Chorioamnionitis Promotes IL-1-Dependent Inflammatory FOXP3+ CD4+ T Cells in the Fetal Rhesus Macaque. Journal of Immunology. 196 (9), 3706-3715 (2016).
- Gavilanes, A. W., et al. Chorioamnionitis induced by intraamniotic lipopolysaccharide resulted in an interval-dependent increase in central nervous system injury in the fetal sheep. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 200 (4), 431-438 (2009).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 881-897 (2010).
- Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 10 (11), 643-660 (2014).
- Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain, Behavior, and Immunity. 31, 54-68 (2013).
- Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
- Elgin, T. G., et al. Fetal exposure to maternal inflammation interrupts murine intestinal development and increases susceptibility to neonatal intestinal injury. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Fricke, E. M., et al. Lipopolysaccharide-induced maternal inflammation induces direct placental injury without alteration in placental blood flow and induces a secondary fetal intestinal injury that persists into adulthood. American Journal of Reproductive Immunology. 79 (5), 12816 (2018).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2627-2635 (2016).
- Brown, K. S., et al. Tumor necrosis factor induces developmental stage-dependent structural changes in the immature small intestine. Mediators of Inflammation. 2014, 852378 (2014).
- McElroy, S. J., et al. The ErbB4 ligand neuregulin-4 protects against experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Pathology. 184 (10), 2768-2778 (2014).
- McElroy, S. J., et al. Tumor necrosis factor receptor 1-dependent depletion of mucus in immature small intestine: a potential role in neonatal necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (4), 656 (2011).
- Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. , (2019).
- McElroy, S. J., Weitkamp, J. H. Innate Immunity in the Small Intestine of the Preterm Infant. NeoReviews. 12 (9), 517-526 (2011).
- McElroy, S. J., Underwood, M. A., Sherman, M. P. Paneth cells and necrotizing enterocolitis: a novel hypothesis for disease pathogenesis. Neonatology. 103 (1), 10-20 (2013).
- Park, B. S., Lee, J. O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes. Experimental & Molecular Medicine. 45, 66 (2013).
- Lester, S. N., Li, K. Toll-like receptors in antiviral innate immunity. Journal of Molecular Biology. 426 (6), 1246-1264 (2014).
- Pott, J., et al. Age-dependent TLR3 expression of the intestinal epithelium contributes to rotavirus susceptibility. PLOS Pathogens. 8 (5), 1002670 (2012).
