Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تلطيخ قائم على الأنسجة باستخدام أقسام الأنسجة العائمة الحرة

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61622
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1George & Anne Ryan Institute for Neuroscience, College of Pharmacy, Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, University of Rhode Island, 2Department of Neuroscience, Biomedicum, Karolinska Institutet

Summary

تسمح تقنية الطفو الحر للباحثين بإجراء تلطيخ قائم على الأنسجة بما في ذلك الكيمياء المناعية على أقسام الأنسجة الثابتة لتصور الهياكل البيولوجية ونوع الخلية وتعبير البروتين وتوطينه. هذه تقنية كيميائية نسيجية فعالة وموثوقة يمكن أن تكون مفيدة لفحص العديد من الأنسجة ، مثل الدماغ والقلب والكبد.

Abstract

الكيمياء الهيستولوجية المناعية هي تقنية تستخدم على نطاق واسع لتصور هياكل أنسجة معينة بالإضافة إلى تعبير البروتين وتوطينه. يتم استخدام طريقتين بديلتين على نطاق واسع للتعامل مع أقسام الأنسجة أثناء إجراء التلوين ، ويتكون أحد الأساليب من تركيب الأقسام مباشرة على شرائح زجاجية ، بينما يسمح النهج الثاني ، وهو الطفو الحر ، بالحفاظ على الأقسام الثابتة وتلطيخها أثناء تعليقها في المحلول. على الرغم من أن النهج المثبتة على الشرائح والعائمة الحرة قد تسفر عن نتائج مماثلة ، إلا أن تقنية الطفو الحر تسمح باختراق أفضل للأجسام المضادة ، وبالتالي يجب أن تكون الطريقة المفضلة عند استخدام أقسام أكثر سمكا لإعادة بناء الأنسجة 3D ، على سبيل المثال عندما يكون تركيز التجربة هو الحصول على معلومات حول الإسقاطات المتغصنة والمحورية في مناطق الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن الأقسام يتم الاحتفاظ بها في محلول ، يمكن أن تستوعب القسمة الواحدة بسهولة من 30 إلى 40 قسما ، والتعامل معها أقل شاقة ، لا سيما في الدراسات الطبية الحيوية واسعة النطاق. هنا ، نوضح كيفية تطبيق طريقة الطفو الحر على تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية ، مع التركيز بشكل كبير على أقسام الدماغ. سنناقش أيضا كيف يمكن بسهولة تعديل تقنية الطفو الحر لتناسب الاحتياجات الفردية للباحثين وتكييفها مع الأنسجة الأخرى بالإضافة إلى البقع الكيميائية النسيجية الأخرى ، مثل الهيماتوكسيلين والإيوزين والكريسيل البنفسجي ، طالما أن عينات الأنسجة ثابتة بشكل صحيح ، عادة باستخدام بارافورمالدهيد أو الفورمالين.

Introduction

Immunostaining هي ممارسة بحثية شائعة بدأت منذ 130 عاما باكتشاف الأجسام المضادة في المصل في عام 1890 بواسطة Von Behring1. خلالأوائل القرن العشرين ، تم ربط الأصباغ بالمستضدات وبعد ذلك بالأجسام المضادة كوسيلة لتحديد وتصور التفاعلات1 ، وفي عام 1941 طور ألبرت كونز أول تسميات الأجسام المضادة الفلورية ، وهو اكتشاف أحدث ثورة في الفحص المجهري الضوئي 2,3. يشمل مصطلح "التلوين المناعي" العديد من التقنيات التي تم تطويرها باستخدام هذا المبدأ ، بما في ذلك اللطخة الغربية ، وقياس التدفق الخلوي ، و ELISA ، والكيمياء المناعية ، والكيمياء المناعية 3,4. لطخة غربية تكتشف وجود بروتينات معينة من مستخلصات الأنسجة أو الخلايا5. يتم فصل البروتينات حسب الحجم باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي ، ونقلها إلى غشاء ، وفحصها باستخدام الأجسام المضادة. تشير هذه التقنية إلى وجود البروتين وكمية البروتين الموجودة ؛ ومع ذلك ، فإنه لا يكشف عن أي معلومات عن توطين البروتين داخل الخلايا أو الأنسجة. طريقة أخرى ، الكيمياء المناعية (ICC) ، تسمي البروتينات داخل الخلايا ، وعادة ما تكون الخلايا المزروعة في المختبر. يظهر ICC كلا من تعبير البروتين وتوطينه داخل المقصورات الخلوية6. للكشف عن بروتين معين وتصوره على مستوى الأنسجة ، يتم استخدام الكيمياء المناعية (IHC).

IHC هي طريقة يستخدمها الباحثون لاستهداف مستضدات معينة داخل الأنسجة ، والاستفادة من الخصائص الكيميائية للجهاز المناعي 7,8. من خلال توليد أجسام مضادة أولية وثانوية محددة مرتبطة إما بإنزيم أو صبغة فلورية ، يمكن تسمية المستضدات ذات الأهمية والكشف عنها في معظم الأنسجة (كما تمت مراجعتها في Mepham and Britten)9. مصطلح "الكيمياء الهيستولوجية المناعية" في حد ذاته لا يحدد طريقة وضع العلامات المستخدمة للكشف عن المستضد محل الاهتمام. وبالتالي ، غالبا ما يتم دمج هذه المصطلحات مع تقنية الكشف لتحديد طريقة وضع العلامات بوضوح: الكيمياء المناعية الكروموجينية (CIH) للإشارة إلى متى يقترن الجسم المضاد الثانوي بإنزيم ، مثل البيروكسيداز. أو IHC الفلوري للإشارة إلى وقت اقتران الجسم المضاد الثانوي بالفلوروفور ، مثل فلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) أو رباعي ميثيل رودامين (TRITC). تسمح انتقائية IHC للأطباء والباحثين بتصور تعبير البروتين وتوزيعه في جميع أنحاء الأنسجة ، عبر حالات مختلفة من الصحة والمرض10. في المجال السريري ، يستخدم IHC بشكل شائع لتشخيص السرطان ، وكذلك لتحديد الاختلافات في أنواع مختلفة من السرطان. كما تم استخدام IHC لتأكيد أنواع مختلفة من الالتهابات الميكروبية داخل الجسم ، مثل التهاب الكبد B أو C11. في الأبحاث الطبية الحيوية ، غالبا ما تستخدم IHC لرسم خريطة تعبير البروتين في الأنسجة وهي مهمة في تحديد البروتينات غير الطبيعية التي تظهر في حالات المرض. على سبيل المثال ، غالبا ما يصاحب التنكس العصبي تراكم بروتينات غير طبيعية في الدماغ ، مثل لويحات Αβ والتشابك العصبي الليفي في مرض الزهايمر. غالبا ما يتم تطوير النماذج الحيوانية لتقليد هذه الحالات المرضية ، و IHC هي إحدى الطرق التي يستخدمها الباحثون لتحديد وقياس البروتينات ذات الأهمية10،12،13. في المقابل ، يمكننا معرفة المزيد عن أسباب هذه الأمراض ، والمضاعفات التي تنشأ معها.

هناك العديد من الخطوات المتضمنة في أداء المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. أولا ، يتم جمع الأنسجة ذات الأهمية وإعدادها للتلطيخ. يمكن القول إن معظم الباحثين يعدون عينات الأنسجة الثابتة ، مع تروية المثبت عبر الدورة الدموية كونها الأمثل لأنها تحافظ على مورفولوجيا14,15. يمكن أيضا استخدام ما بعد تثبيت عينات الأنسجة ولكنها قد تسفر عن نتائج أقل من المثالية16. تعمل المثبتات المتشابكة ، مثل الفورمالديهايد ، عن طريق إنشاء روابط كيميائية بين البروتينات في الأنسجة17. ثم يتم تقطيع الأنسجة الثابتة إلى طبقات أو أقسام رقيقة جدا باستخدام ميكروتوم ، حيث يفضل العديد من الباحثين جمع الأقسام المجمدة باستخدام cryostat. من هناك يتم جمع الأنسجة وإما تركيبها مباشرة على شريحة مجهرية (طريقة مثبتة على شريحة) ، أو تعليقها في محلول (طريقة عائمة حرة) ، مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)18. يتم تحديد طريقة الجمع المستخدمة مسبقا بناء على احتياجات الباحث ، حيث تقدم كل من هاتين الطريقتين مزاياها وعيوبها.

الطريقة المثبتة على الشريحة هي الأكثر استخداما إلى حد بعيد ، مع فائدة مهمة تتمثل في أنه يمكن تحضير أقسام رقيقة جدا (10-14 ميكرومتر) ، وهو أمر مهم ، على سبيل المثال ، للتحقيق في تفاعلات البروتين والبروتين. هناك أيضا الحد الأدنى من التعامل مع العينة ، مما يقلل من الضرر المحتمل للسلامة الهيكلية للأنسجة19. غالبا ما يستخدم الباحثون هذه التقنية مع الأنسجة المجمدة الطازجة (الأنسجة التي يتم تجميدها على الفور باستخدام الثلج الجاف ، الأيزوبنتان ، إلخ) ، وهي حساسة للغاية مقارنة بالأنسجة الثابتة ويجب توخي الحذر الشديد لمنع ذوبان العينة. ميزة أخرى لاستخدام المقاطع المثبتة على الشرائح هي أن كميات كبيرة من حلول التلوين عادة ما تكون غير مطلوبة4. وبالتالي ، يمكن للباحثين استخدام كمية أقل من الأجسام المضادة باهظة الثمن أو المواد الكيميائية الأخرى لإكمال البقعة. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن تركيب أقسام من عدة مجموعات تجريبية مختلفة على نفس الشريحة ، والتي يمكن أن تكون مفيدة ، خاصة أثناء الحصول على الصور. من ناحية أخرى ، هناك بعض عيوب استخدام الأقسام المثبتة على الشريحة ، وأبرزها أن قسم الأنسجة ملتصق بالشريحة وبالتالي يحد من اختراق الأجسام المضادة إلى جانب واحد من القسم ، مما يحد من سمك القسم وتمثيل 3D للأنسجة. يمكن أن يحدث أيضا أنه أثناء الغسيل ، قد تنفصل حواف الأنسجة والأقسام بأكملها عن الشريحة ، مما يجعل التجربة بأكملها عديمة الفائدة. علاوة على ذلك ، يجب إجراء IHC عادة بسرعة نسبية عند استخدام النهج المثبت على الشريحة لتجنب تدهور مستضد المستضد 20,21 مع شرائح غير معالجة يتم تخزينها عادة عند -20 أو -80 درجة مئوية ، وغالبا ما يتم تغطيتها وتخزينها أفقيا أو في صناديق منزلقة ، مما يؤدي إلى بصمة تخزين كبيرة نسبيا. أخيرا ، يمكن أن تستغرق التقنية المثبتة على الشريحة وقتا طويلا إذا كان على الباحثين التعامل مع أعداد كبيرة من الشرائح لمعالجة أعداد كبيرة من أقسام الأنسجة.

نظرا لبعض هذه التحديات باستخدام الطريقة المثبتة على الشريحة ، أصبح تعديل يسمى طريقة التعويم الحر بديلا شائعا. جاءت هذه التقنية في الأدبيات في 1960-70s 22،23،24 ، واكتسبت شعبية في 1980s25،26،27،28،29 ، وهي الآن طريقة راسخة تتضمن أداء البقعة على الأقسام المجمعة في التعليق بدلا من الالتزام بشريحة 12،30،31 . لا ينصح باستخدام طريقة الطفو الحر عندما تكون أقسام الأنسجة أقل من 20 ميكرومتر ؛ ومع ذلك ، في تجربتنا ، هذا هو النهج المفضل عندما يتم تلطيخ الأقسام السميكة (40-50 ميكرومتر). تتمثل إحدى الفوائد المميزة في أن الأجسام المضادة يمكنها اختراق المقاطع العائمة الحرة من جميع الزوايا وتوليد تلطيخ أقل للخلفية بسبب الغسيل الأكثر فعالية ، وكل ذلك يؤدي إلى إشارات أفضل عند التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تثبيت الأقسام على الشرائح بعد المعالجة ، وبالتالي القضاء على إمكانية انفصال الأنسجة وكذلك تقليل الوقت الذي يشغل cryostat. يمكن أن تكون طريقة التعويم الحر أقل كثافة في العمل ، خاصة بالنسبة للدراسات الطبية الحيوية واسعة النطاق. على سبيل المثال ، من الممكن تلطيخ العديد من الأقسام (18-40) من نفس العينة معا في نفس البئر ، مما يوفر الوقت في أداء كل من خطوات الغسيل وحضانة الأجسام المضادة. علاوة على ذلك ، نظرا لأنه يمكن تركيب عدد أكبر (12-16) من الأقسام لكل شريحة باستخدام هذا الأسلوب ، فغالبا ما يكون أكثر ملاءمة وأسرع للباحث لعرض الأقسام وتصويرها. والجدير بالذكر أنه أثناء تركيب شرائح الأنسجة على الشرائح ، يمكن إرفاق الأقسام وفصلها حتى يتم الحصول على الاتجاه المطلوب. غالبا ما يستخدم الباحثون أيضا تركيزات أقل قليلا من الأجسام المضادة باستخدام طريقة الطفو الحر ، وبما أن الحضانة تتم في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، يمكن جمع الأجسام المضادة بسهولة وحفظها باستخدام أزيد الصوديوم لإعادة استخدامها (انظر الخطوة 5.1). ميزة أخرى هي أنه يمكن تخزين الأقسام مباشرة عند -80 درجة مئوية في أنابيب طرد مركزي صغيرة مع محلول واقي من التبريد32 ، وبالتالي تقليل مساحة التخزين وزيادة طول عمر العينات33. الجانب السلبي لاستخدام هذه التقنية هو أن الأقسام يتم التعامل معها كثيرا ، وبالتالي فهي عرضة للتلف. ومع ذلك ، يمكن التخفيف من ذلك باستخدام سرعات اهتزاز ودوران منخفضة بالإضافة إلى تدريب الباحثين بشكل صحيح على كيفية نقل العينات وتركيب الأقسام على الشرائح.

تعد المدينة العالمية للخدمات الإنسانية مجتمعة أداة راسخة وأساسية لتصور وتوطين تعبير البروتين في كل من مجالات البحوث السريرية والطبية الحيوية. تعتبر IHC العائمة الحرة طريقة فعالة ومرنة واقتصادية ، خاصة عند إجراء دراسات نسيجية واسعة النطاق. هنا ، نقدم بروتوكول IHC الفلوري العائم الحر الموثوق به للمجتمع العلمي والذي يمكن تكييفه وفقا لذلك مع IHC الكروموجينيك والبقع الأخرى مثل الهيماتوكسيلين واليوزين أو تلطيخ الكريسيل البنفسجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحضير الأنسجة للتشريح بالتبريد

  1. قم بتضمين الأنسجة الثابتة في قالب تضمين مناسب (انظر جدول المواد) لإنشاء كتلة عينة باستخدام مصفوفة عينة مناسبة (انظر جدول المواد) وتجميدها على الثلج الجاف. قم بتخزين كتل العينات عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للتقسيم.
    ملاحظة: عادة ما يتم تحضير الأنسجة الثابتة عن طريق ترشيح القوارض البالغة (حوالي 2.5 - 30 شهرا) من الذكور أو الإناث (الفأر أو الفئران)34 ، وفقا للتصريح الأخلاقي المتاح ، مع مثبت مناسب (مثل 10٪ فورمالين) ، تليها مناديل ما بعد التثبيت في نفس المثبت لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية ، وغسل المناديل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS ، ووضع الأنسجة في 15 ٪ ثم 30 ٪ السكروز في 1x PBS بين عشية وضحاها أو حتى تغرق الأنسجة35. قد يحاول الباحثون تكييف هذا البروتوكول العام مع مراحل التطوير المختلفة.

2. التشريح بالتبريد

  1. عندما تكون جاهزا للتقسيم ، تأقلم العينات في cryostat لمدة 1-2 ساعة على الأقل قبل التقسيم لمنع تحطم الأنسجة.
  2. باستخدام cryostat ، قم بتقطيع الأنسجة إلى أقسام (20-50 ميكرومتر) وجمعها في 6 أو 12 بئرا (انظر جدول المواد) مملوءة بمحلول 1x PBS.
    ملاحظة: اعتمادا على سمك المقطع ، وكمية الأنسجة التي سيتم جمعها ، وعدد إدخالات البئر المستخدمة ، سيحتوي كل بئر على عدد متغير من الأقسام يمتد من حوالي 10 إلى 40 شريحة للبئر. على سبيل المثال ، إذا تم تقسيم الدماغ بأكمله عند 40 ميكرومتر ، جمع ما يقرب من 18-24 قسما في كل بئر باستخدام إدخالات 12 بئرا. أيضا ، يمكن أن يكون التعامل مع أقسام 20 ميكرومتر صعبا إلى حد ما ، وبالتالي يوصى باستخدام 40 ميكرومتر للتلطيخ بالجملة (انظر المناقشة).

3. تخزين الأقسام

  1. بمجرد جمعها ، اغسل الأقسام باستخدام 1x PBS طازجة لمدة 5 دقائق. كرر 3 مرات.
  2. انقل الأقسام إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 مل مملوءة ب 1-1.5 مل من محلول التخزين (مقابل 250 مل ، امزج 70 جم من السكروز ، و 75 مل من جلايكول الإيثيلين ، ووصل إلى الحجم مع 0.1 M من الفوسفات العازلة).
  3. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للتلطيخ.

4. تلطيخ اليوم الأول

  1. أخرج العينات من الفريزر وازنها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 - 20 دقيقة.
  2. صب الأقسام في ملحق بئر في لوحة من 6 آبار لفصل محلول التخزين عن الأقسام.
  3. انقل إدخال البئر إلى بئر آخر يحتوي على حوالي 6 مل من 1x TBS. اغسل 3 مرات مع 1x TBS لمدة 5 دقائق لكل منها على شاكر مداري باستخدام سرعة منخفضة عند RT.
  4. أثناء غسل الأقسام ، قم بإعداد 7 مل (لكل عينة) من محلول مانع للاختراق يتكون من 1x TBS مع 0.3٪ Triton X-100 و 3٪ مصل طبيعي (على سبيل المثال ، مصل الحصان العادي). قم بحظر المقاطع لمدة 30 دقيقة في RT على شاكر مداري ، باستخدام سرعة منخفضة.
    ملاحظة: يمنع الحجب باستخدام الأمصال الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة بالأنسجة أو مستقبلات FC غير المحددة - يوصى باستخدام مصل يطابق أنواع الجسم المضاد الثانوي ، ولكن إذا لم يكن متاحا ، يمكن استخدام أي مصل طبيعي من نوع مختلف عن الحيوان المضيف للجسم المضاد الأساسي. يسمح المنظف Triton X-100 باختراق أفضل للأجسام المضادة عن طريق اختراق الأنسجة.
  5. تحضير 1 مل لكل عينة من محلول الأجسام المضادة الأولية الذي يتكون من جسم مضاد أولي مختار (مخفف بشكل مناسب) في 1x TBS مع 0.3٪ Triton X-100 و 1٪ مصل طبيعي (انظر الخطوة 4.4 ملاحظة). نقل المقاطع من إدخال البئر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل يحتوي على محلول أولي للأجسام المضادة لربطه بالمستضد (المستضدات) محل الاهتمام.
    ملاحظة: يمكن استخدام أجسام مضادة أولية متعددة (تتولد في أنواع مضيفة مختلفة).
  6. ضع أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل مع أقسام على خلاط دوار باستخدام سرعة منخفضة (على سبيل المثال ، سرعة 7 دورة في الدقيقة) واحتضانها طوال الليل لمدة 12-16 ساعة عند 4 درجات مئوية.

5. تلطيخ اليوم الثاني

  1. في اليوم التالي ، صب الأقسام في ملحق بئر في لوحة من 6 آبار لفصل الأقسام عن محلول الأجسام المضادة الأساسي.
    ملاحظة: يمكن جمع محلول الأجسام المضادة وإعادة استخدامه ؛ أضف 0.02٪ (وزن / حجم) أزيد الصوديوم لمنع نمو الميكروبات.
  2. اغسل الأقسام 3 مرات مع 1x TBS في RT (30 ثانية لأول غسلتين و 10 دقائق للغسيل النهائي).
  3. تحضير 1 مل لكل عينة من محلول الأجسام المضادة الثانوي الذي يتكون من جسم مضاد ثانوي مناسب (مخفف وفقا لذلك) في 1x TBS مع 0.3٪ Triton X-100 و 1٪ مصل طبيعي (محلول درع من الضوء).
    ملاحظة: يؤدي وضع العلامات غير المباشرة مع جسم مضاد ثانوي مترافق إلى تضخيم الإشارة ويسمح بالتصور اللوني أو الفلوري لهدف البروتين.
  4. نقل المقاطع إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل يحتوي على محلول ثانوي للأجسام المضادة. احتضان لمدة 2 ساعة في RT على شاكر المداري باستخدام سرعة منخفضة (محلول الدرع من الضوء).
  5. صب المقاطع في ملحق بئر في لوحة من 6 آبار لفصل الأقسام عن محلول الأجسام المضادة الثانوي.
  6. الاستمرار في حماية العينات من الضوء ، وغسل 2 مرات مع 1x TBS لمدة 30 ثانية في RT. ثم يغسل لمدة 15 دقيقة في 1x TBS ، أضف DAPI (1-0.1 ميكروغرام / مل) إذا رغبت في ذلك.

6. تصاعد

  1. صب المقاطع في غرفة نسيجية مستطيلة زجاجية مملوءة بثلاثة أرباع 1x TBS.
  2. اغمر شريحة زجاجية في 1x TBS واستخدم فرشاة رسم دقيقة لإقناع الأقسام باتجاه الشريحة.
  3. اضغط برفق على الأقسام على الشريحة ، وتأكد من عدم وجود تجاعيد أو طيات.
  4. كرر حتى يتم تثبيت جميع الأقسام على الشريحة (الشرائح).
    ملاحظة: عندما يتم تقسيم الدماغ بأكمله ، على سبيل المثال ، عند 40 ميكرومتر ، يتم تجميعه في إدخالات من 12 بئرا مع حصة واحدة تحتوي على 18-24 قسما ؛ عادة ما يتم تثبيت الشرائح على 1-2 شريحة ، ولكن يمكن أيضا تركيب أقسام أقل لكل شريحة حسب تفضيل الباحث.

7. غطاء الانزلاق

  1. بعد تجفيف المقاطع على الشريحة (الشرائح) ، حوالي 10-15 دقيقة في RT أو حتى تبدو الأقسام معتمة (تذكر حماية الشرائح من الضوء) ، ضع وسط تركيب مائي مناسب (تصلب أو غير صلب). يفضل مضاد التلاشي في حالة استخدام جسم مضاد ثانوي مترافق الفلورسنت.
    ملاحظة: قد تكون جودة التألق أقل عند استخدام وسيط تركيب متصلب، ولكن يجب أن تستمر الشرائح لفترة أطول.
  2. باستخدام الملقط ، ضع غطاء أعلى الوسط. قم بتغطيتها بورق الترشيح واضغط لأسفل بقوة لإزالة وسط التركيب الزائد.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم حاملا غير متصلب، فقم بطلاء حواف الشريحة المنزلقة بطلاء أظافر شفاف لإغلاقه.
  3. أقسام الصورة باستخدام المجهر المناسب. يحفظ في صندوق منزلق مظلم على حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن تصوير المقاطع باستخدام مجموعة متنوعة من المجاهر ، مثل المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر والتألق واسع المجال المقلوب أو المستقيم ، عند التكبير (على سبيل المثال ، 10x ، 20x ، 40x) بناء على احتياجات الباحث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 1 المخطط العام لاستخدام طريقة الطفو الحر لإجراء مقايسة كيميائية مناعية فلورية. يظهر مثال تمثيلي ل IHC الفلوري باستخدام طريقة الطفو الحر في دماغ الفأر الذي يفحص تعبير البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) في الشكل 2 عند كل من التكبير المنخفض والعالي لتوضيح الجودة الشاملة للتلطيخ. هذا النهج مناسب أيضا للكشف عن البروتينات منخفضة التعبير ، مع مثال من دماغ فأر معدل وراثيا منخفض التعبير GFP موضح في الشكل 3. يمكن أيضا استخدام طريقة الطفو الحر في بروتوكولات التلوين الكيميائية النسيجية الأخرى ، مثل الكريسيل البنفسجي ، كما هو موضح في الشكل 4 ، باتباع الخطوات من 1 إلى 4.3 من البروتوكول ثم تركيب الأقسام كما هو موضح في الخطوة 6. بعد ذلك ، يمكن معالجة الأقسام باستخدام أي تلطيخ يتطلب أقساما مثبتة على الشريحة. عند استخدام هذا البروتوكول ل IHC الكروموجيني ، اتبع البروتوكول من الخطوات من 1 إلى 5.6 (لا تقم بإضافة DAPI إلى آخر غسلة) ، واضبط وفقا لذلك في حالة استخدام خطوة تضخيم (على سبيل المثال ، مركب avidin-biotin). استبدل المخزن المؤقت بكاشف كروماجين / ركيزة ، مع احتضان 5-20 دقيقة حتى يتحول لون الأنسجة إلى اللون المطلوب. يمكن مراقبة التفاعل عن طريق فحص الأنسجة بشكل دوري باستخدام مجهر منخفض الطاقة. قم بإنهاء التفاعل عن طريق تحريك إدخال البئر مع الأقسام إلى مخزن مؤقت جديد ، وغسلها ثلاث مرات ، على الأقل 5 دقائق لكل منها. تابع الخطوة 6 لتركيب الأقسام على شرائح زجاجية ، مما يسمح للأقسام بالجفاف على جهاز تدفئة منزلق لمدة 3-4 ساعات على الأقل. قم بتجفيف الشرائح بتركيزات متزايدة من الإيثانول (أي 70٪ ، 90٪ ، 95٪ ، 99.5٪ ، 2-5 دقائق لكل منهما) متبوعا بالزيلين (5-10 دقائق) ثم قم بتغطية الانزلاق بوسط صلب (على سبيل المثال ، Entellan) ، مما يسمح للشرائح بالجفاف لمدة 1-2 ساعة على الأقل في منطقة جيدة التهوية. إذا كانت الخلفية عالية جدا ، فقم بإخماد نشاط البيروكسيديز الداخلي لمدة 15 دقيقة عند RT مع 3٪ H 2 O2في 1x TBS متبوعا بثلاث غسلات عازلة ، 15-20 دقيقة لكل منها ، قبل الحجب (الخطوة 4.4). العديد من الأنسجة المحيطية قابلة أيضا لاستخدام هذه التقنية دون الحاجة إلى تعديلات على البروتوكول ، مع مثال لأقسام الكبد من الماوس المعبر عن GFP كما هو موضح في الشكل 5.

Figure 1
الشكل 1: مخطط انسيابي للمقايسة الكيميائية المناعية الفلورية العائمة الحرة. قم بتشريح العضو محل الاهتمام (يفضل الأنسجة الثابتة) وتضمين الأنسجة في قوالب التضمين (انظر جدول المواد) باستخدام مصفوفة العينات (انظر جدول المواد) ، ثم قم بتجميدها على الثلج الجاف وتخزينها عند -80 درجة مئوية. قسم الأنسجة باستخدام cryostat في 20-50 ميكرومتر وجمع شرائح في إدراج بئر (انظر جدول المواد) مليئة 1x PBS. باستخدام شاكر مداري على سرعة منخفضة ، اغسل الأقسام 3x لمدة 5 دقائق لكل منها في 1x PBS. في هذه المرحلة ، قم بتخزين أقسام إضافية في مخزن التخزين المؤقت عند -80 درجة مئوية حتى الحاجة. اغسل الأجزاء المتبقية 3 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام 1x TBS. قم بحظر الأقسام لمدة 30 دقيقة عند اهتزاز RT بسرعة منخفضة. تحضير محلول الأجسام المضادة الأولية واحتضان المقاطع طوال الليل في أنبوب (أنابيب) أجهزة الطرد المركزي الدقيقة عند 4 درجات مئوية (12-14 ساعة). في اليوم التالي ، اغسل الأقسام ب 1x TBS 3x ، أول غسلتين لمدة 30 ثانية ، مع الغسيل الثالث لمدة 10 دقائق. احتضان أقسام في محلول الأجسام المضادة الثانوي في أنبوب (أنابيب) الطرد المركزي الدقيق لمدة 2 ساعة في RT ، مع التأكد من حماية الأقسام من الضوء عندما يكون ذلك ممكنا من هذه الخطوة إلى الأمام. ثم اغسل 3x مع 1x TBS ، أول غسلتين لمدة 30 ثانية ، والغسيل الثالث لمدة 15 دقيقة. أضف DAPI إلى آخر غسل إذا رغبت في ذلك وإذا لم يكن موجودا في وسط التركيب. صب الأقسام في صندوق غرفة ، ثلاثة أرباع مليئة ب 1x TBS ، واستخدم فرشاة رسم للصق الأقسام على الشريحة (الشرائح). اترك الشرائح تجف (~ 10-15 دقيقة) قبل أن تنزلق التغطية بوسيط التركيب الذي تختاره. أقسام الصورة باستخدام المجهر المناسب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية باستخدام أقسام الدماغ العائمة الحرة. يتم عرض مناطق الدماغ الحصين التي تفحص تعبير GFAP في الفئران البالغة وتم تصنيفها باستخدام جسم مضاد أولي مضاد ل GFAP نشأ في الأرانب وجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب Alexa568 نشأ في حمار. تم استخدام DAPI في الغسيل الأخير لتسمية النوى. تم تقسيم الأنسجة عند 40 ميكرومتر باستخدام cryostat. تم التقاط الصور بتكبير 10x (علوي) و 40x (أقل) باستخدام مجهر متحد البؤر لمسح نقطة الليزر. شريط مقياس الصورة 10x = 400 ميكرومتر. شريط مقياس الصورة 40x = 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية على البروتينات الأقل تعبيرا باستخدام طريقة الطفو الحر. يتم عرض مناطق الدماغ الحصين من فأر بالغ معدل وراثيا GFP منخفض التعبير. تم تصنيف الخلايا العصبية التي تعبر عن GFP باستخدام جسم مضاد أولي مضاد ل GFP نشأ في الماعز وجسم مضاد ثانوي مضاد للماعز Alexa488 نشأ في الحمار. تم استخدام DAPI في الغسيل الأخير لتسمية النوى. تم تقسيم الأنسجة عند 40 ميكرومتر باستخدام cryostat. تم التقاط الصور بتكبير 40x باستخدام مجهر متحد البؤر لمسح نقطة الليزر. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تلطيخ كريسيل البنفسجي باستخدام أقسام الدماغ العائمة بحرية. باستخدام cryostat ، تم جمع 40 ميكرومتر من البصلة الشمية للفأر البالغ إلى المخيخ ، وغسلها ، وتركيبها على شرائح ، وصبغها باللون البنفسجي الكريسيل ، وتغطيتها. تم التقاط الصور بتكبير 10x باستخدام مجهر واسع المجال مقلوب. شريط المقياس = 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية باستخدام أقسام الكبد العائمة بحرية. يتم عرض مقاطع من الكبد المأخوذة عند 40 ميكرومتر باستخدام cryostat من فأر بالغ معدل وراثيا يعبر عن مستويات منخفضة من GFP. تم استخدام جسم مضاد أولي مضاد ل GFP نشأ في الماعز مع جسم مضاد ثانوي مضاد للماعز Alexa488 نشأ في حمار لتسمية الخلايا التي تعبر عن GFP. تمت إضافة DAPI إلى آخر غسل لتسمية النوى. تم جمع الصور باستخدام مجهر متحد البؤر لمسح نقطة الليزر بتكبير 40x. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) هي تقنية متعددة الاستخدامات أصبحت حاسمة في تحديد تعبير البروتين وتوطينه داخل أقسام الأنسجة. يستخدم هذا الفحص في جميع أنحاء المجتمع العلمي لزيادة فهم خصائص الأنسجة عبر مراحل الوظيفة الطبيعية لحالات المرض. يتم توظيف IHC في مجموعة متنوعة من المجالات من التشخيص السريري لأمراض مثل السرطان إلى الاكتشافات الأولية في الأبحاث قبل السريرية10،36.

التقنية الأكثر استخداما لأداء IHC هي الطريقة المثبتة على الشريحة حيث يتم لصق الأقسام على الفور بالشريحة بعد تقطيعها. تتمثل بعض مزايا استخدام هذه التقنية في أنه يمكن للباحثين التعامل مع المقاطع الرقيقة جدا اللازمة لدراسات توطين البروتين واستخدام القليل من الحلول لتلطيخ الأقسام لكل شريحة. غالبا ما تكون الأجسام المضادة باهظة الثمن. لذلك ، يمكن أن يكون هذا النهج خيارا اقتصاديا إذا كان سيتم معالجة أقسام قليلة. هذه هي أيضا الطريقة المفضلة للباحثين الذين يستخدمون عينات مجمدة طازجة لأن التعامل مع الأنسجة يكون ضئيلا ، وبالتالي سيتم حماية السلامة الهيكلية للأنسجة. سيكون من المناسب أيضا استخدام النهج المثبت على الشريحة إذا تم جمع أقسام قليلة فقط وتلطيخها على الفور ، كما هو الحال في علم الأمراض السريري. من ناحية أخرى ، هناك بعض العيوب ، مثل الوصول إلى الجانب المكشوف فقط من الأنسجة أثناء التلوين ، مما يحد من سمك القسم بسبب ضعف اختراق الأجسام المضادة والغسيل الفعال. عيب آخر هو أنه بمجرد تقسيم الأنسجة وتجميعها على شرائح ، يجب عادة إكمال IHC بسرعة إلى حد ما مع تخزين الشرائح غير المعالجة التي تشغل مساحة كبيرة من المجمد. علاوة على ذلك ، عند معالجة تجارب أكبر (على سبيل المثال ، العديد من مناطق الدماغ ذات المستويات التمثيلية المتعددة المراد تلطيخها) ، قد يستخدم هذا النهج في الواقع المزيد من الكواشف ، ويستغرق وقتا طويلا إلى حد ما ، ويمكن أن يحد في كثير من الأحيان من عدد الشرائح التي ستتم معالجتها لكل تجربة.

يمكن التغلب على بعض القيود المرتبطة بالطريقة المثبتة على الشريحة من خلال تقنية التلوين العائمة الحرة التي أصبحت بديلا شائعا بشكل متزايد عند العمل مع أقسام أكثر سمكا. على الرغم من أن هذه الطريقة ليست نهجا جديدا ، إلا أنه في تجربتنا ، فقد كان نهجا موثوقا وقابلا للتكرار ومرنا ، خاصة لتلطيخ عينات الأنسجة بكميات كبيرة ، مما يسمح بمعالجة الدراسات واسعة النطاق بطريقة فعالة. يمكن للباحثين أيضا إجراء تجارب متعددة وكبيرة بشكل فعال في نفس الوقت باستخدام هذه الطريقة. علاوة على ذلك ، يتم تلطيخ العينات في التعليق ، وبالتالي يمكن للحلول اختراق الأقسام من جميع الزوايا ، وهي مهمة بشكل خاص للأقسام السميكة ، وغالبا ما تؤدي إلى بقعة عالية الجودة (الشكل 2 ، الشكل 3 ، والشكل 5). يمكن تقطيع المقاطع العائمة الحرة في أي مكان من 20-50 ميكرومتر بسمك37 ، مع أقسام أكثر سمكا مفيدة للباحثين لرؤية الهياكل أو الخلايا في سهول الرؤية المختلفة. على سبيل المثال، في أنسجة المخ، تسمح المقاطع السميكة للباحثين برؤية تركيب الزوائد الشجيرية والمحاور العصبية في عيناتهم. القدرة على جمع شرائح أرق (20 ميكرومتر) توسع نطاق التطبيقات بشكل أكبر ؛ ومع ذلك ، قد يكون من الصعب التعامل مع الشرائح الرقيقة وغالبا ما تتطلب المزيد من الوقت والجهد لتقليل الضرر ، وبالتالي يجب ألا تكون الأقسام أرق من 40 ميكرومتر للتلطيخ بالجملة. تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية لطريقة الطفو الحر في أنه يمكن للباحثين تقسيم الأدمغة بأكملها بسرعة (أو الأنسجة الأخرى) ، وجمع جميع الأقسام في أنابيب صغيرة مع وجود شريحة تمثيلية لجميع مناطق الدماغ المختلفة ، مما يسمح للباحثين بتلطيخ الدماغ بأكمله بسرعة. يمكن تخزين الأنابيب التي تحتوي على شرائح في مادة واقية من البرودة عند -80 درجة مئوية لعدة سنوات33 ، مع عدم شغل القسمة مساحة كبيرة في المجمد ، مما يسمح للباحثين بشكل فعال بإنشاء "مكتبة أنسجة". تقلل هذه الطريقة أيضا من كمية المواد المهدرة ، بما في ذلك الشرائح ، وأغطية الغطاء ، وخاصة الأجسام المضادة ، والتي يمكن استعادتها بسهولة وحفظها لإعادة استخدامها ، وكذلك الأنسجة الحيوانية الثمينة حيث يمكن تخزين الأقسام وحفظها طالما اختار المستخدمون.

كما يمنح النهج العائم الحر والبروتوكول المقدم هنا الباحثين خيار تعديل البروتوكول بسهولة أو إعادة توظيف الموارد. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الأقسام التي تم جمعها للعديد من البقع الكيميائية النسيجية المختلفة بالإضافة إلى التألق المناعي مع تعديلات بروتوكول بسيطة ، مثل IHC الكروموجينيك ، والهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) ، والكريسيل البنفسجي (الشكل 4) ، و RNAscope38. يسمح IHC الكروموجيني بتصور تعبير المستضد عندما يتم تحويل ركيزة قابلة للذوبان بواسطة إنزيم مقترن بجسم مضاد ثانوي إلى منتج كروموجيني غير قابل للذوبان. الإنزيمان الأكثر استخداما هما بيروكسيديز الفجل (HRP) ، الذي يحول 3,3 'ديامينوبنزيدين (DAB) إلى منتج نهائي بني داكن ، والفوسفاتيز القلوي (AP) ، الذي يحول الركيزة 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) إلى منتج أحمر39. نقوم بشكل روتيني بإجراء تلطيخ الكريسيل البنفسجي واستخدام أقسام عائمة حرة من أجل فحص تنظيم الدماغ الإجمالي والتشكل40. لقد نجحنا أيضا في تطبيق هذا البروتوكول على العديد من الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك الدماغ والكبد والقلب والكلى والطحال (الشكل 5). كما استخدم باحثون آخرون هذه التقنية بنجاح للأنسجة المحيطية بما في ذلك الكبد والكلى والمبيض22،23،24.

أحد الشواغل الرئيسية عند استخدام تقنية الطفو الحر هو احتمال حدوث تلف هيكلي لأقسام الأنسجة ، وخاصة لشرائح الدماغ ، لأنه في جميع أنحاء البروتوكول ، تكون العينات على الهزازات والدوارات خلال كل خطوة تقريبا لضمان غسلها وحظرها وتلطيخها بالتساوي. في بعض الأحيان ، يمكن أن تنفصل مناطق معينة من الدماغ ، خاصة على مستويات المخيخ. ومع ذلك ، فإن استخدام أطلس الدماغ وشكل من أشكال التكبير ، مثل مصباح الصائغ ، أثناء عملية التركيب يمكن أن يكون مفيدا لتجميع الأقسام معا. يمكن عادة منع هذا التحدي من خلال التعامل اللطيف مع العينات والحفاظ على الآلات الدوارة في الإعداد الصحيح والمنخفض.

في الختام ، نقدم تقنية IHC العائمة الحرة التي أثبتت أنها طريقة لا غنى عنها ويمكن الاعتماد عليها ومرنة وفعالة نستخدمها بانتظام لتصور تعبير البروتين وتوطينه بالإضافة إلى بنية الأنسجة في مجموعة متنوعة من الأنسجة. يمكن تعديل البروتوكول الوارد هنا بسهولة ليناسب الاحتياجات البحثية الفردية مما يجعله ذا قيمة للمجتمع العلمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء للإفصاح عنه

Acknowledgments

نود أن نعترف بالمعهد الوطني للشيخوخة (K99 / R00 AG055683 إلى JMR) ، ومعهد جورج وآن ريان لعلم الأعصاب (EP ، GC ، JMR) ، وكلية الصيدلة في جامعة رود آيلاند (EP ، GC ، JMR) ، و Konung Gustaf V: s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). نشكر طالبة الدكتوراه ريبيكا سينفت ، التي تتدرب مع الأستاذة سوزان ديميكي ، قسم علم الوراثة ، كلية الطب بجامعة هارفارد ، لتعريفنا بطريقة التعويم الحر. تم الحصول على بعض الصور المستخدمة في الشكل 1 من مصادر "مجانية الاستخدام أو المشاركة أو التعديل ، حتى تجاريا": أنبوب الماوس والطرد المركزي الدقيق (Pixabay) ، دماغ الفأر (Jonas Töle ، ويكيميديا كومنز) ، قسم cryostat ودماغ الفأر (مركز قاعدة البيانات لعلوم الحياة ، ويكيميديا كومنز) ، حاوية زجاجية (OpenClipart ، FreeSvg.org) ، والمجهر (تيريزا نوت ، مكتبة القصاصات الفنية المفتوحة).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 3513
6-well plates Corning 3516
Clear nail polish User preference N/A
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Embedding molds Thermo Scientific 1841
Ethylene glycol User preference N/A
Formalin solution Fisher Scientific SF98-4
Horse serum, heat inactivated Gibco 26050088
Microscope slide boxes Electron Microscopy Services 71370
PBS User preference N/A
Primary antibody User preference N/A
Rectangular Coverslips VWR 48393-081 24 x 50 mm
Rectangular staining dish Electron Microscopy Services 70312
Round artist paintbrush #2 Princeton Select Series 3750R Brand not important
Secondary antibody User preference N/A
Specimen matrix for embedding OCT Tissue-Tek, Sakura 4583
Stain tray – slide staining system Electron Microscopy Services 71396-B Use dark lid
Sucrose User preference N/A
Superfrost Plus Micro Slides VWR 48311-703
TBS User preference N/A
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vectashield antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000 Non-hardening
Well inserts for 12-well plates Corning Netwells 3477
Well inserts for 6-well plates Corning Netwells 3479
Whatman filter paper Millapore-Sigma WHA1440042

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
  2. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  3. Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
  4. Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374 (1999).
  5. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  6. Hermersdörfer, H. Immunocytochemistry. A Practical Approach. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).
  7. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of Immunohistochemistry. Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  8. Coons, A. H. International Review of Cytology. International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).
  9. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
  10. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).
  11. Li, A., Yang, D. H. Methods in Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. 2108, Clifton, N.J. 43-55 (2020).
  12. Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
  13. Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
  15. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, Clifton, N.J. 55-61 (2010).
  16. van der Loos, C. A focus on fixation. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  19. Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
  20. Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
  21. Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
  22. Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
  23. Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
  24. Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
  25. Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
  26. Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
  27. Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
  28. Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
  29. Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
  30. Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
  31. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
  32. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
  33. Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
  34. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  35. Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
  36. Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
  37. Burry, R. W. Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
  38. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
  39. Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , Springer. 207-262 (1981).
  40. Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).

Tags

علم الأحياء ، العدد 162 ، الكيمياء النسيجية ، التألق المناعي ، الكيمياء المناعية ، التعويم الحر ، الدماغ ، الشيخوخة ، التنكس العصبي ، تعبير البروتين ، تصور البروتين ، وضع العلامات على الأجسام المضادة
تلطيخ قائم على الأنسجة باستخدام أقسام الأنسجة العائمة الحرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross,… More

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (162), e61622, doi:10.3791/61622 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter