Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

फ्री-फ्लोटिंग ऊतक अनुभागों का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल-आधारित धुंधलापन

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61622
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1George & Anne Ryan Institute for Neuroscience, College of Pharmacy, Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, University of Rhode Island, 2Department of Neuroscience, Biomedicum, Karolinska Institutet

Summary

फ्री-फ्लोटिंग तकनीक शोधकर्ताओं को जैविक संरचनाओं, सेल प्रकार और प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण की कल्पना करने के लिए निश्चित ऊतक वर्गों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सहित हिस्टोलॉजिकल-आधारित धुंधलापन करने की अनुमति देती है। यह एक कुशल और विश्वसनीय हिस्टोकेमिकल तकनीक है जो मस्तिष्क, हृदय और यकृत जैसे ऊतकों की भीड़ की जांच के लिए उपयोगी हो सकती है।

Abstract

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विशिष्ट ऊतक संरचनाओं के साथ-साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण की कल्पना करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। धुंधला प्रक्रिया के दौरान ऊतक वर्गों को संभालने के लिए दो वैकल्पिक दृष्टिकोणों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, एक दृष्टिकोण में सीधे ग्लास स्लाइड पर अनुभागों को बढ़ाना शामिल है, जबकि एक दूसरा दृष्टिकोण, फ्री-फ्लोटिंग, समाधान में निलंबित होने के दौरान निश्चित वर्गों को बनाए रखने और दागने की अनुमति देता है। यद्यपि स्लाइड-माउंटेड और फ्री-फ्लोटिंग दृष्टिकोण समान परिणाम दे सकते हैं, फ्री-फ्लोटिंग तकनीक बेहतर एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति देती है और इस प्रकार ऊतकों के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए मोटे वर्गों का उपयोग किए जाने पर पसंद की विधि होनी चाहिए, उदाहरण के लिए जब प्रयोग का ध्यान मस्तिष्क क्षेत्रों में डेंड्राइटिक और अक्षीय अनुमानों पर जानकारी प्राप्त करना है। इसके अलावा, चूंकि अनुभागों को समाधान में रखा जाता है, इसलिए एक एकल एलिकोट आसानी से 30 से 40 वर्गों को समायोजित कर सकता है, जिनमें से हैंडलिंग कम श्रमसाध्य है, खासकर बड़े पैमाने पर बायोमेडिकल अध्ययनों में। यहां, हम बताते हैं कि मस्तिष्क वर्गों पर एक प्रमुख ध्यान देने के साथ फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला करने के लिए फ्री-फ्लोटिंग विधि को कैसे लागू किया जाए। हम यह भी चर्चा करेंगे कि शोधकर्ताओं की व्यक्तिगत जरूरतों को पूरा करने के लिए फ्री-फ्लोटिंग तकनीक को आसानी से कैसे संशोधित किया जा सकता है और अन्य ऊतकों के साथ-साथ अन्य हिस्टोकेमिकल-आधारित धुंधलापन, जैसे हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन और क्रेसिल वायलेट के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जब तक कि ऊतक के नमूने ठीक से तय किए जाते हैं, आमतौर पर पैराफॉर्मलडिहाइड या फॉर्मेलिन के साथ।

Introduction

इम्यूनोस्टेनिंग एक लोकप्रिय शोध अभ्यास है जो 130 साल पहले वॉनबेहरिंग 1 द्वारा 1890 में सीरम एंटीबॉडी की खोज के साथ शुरू हुआ था। 20वीं शताब्दी की शुरुआत के दौरान, रंगों को एंटीजन से जोड़ा गया था और बाद में प्रतिक्रियाओं को मापने और कल्पना करने के तरीके के रूप में एंटीबॉडी से जोड़ागया था, और 1941 में अल्बर्ट कून्स ने पहला फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी लेबल विकसित किया, एक खोज जिसने प्रकाश माइक्रोस्कोपी 2,3 में क्रांति ला दी। शब्द "इम्यूनोस्टेनिंग" में कई तकनीकें शामिल हैं जो इस सिद्धांत का उपयोग करके विकसित की गई हैं, जिनमें पश्चिमी धब्बा, प्रवाह साइटोमेट्री, एलिसा, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री 3,4 शामिल हैं। पश्चिमी धब्बा ऊतक या कोशिका अर्क से विशिष्ट प्रोटीन की उपस्थिति का पता लगाता है। प्रोटीन को जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके आकार से अलग किया जाता है, एक झिल्ली में स्थानांतरित किया जाता है, और एंटीबॉडी का उपयोग करके जांच की जाती है। यह तकनीक प्रोटीन की उपस्थिति को इंगित करती है और कितना प्रोटीन मौजूद है; हालांकि, यह कोशिकाओं या ऊतकों के भीतर प्रोटीन के स्थानीयकरण पर कोई जानकारी प्रकट नहीं करता है। एक और विधि, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी), कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन को लेबल करती है, आमतौर पर विट्रो में खेती की जाने वाली कोशिकाएं। आईसीसी सेलुलर डिब्बों के भीतर प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण दोनों को दिखाता है। ऊतक स्तर पर एक विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने और कल्पना करने के लिए, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) का उपयोग किया जाता है।

आईएचसी एक विधि है जिसका उपयोग शोधकर्ता ऊतक के भीतर विशिष्ट एंटीजन को लक्षित करने के लिए करते हैं, प्रतिरक्षा प्रणाली 7,8 के रासायनिक गुणों का लाभ उठाते हैं। एक एंजाइम या फ्लोरोसेंट डाई से जुड़े विशिष्ट प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी उत्पन्न करके, रुचि के एंटीजन को लेबल किया जा सकता है और अधिकांश ऊतकों में प्रकट किया जा सकता है (जैसा कि मेफाम और ब्रिटन में समीक्षा की गई है) 9. शब्द "इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री" अपने आप में लेबलिंग विधि को निर्दिष्ट नहीं करता है जिसका उपयोग रुचि के एंटीजन को प्रकट करने के लिए किया जाता है; इस प्रकार, इस शब्दावली को अक्सर लेबलिंग विधि को स्पष्ट रूप से चित्रित करने के लिए पहचान तकनीक के साथ जोड़ा जाता है: क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (सीआईएच) यह इंगित करने के लिए कि द्वितीयक एंटीबॉडी एक एंजाइम से संयुग्मित है, जैसे पेरोक्सीडेज; या फ्लोरोसेंट आईएचसी इंगित करने के लिए कि द्वितीयक एंटीबॉडी को फ्लोरोफोरे से संयुग्मित किया जाता है, जैसे कि फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) या टेट्रामिथाइलरोडामाइन (टीआरआईटीसी)। आईएचसी की चयनात्मकता चिकित्सकों और शोधकर्ताओं को स्वास्थ्य और रोगके विभिन्न राज्यों में ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति और वितरण की कल्पना करने की अनुमति देती है। नैदानिक क्षेत्र में, आईएचसी का उपयोग आमतौर पर कैंसर का निदान करने के लिए किया जाता है, साथ ही साथ विभिन्न प्रकार के कैंसर में अंतर निर्धारित करने के लिए भी किया जाता है। आईएचसी का उपयोग शरीर के भीतर विभिन्न प्रकार के माइक्रोबियल संक्रमणों की पुष्टि करने के लिए भी किया गया है, जैसे हेपेटाइटिस बी या सी11। बायोमेडिकल अनुसंधान में, आईएचसी का उपयोग अक्सर ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति को मैप करने के लिए किया जाता है और रोग राज्यों में देखे जाने वाले असामान्य प्रोटीन की पहचान करने में महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, न्यूरोडीजेनेरेशन अक्सर मस्तिष्क में असामान्य प्रोटीन के संचय के साथ होता है, जैसे कि अल्जाइमर रोग में एओ प्लेक और न्यूरोफिब्रिलरी टैंगल्स। पशु मॉडल अक्सर इन पैथोलॉजिकल राज्यों की नकल करने के लिए विकसित किए जाते हैं, और आईएचसी एक ऐसी विधि है जिसका उपयोग शोधकर्ता 10,12,13 रुचि के प्रोटीन का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए करते हैं। बदले में, हम इन बीमारियों के कारणों और उनके साथ उत्पन्न होने वाली जटिलताओं के बारे में अधिक जान सकते हैं।

आईएचसी प्रदर्शन में कई चरण शामिल हैं। सबसे पहले, रुचि के ऊतक को एकत्र किया जाता है और धुंधला होने के लिए तैयार किया जाता है। यकीनन अधिकांश शोधकर्ता निश्चित ऊतक नमूने तैयार करते हैं, जिसमें संचार प्रणाली के माध्यम से फिक्सेटिव का छिड़काव इष्टतम होता है क्योंकि यह आकृति विज्ञान14,15 को संरक्षित करता है। ऊतक के नमूनों के पोस्ट-निर्धारण का भी उपयोग किया जा सकता है लेकिन आदर्श परिणाम से कम परिणाम मिलसकते हैं। क्रॉसलिंकिंग फिक्सेटिव, जैसे फॉर्मलाडेहाइड, ऊतक17 में प्रोटीन के बीच रासायनिक बंधन बनाकर कार्य करते हैं। निश्चित ऊतक को तब माइक्रोटोम का उपयोग करके बहुत पतली परतों या वर्गों में काटा जाता है, जिसमें कई शोधकर्ता क्रायोस्टेट का उपयोग करके जमे हुए वर्गों को इकट्ठा करना पसंद करते हैं। वहां से ऊतक एकत्र किया जाता है और या तो सीधे माइक्रोस्कोप स्लाइड (स्लाइड-माउंटेड विधि) पर रखा जाता है, या एक समाधान (फ्री-फ्लोटिंग विधि) में निलंबित किया जाता है, जैसे कि फॉस्फेट बफर्ड सलाइन (पीबीएस)18। उपयोग किए गए संग्रह की विधि शोधकर्ता की जरूरतों के आधार पर पूर्व निर्धारित है, इन दो विधियों में से प्रत्येक अपने फायदे और नुकसान प्रस्तुत करता है।

स्लाइड-माउंटेड विधि अब तक सबसे अधिक उपयोग की जाती है, जिसमें एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि बहुत पतले खंड (10-14 μm) तैयार किए जा सकते हैं, जो महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच करने के लिए। नमूने की न्यूनतम हैंडलिंग भी है, जो ऊतक19 की संरचनात्मक अखंडता को संभावित क्षति को कम करती है। शोधकर्ता अक्सर इस तकनीक का उपयोग ताजा जमे हुए ऊतक (ऊतक जो सूखी बर्फ, आइसोपेंटेन, आदि का उपयोग करके तुरंत जमे हुए होते हैं) के साथ करते हैं, जो निश्चित ऊतक की तुलना में बहुत नाजुक होता है और नमूने के पिघलने को रोकने के लिए बहुत सावधानी बरतने की आवश्यकता होती है। स्लाइड-माउंटेड वर्गों का उपयोग करने का एक और लाभ यह है कि धुंधला करने के लिए बड़ी मात्रा में समाधान ों की आमतौर पर आवश्यकता नहीं होतीहै। इस प्रकार, शोधकर्ता दाग को पूरा करने के लिए महंगी एंटीबॉडी या अन्य रसायनों की एक छोटी मात्रा का उपयोग कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, एक ही स्लाइड पर कई अलग-अलग प्रयोगात्मक समूहों से वर्गों को माउंट करना संभव है, जो फायदेमंद हो सकता है, खासकर छवि अधिग्रहण के दौरान। दूसरी ओर, स्लाइड-माउंटेड वर्गों का उपयोग करने के कुछ नुकसान हैं, विशेष रूप से ऊतक अनुभाग का पालन स्लाइड से किया जाता है, इस प्रकार एंटीबॉडी प्रवेश को अनुभाग के एक तरफ तक सीमित किया जाता है, जो अनुभाग मोटाई और ऊतक के 3 डी प्रतिनिधित्व को सीमित करता है। यह भी हो सकता है कि धोने के दौरान, ऊतक के किनारे और पूरे खंड स्लाइड से अलग हो सकते हैं, जिससे पूरा प्रयोग बेकार हो जाता है। इसके अलावा, आईएचसी को आमतौर पर एंटीजन एपिटोप20,21 के क्षरण से बचने के लिए स्लाइड-माउंटेड दृष्टिकोण का उपयोग करते समय अपेक्षाकृत जल्दी से किया जाना चाहिए, जिसमें आमतौर पर -20 या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत असंसाधित स्लाइड होते हैं, जो अक्सर क्षैतिज रूप से या स्लाइड बक्से में कवर और संग्रहीत होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अपेक्षाकृत बड़ा भंडारण पदचिह्न होता है। अंत में, स्लाइड-माउंटेड तकनीक भी समय लेने वाली हो सकती है यदि शोधकर्ताओं को बड़ी संख्या में ऊतक वर्गों को संसाधित करने के लिए बड़ी संख्या में स्लाइड को संभालना पड़ता है।

स्लाइड-माउंटेड विधि का उपयोग करके इनमें से कुछ चुनौतियों के कारण, फ्री-फ्लोटिंग विधि नामक एक संशोधन एक लोकप्रिय विकल्प बन गया है। यह तकनीक 1960-70 के दशक 22,23,24 में साहित्य में आई, 1980 के दशक में 25,26,27,28,29 में लोकप्रियता हासिल की, और अब एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है जिसमें 12,30,31 स्लाइड का पालन करने के बजाय निलंबन में एकत्रित वर्गों पर दाग करना शामिल है . मुक्त-फ्लोटिंग विधि की सिफारिश नहीं की जाती है जब ऊतक अनुभाग 20 μm से कम होते हैं; हालांकि, हमारे अनुभव में यह पसंद का दृष्टिकोण है जब मोटे (40-50 μm) वर्गों को दाग दिया जाना है। एक अलग लाभ यह है कि एंटीबॉडी सभी कोणों से मुक्त-फ्लोटिंग वर्गों में प्रवेश कर सकते हैं और अधिक प्रभावी धोने के कारण कम पृष्ठभूमि धुंधला उत्पन्न कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप इमेजिंग करते समय बेहतर सिग्नलिंग होती है। इसके अतिरिक्त, प्रसंस्करण के बाद अनुभागों को स्लाइड्स पर रखा जाता है, इस प्रकार ऊतक अलगाव की संभावना को समाप्त करने के साथ-साथ क्रायोस्टेट पर कब्जा करने के समय को कम किया जाता है। फ्री-फ्लोटिंग विधि भी बहुत कम श्रम गहन हो सकती है, खासकर बड़े पैमाने पर बायोमेडिकल अध्ययन के लिए। उदाहरण के लिए, एक ही नमूने से कई (18-40) वर्गों को एक ही कुएं में एक साथ दागना संभव है, जो धोने और एंटीबॉडी इनक्यूबेशन चरणों दोनों को करने में समय बचाता है। इसके अलावा, चूंकि इस दृष्टिकोण का उपयोग करके प्रति स्लाइड बड़ी संख्या (12-16) अनुभाग लगाए जा सकते हैं, इसलिए शोधकर्ता के लिए अनुभागों को देखना और छवि बनाना अक्सर अधिक सुविधाजनक और तेज होता है। विशेष रूप से, स्लाइड पर ऊतक स्लाइस के माउंटिंग के दौरान, वांछित अभिविन्यास प्राप्त होने तक अनुभागों को संलग्न और अलग किया जा सकता है। शोधकर्ता अक्सर फ्री-फ्लोटिंग विधि का उपयोग करके एंटीबॉडी की थोड़ी कम सांद्रता का उपयोग करते हैं, और चूंकि ऊष्मायन माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में किए जाते हैं, इसलिए एंटीबॉडी को आसानी से एकत्र किया जा सकता है और पुन: उपयोग के लिए सोडियम एज़ाइड के साथ संरक्षित किया जा सकता है (चरण 5.1 देखें)। एक और लाभ यह है कि वर्गों को क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान32 के साथ छोटे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में सीधे -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, जिससे भंडारण स्थान को कम किया जा सकता है और नमूने33 की दीर्घायु को अधिकतम किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करने का एक डाउन-साइड यह है कि अनुभागों को बहुत संभाला जाता है, और इस प्रकार क्षति के लिए उपयुक्त होते हैं। हालांकि, इसे कम झटकों और घूर्णन गति का उपयोग करके कम किया जा सकता है और साथ ही शोधकर्ताओं को ठीक से प्रशिक्षित किया जा सकता है कि नमूनों को कैसे स्थानांतरित किया जाए और स्लाइड पर अनुभागों को माउंट किया जाए।

एक साथ लिया गया, आईएचसी नैदानिक और जैव चिकित्सा अनुसंधान क्षेत्रों दोनों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की कल्पना और स्थानीयकरण के लिए एक स्थापित, आवश्यक उपकरण है। फ्री-फ्लोटिंग आईएचसी एक कुशल, लचीला, साथ ही आर्थिक विधि है, खासकर जब बड़े पैमाने पर हिस्टोलॉजिकल अध्ययन किया जाता है। यहां, हम वैज्ञानिक समुदाय के लिए एक विश्वसनीय फ्री-फ्लोटिंग फ्लोरोसेंट आईएचसी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसे क्रोमोजेनिक आईएचसी और हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन या क्रेसिल वायलेट स्टेनिंग जैसे अन्य धुंधलापन के लिए तदनुसार अनुकूलित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. क्रायोसेक्शनिंग के लिए ऊतक तैयार करना

  1. एक उपयुक्त नमूना मैट्रिक्स ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एक नमूना ब्लॉक बनाने और सूखी बर्फ पर फ्रीज करने के लिए एक उपयुक्त एम्बेडिंग मोल्ड ( सामग्री की तालिका देखें) में निश्चित ऊतकों को एम्बेड करें। अनुभाग के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना ब्लॉक स्टोर करें।
    नोट: निश्चित ऊतकों को आम तौर पर वयस्क (लगभग 2.5 - 30 महीने) नर या मादा कृन्तकों (माउस या चूहा) 34 को एक उपयुक्त फिक्सेटिव (जैसे 10% फॉर्मेलिन) के साथ तैयार किया जाता है, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए एक ही फिक्सेटिव में पोस्ट-फिक्सिंग ऊतकों को तैयार किया जाता है, ऊतकों को 1x PBS के साथ तीन बार धोया जाता है। और ऊतकों को रात भर के लिए या ऊतकों के डूबने तक 1x PBS में 15% और फिर30% सुक्रोज में रखना। शोधकर्ता इस सामान्य प्रोटोकॉल को विभिन्न विकास चरणों में अनुकूलित करने की कोशिश कर सकते हैं।

2. क्रायोसेक्शनिंग

  1. अनुभाग के लिए तैयार होने पर, ऊतक के टूटने को रोकने के लिए सेक्शनिंग से पहले क्रायोस्टेट में कम से कम 1-2 घंटे के लिए नमूने को अनुकूलित करें।
  2. क्रायोस्टेट का उपयोग करके, ऊतक को अनुभागों (20-50 μm) में काटें और 1x PBS समाधान से भरे 6 या 12-वेल इंसर्ट ( सामग्री की तालिका देखें) में एकत्र करें।
    नोट: अनुभाग मोटाई के आधार पर, कितना ऊतक एकत्र किया जाना है, और उपयोग किए गए कुएं की संख्या, प्रत्येक कुएं में अच्छी तरह से लगभग 10 से 40 स्लाइस तक फैले अनुभागों की एक चर संख्या होगी। उदाहरण के लिए, यदि पूरे मस्तिष्क को 40 μm पर विभाजित किया जाता है, तो 12-वेल इंसर्ट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में लगभग 18-24 खंड एकत्र किए जाएंगे। इसके अलावा, 20 μm अनुभागों को संभालना कुछ हद तक चुनौतीपूर्ण हो सकता है, इस प्रकार थोक धुंधलापन के लिए 40 μm की सिफारिश की जाती है (चर्चा देखें)।

3. भंडारण अनुभाग

  1. एक बार एकत्र होने के बाद, 5 मिनट के लिए ताजा तैयार 1x PBS के साथ अनुभागों को धो लें। 3 बार दोहराएं।
  2. 1-1.5 एमएल भंडारण समाधान से भरे 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में अनुभागों को स्थानांतरित करें (250 एमएल के लिए, 70 ग्राम सुक्रोज, 75 एमएल एथिलीन ग्लाइकोल मिलाएं, और 0.1 एम फॉस्फेट बफर के साथ मात्रा में लाएं)।
  3. धुंधला होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. धुंधला दिन I

  1. फ्रीजर से नमूने निकालें और 10 - 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर बराबर करें।
  2. अनुभागों से भंडारण समाधान को अलग करने के लिए 6-वेल प्लेट में एक अच्छी तरह से डालें।
  3. कुएं को लगभग 6 एमएल 1x TBS वाले कुएं में डालें। RT पर कम गति का उपयोग करके कक्षीय शेकर पर प्रत्येक पर 5 मिनट के लिए 1x TBS के साथ 3 बार धोएं।
  4. जबकि अनुभाग धो रहे हैं, एक ब्लॉकिंग-परमेबिलाइजिंग समाधान का 7 एमएल (प्रति नमूना) तैयार करें जिसमें 0.3% ट्राइटन एक्स -100 और 3% सामान्य सीरम (जैसे, सामान्य घोड़े का सीरम) के साथ 1 एक्स टीबीएस शामिल है। कम गति का उपयोग करके कक्षीय शेकर पर आरटी पर 30 मिनट के लिए खंडों को ब्लॉक करें।
    नोट: सेरा के साथ ब्लॉक करना ऊतक या गैर-विशिष्ट एफसी-रिसेप्टर्स के एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन को रोकता है - द्वितीयक एंटीबॉडी की प्रजातियों से मेल खाने वाले सीरम की सिफारिश की जाती है, लेकिन यदि उपलब्ध नहीं है, तो प्राथमिक एंटीबॉडी मेजबान जानवर से अलग प्रजाति से किसी भी सामान्य सीरम का उपयोग किया जा सकता है। डिटर्जेंट ट्राइटन एक्स -100 ऊतक को स्थिर करके बेहतर एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति देता है।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के प्रति नमूने 1 एमएल तैयार करें जिसमें 0.3% ट्राइटन एक्स -100 और 1% सामान्य सीरम के साथ 1 एक्स टीबीएस में चयनित प्राथमिक एंटीबॉडी (उचित रूप से पतला) शामिल है (चरण 4.4 नोट देखें)। अच्छी तरह से स्थानांतरित अनुभाग 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान होता है ताकि रुचि के एंटीजन (ओं) को बांधा जा सके।
    नोट: कई प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है (विभिन्न मेजबान प्रजातियों में उत्पन्न)।
  6. कम गति (जैसे, गति 7 आरपीएम) का उपयोग करके घूर्णन मिक्सर पर अनुभागों के साथ 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए रात भर इनक्यूबेट करें।

5. धुंधला दिन II

  1. अगले दिन, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान से वर्गों को अलग करने के लिए 6-वेल प्लेट में एक कुएं में अनुभाग डालें।
    नोट: एंटीबॉडी समाधान एकत्र और पुन: उपयोग किया जा सकता है; माइक्रोबियल विकास को रोकने के लिए 0.02% (डब्ल्यू / वी) सोडियम एज़ाइड जोड़ें।
  2. आरटी पर 1x TBS के साथ अनुभागों को 3 बार धोएं (पहले 2 धोने के लिए 30 सेकंड और अंतिम धोने के लिए 10 मिनट)।
  3. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के प्रति नमूने 1 एमएल तैयार करें जिसमें 0.3% ट्राइटन एक्स -100 और 1% सामान्य सीरम (प्रकाश से ढाल समाधान) के साथ 1 एक्स टीबीएस में उपयुक्त द्वितीयक एंटीबॉडी (तदनुसार पतला) शामिल है।
    नोट: संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ अप्रत्यक्ष लेबलिंग सिग्नल को बढ़ाती है और प्रोटीन लक्ष्य के कलरिमेट्रिक या फ्लोरोसेंट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है।
  4. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान युक्त 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में अनुभागों को स्थानांतरित करें। कम गति (प्रकाश से ढाल समाधान) का उपयोग करके कक्षीय शेकर पर आरटी पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान से वर्गों को अलग करने के लिए 6-वेल प्लेट में एक अच्छी तरह से डालें।
  6. नमूनों को प्रकाश से ढालना जारी रखते हुए, आरटी पर 30 सेकंड के लिए 1x TBS के साथ 2 बार धोएं। फिर 1x TBS में 15 मिनट के लिए धो लें, यदि चाहें तो DAPI (1-0.1 μg/ml) जोड़ें।

6. माउंटिंग

  1. एक ग्लास में अनुभाग डालें, आयताकार हिस्टोलॉजिकल कक्ष 1x TBS के साथ तीन-चौथाई भरा हुआ है।
  2. 1x TBS में एक ग्लास स्लाइड को डुबोएं और स्लाइड की ओर अनुभागों को ले जाने के लिए एक महीन पेंटब्रश का उपयोग करें।
  3. धीरे से स्लाइड पर अनुभागों को टैप करें, यह सुनिश्चित करें कि कोई झुर्रियां या सिलवटें नहीं हैं।
  4. तब तक दोहराएं जब तक कि सभी अनुभाग स्लाइड पर न चढ़ जाएं।
    नोट: जब एक पूरे मस्तिष्क को, उदाहरण के लिए, 40 μm पर वर्गीकृत किया जाता है, तो 18-24 खंडों वाले एक एलिकोट के साथ 12-वेल इंसर्ट में एकत्र किया जाता है; स्लाइस आमतौर पर 1-2 स्लाइड पर लगाए जाते हैं, लेकिन शोधकर्ता की पसंद के आधार पर प्रति स्लाइड कम अनुभाग भी लगाए जा सकते हैं।

7. कवरस्लिपिंग

  1. स्लाइड (ओं) पर खंडों को सूखने के बाद, आरटी पर लगभग 10-15 मिनट या जब तक खंड अपारदर्शी नहीं दिखते (प्रकाश से स्लाइड को ढालना याद रखें), एक उपयुक्त जलीय माउंटिंग माध्यम (कठोर या गैर-कठोर) लागू करें। फ्लोरोसेंट संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय एंटीफैडिंग को प्राथमिकता दी जाती है।
    नोट: कठोर माउंटिंग माध्यम का उपयोग करते समय प्रतिदीप्ति गुणवत्ता कम हो सकती है, लेकिन स्लाइड ्स लंबे समय तक चलना चाहिए।
  2. चिमटी का उपयोग करके, माध्यम के शीर्ष पर एक कवरस्लिप रखें। फ़िल्टर पेपर के साथ कवर करें और अतिरिक्त माउंटिंग माध्यम को हटाने के लिए मजबूती से दबाएं।
    नोट: यदि गैर-कठोर माउंट का उपयोग कर रहे हैं, तो सील करने के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवर स्लिप स्लाइड के किनारों को पेंट करें।
  3. एक उपयुक्त माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि अनुभाग। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे स्लाइड बॉक्स में स्टोर करें।
    नोट: शोधकर्ता की जरूरतों के आधार पर आवर्धन (जैसे, 10x, 20x, 40x) पर विभिन्न प्रकार के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अनुभागों को चित्रित किया जा सकता है, जैसे कि लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल और उल्टे या सीधे वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल परख करने के लिए फ्री-फ्लोटिंग विधि का उपयोग करने की समग्र योजना चित्रा 1 में चित्रित की गई है। ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) अभिव्यक्ति की जांच करने वाले माउस मस्तिष्क में फ्री-फ्लोटिंग विधि का उपयोग करके फ्लोरोसेंट आईएचसी का प्रतिनिधि उदाहरण धुंधला होने की समग्र गुणवत्ता को चित्रित करने के लिए कम और उच्च आवर्धन दोनों पर चित्रा 2 में दिखाया गया है। यह दृष्टिकोण कम-व्यक्त प्रोटीन को प्रकट करने के लिए भी उपयुक्त है, जिसमें जीएफपी कम-व्यक्त ट्रांसजेनिक माउस मस्तिष्क से एक उदाहरण चित्र 3 में दिखाया गया है। फ्री-फ्लोटिंग विधि का उपयोग अन्य हिस्टोकेमिकल स्टेनिंग प्रोटोकॉल में भी किया जा सकता है, जैसे कि क्रेसिल वायलेट, जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, प्रोटोकॉल के चरण 1 से 4.3 का पालन करके और फिर चरण 6 में बताए गए अनुभागों को बढ़ाकर। इसके बाद, अनुभागों को किसी भी धुंधलापन का उपयोग करके संसाधित किया जा सकता है जिसके लिए स्लाइड-माउंटेड अनुभागों की आवश्यकता होती है। क्रोमोजेनिक आईएचसी के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, चरण 1 से 5.6 तक प्रोटोकॉल का पालन करें (अंतिम धोने में डीएपीआई न जोड़ें), प्रवर्धन चरण (जैसे, एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स) का उपयोग करते समय तदनुसार समायोजित करें। सब्सट्रेट अभिकर्मक के साथ बफर को बदलें, 5-20 मिनट तक जब तक ऊतक वांछित रंग न बदल जाए। कम शक्ति माइक्रोस्कोप के साथ समय-समय पर ऊतक की जांच करके प्रतिक्रिया की निगरानी की जा सकती है। अनुभागों के साथ अच्छी तरह से डालने को ताजा बफर में ले जाकर प्रतिक्रिया को समाप्त करें, उन्हें तीन बार धोएं, कम से कम 5 मिनट। चरण 6 के साथ आगे बढ़ें ताकि अनुभागों को ग्लास स्लाइड पर माउंट किया जा सके, जिससे अनुभाग कम से कम 3-4 घंटे के लिए स्लाइड वार्मर पर सूख सकें। बढ़ती इथेनॉल सांद्रता (यानी, 70%, 90%, 95%, 99.5%, 2-5 मिनट प्रत्येक) के साथ स्लाइड्स को निर्जलित करें, इसके बाद जाइलीन (5-10 मिनट) और फिर एक हार्ड-माउंटिंग माध्यम (जैसे, एंटेलन) के साथ स्लाइड को कवर करें, जिससे स्लाइड को हवादार क्षेत्र में कम से कम 1-2 घंटे सूखने की अनुमति मिलती है। यदि पृष्ठभूमि बहुत अधिक है, तो 1x TBSमें 3% H2 O 2के साथ आरटी पर 15 मिनट के लिए अंतर्जात पेरोक्सीडेज गतिविधि को बुझाएं, इसके बाद ब्लॉक करने से पहले तीन बफर वॉश, 15-20 मिनट (चरण 4.4)। कई परिधीय ऊतक भी प्रोटोकॉल के आवश्यक संशोधनों के बिना इस तकनीक का उपयोग करने के लिए उत्तरदायी हैं, जिसमें जीएफपी-व्यक्त माउस से यकृत वर्गों का एक उदाहरण चित्र 5 में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: फ्री-फ्लोटिंग फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल परख का प्रवाह चार्ट। रुचि के अंग (अधिमानतः निश्चित ऊतक) को विच्छेदित करें और नमूना मैट्रिक्स ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके मोल्डों को एम्बेड करने में ऊतक को एम्बेड करें ( सामग्री की तालिका देखें), और फिर सूखी बर्फ पर जम जाएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 20-50 μm पर क्रायोस्टेट का उपयोग करके अनुभाग ऊतक और 1x PBS से भरे अच्छी तरह से सम्मिलित ( सामग्री की तालिका देखें) में स्लाइस एकत्र करें। कम गति पर कक्षीय शेकर का उपयोग करके, 1x PBS में प्रत्येक 5 मिनट के लिए अनुभाग 3x धोएं। इस बिंदु पर, आवश्यकता होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण बफर में अतिरिक्त अनुभागों को स्टोर करें। शेष खंडों को 5 मिनट के लिए 1x TBS के साथ धोएं। कम गति से RT झटकों पर 30 मिनट के लिए अनुभागों को ब्लॉक करें। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस (12-14 घंटे) पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (ओं) में रात भर अनुभागों को इनक्यूबेट करें। अगले दिन, 1x TBS 3x के साथ अनुभागों को धोएं, पहले दो 30 सेकंड के लिए धोएं, तीसरे 10 मिनट के लिए धोएं। आरटी में 2 घंटे के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (ओं) में द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान में वर्गों को इनक्यूबेट करें, इस कदम से संभव होने पर वर्गों को प्रकाश से ढालना सुनिश्चित करें। फिर 3x को 1x TBS से धोएं, पहले दो वॉश 30 s के लिए और तीसरा 15 मिनट के लिए धो लें। यदि वांछित हो और यदि बढ़ते माध्यम में मौजूद नहीं है तो अंतिम धोने के लिए DAPI जोड़ें। एक कक्ष बॉक्स में अनुभाग डालें, 1x TBS से भरे तीन-चौथाई, और स्लाइड (ओं) पर अनुभागों का पालन करने के लिए पेंटब्रश का उपयोग करें। पसंद के बढ़ते माध्यम के साथ कवर करने से पहले स्लाइड्स को सूखने दें (~ 10-15 मिनट)। एक उपयुक्त माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि अनुभाग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फ्री-फ्लोटिंग मस्तिष्क वर्गों का उपयोग करके फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। वयस्क माउस में जीएफएपी अभिव्यक्ति की जांच करने वाले हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क क्षेत्रों को दिखाया गया है और खरगोश में उठाए गए एंटी-जीएफएपी प्राथमिक एंटीबॉडी और गधे में उठाए गए एक एंटी-खरगोश एलेक्सा 568 द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके लेबल किया गया था। नाभिक को लेबल करने के लिए अंतिम धोने में DAPI का उपयोग किया गया था। ऊतक को क्रायोस्टेट का उपयोग करके 40 μm पर वर्गीकृत किया गया था। छवियों को लेजर पॉइंट स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 10x (ऊपरी) और 40x (निचले) आवर्धन पर लिया गया था। 10x छवि स्केल बार = 400 μm. 40x छवि स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: फ्री-फ्लोटिंग विधि का उपयोग करके कम-व्यक्त प्रोटीन पर फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। कम व्यक्त जीएफपी ट्रांसजेनिक वयस्क माउस से हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क क्षेत्रों को दिखाया गया है। जीएफपी को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स को बकरी में उठाए गए एंटी-जीएफपी प्राथमिक एंटीबॉडी और गधे में उठाए गए एक एंटी-बकरी एलेक्सा 488 द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके लेबल किया गया था। नाभिक को लेबल करने के लिए अंतिम धोने में DAPI का उपयोग किया गया था। ऊतक को क्रायोस्टेट का उपयोग करके 40 μm पर वर्गीकृत किया गया था। छवियों को लेजर पॉइंट स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 40x आवर्धन पर लिया गया था। स्केल बार = 100 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: फ्री-फ्लोटिंग मस्तिष्क वर्गों का उपयोग करके क्रेसिल वायलेट धुंधला होना। क्रायोस्टेट का उपयोग करके, वयस्क माउस घ्राण बल्ब से सेरिबैलम तक 40 μm खंड एकत्र किए गए, धोए गए, स्लाइड पर लगाए गए, क्रेसिल वायलेट से दाग दिए गए, और कवर को लपेटा गया। छवियों को उल्टे वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 10x आवर्धन पर लिया गया था। स्केल पट्टी = 1 मिमी . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: फ्री-फ्लोटिंग लिवर सेक्शन का उपयोग करके फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। जीएफपी के निम्न स्तर को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक वयस्क माउस से क्रायोस्टैट का उपयोग करके 40 μm पर लिए गए यकृत के खंड दिखाए गए हैं। गधे में उठाए गए एंटी-बकरी एलेक्सा 488 द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ बकरी में उठाए गए एक एंटी-जीएफपी प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग जीएफपी व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को लेबल करने के लिए किया गया था। नाभिक को लेबल करने के लिए DAPI को अंतिम धोने में जोड़ा गया था। छवियों को 40x आवर्धन पर एक लेजर पॉइंट स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकत्र किया गया था। स्केल बार = 100 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) एक बहुमुखी तकनीक है जो ऊतक वर्गों के भीतर प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण की पहचान करने में महत्वपूर्ण हो गई है। इस परख का उपयोग पूरे वैज्ञानिक समुदाय में सामान्य कार्य के चरणों में ऊतक की विशेषताओं को समझने के लिए किया जाता है। आईएचसी को कैंसर जैसी बीमारियों के नैदानिक निदान से लेकर प्रीक्लिनिकल अनुसंधान10,36 में प्रारंभिक खोजों तक विभिन्न क्षेत्रों में नियोजित किया जाता है।

आईएचसी करने के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली तकनीक स्लाइड-माउंटेड विधि है जिसमें खंडों को स्लाइस करने के बाद तुरंत स्लाइड का पालन किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग करने के कुछ फायदे यह हैं कि शोधकर्ता प्रोटीन कोलोकलाइजेशन अध्ययन के लिए आवश्यक बहुत पतले वर्गों को संभाल सकते हैं और प्रति स्लाइड अनुभागों को दागने के लिए थोड़ा समाधान का उपयोग कर सकते हैं। एंटीबॉडी अक्सर महंगे होते हैं; इसलिए, यह दृष्टिकोण एक आर्थिक विकल्प हो सकता है यदि कुछ वर्गों को संसाधित किया जाना है। यह ताजा जमे हुए नमूनों का उपयोग करने वाले शोधकर्ताओं के लिए पसंद की विधि भी है क्योंकि ऊतक की हैंडलिंग न्यूनतम है, इस प्रकार ऊतक की संरचनात्मक अखंडता की रक्षा की जाएगी। स्लाइड-माउंटेड दृष्टिकोण का उपयोग करना भी उचित होगा यदि केवल कुछ खंडों को एकत्र किया जाना है और तुरंत दाग दिया जाना है, जैसा कि नैदानिक विकृति में होता है। दूसरी ओर, कुछ नुकसान हैं, जैसे कि धुंधला होने के दौरान ऊतक के केवल उजागर पक्ष तक पहुंच जाता है, इस प्रकार खराब एंटीबॉडी प्रवेश और प्रभावी धोने के कारण अनुभाग मोटाई सीमित हो जाती है। एक और दोष यह है कि एक बार ऊतक को विभाजित करने और स्लाइड पर एकत्र करने के बाद, आईएचसी को आम तौर पर असंसाधित स्लाइडों के भंडारण के साथ जल्दी से पूरा किया जाना चाहिए। इसके अलावा, बड़े प्रयोगों को संसाधित करते समय (उदाहरण के लिए, कई, प्रतिनिधि स्तरों वाले कई मस्तिष्क क्षेत्रों को दाग दिया जाता है), यह दृष्टिकोण वास्तव में अधिक अभिकर्मकों का उपयोग कर सकता है, बल्कि समय लेने वाला हो सकता है, और अक्सर प्रति प्रयोग संसाधित होने वाली स्लाइडों की संख्या को सीमित कर सकता है।

स्लाइड-माउंटेड विधि से जुड़ी कुछ सीमाओं को फ्री-फ्लोटिंग स्टेनिंग तकनीक द्वारा दूर किया जा सकता है जो मोटे वर्गों के साथ काम करते समय एक तेजी से लोकप्रिय विकल्प बन गया है। यद्यपि यह विधि एक नया दृष्टिकोण नहीं है, हमारे अनुभव में, यह एक विश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और लचीला दृष्टिकोण रहा है, विशेष रूप से थोक में ऊतक के नमूनों को धुंधला करने के लिए, इस प्रकार एक कुशल तरीके से बड़े पैमाने पर अध्ययनों के प्रसंस्करण की अनुमति देता है। शोधकर्ता इस विधि के साथ एक ही समय में कई, बड़े आईएचसी प्रयोगों को प्रभावी ढंग से चला सकते हैं। इसके अलावा, नमूने निलंबन में दागदार होते हैं, इस प्रकार समाधान सभी कोणों से वर्गों में प्रवेश कर सकते हैं, विशेष रूप से मोटे वर्गों के लिए महत्वपूर्ण, अक्सर उच्च गुणवत्ता वाले दाग (चित्रा 2, चित्रा 3, और चित्रा 5) की ओर ले जाते हैं। फ्री-फ्लोटिंग सेक्शन को मोटाई37 में 20-50 μm से कहीं भी काटा जा सकता है, जिसमें मोटे खंड शोधकर्ताओं के लिए विभिन्न मैदानों में संरचनाओं या कोशिकाओं को देखने के लिए उपयोगी होते हैं। उदाहरण के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों में, मोटे खंड शोधकर्ताओं को अपने नमूनों में डेंड्राइट और अक्षतंतु की संरचना को देखने की अनुमति देते हैं। पतले स्लाइस (20 μm) एकत्र करने की क्षमता अनुप्रयोगों के स्पेक्ट्रम को और भी व्यापक बनाती है; हालांकि, पतले स्लाइस को संभालना मुश्किल हो सकता है और अक्सर क्षति को कम करने के लिए अधिक समय और प्रयास की आवश्यकता होती है, इस प्रकार थोक धुंधला होने के लिए अनुभाग 40 μm से पतले नहीं होने चाहिए। फ्री-फ्लोटिंग विधि का एक प्रमुख लाभ यह है कि शोधकर्ता जल्दी से पूरे दिमाग (या अन्य ऊतक) को विभाजित कर सकते हैं, प्रत्येक एलिकोट के साथ छोटे ट्यूबों में सभी वर्गों को एकत्र कर सकते हैं, जिसमें सभी अलग-अलग मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए एक प्रतिनिधि टुकड़ा होता है, इस प्रकार शोधकर्ताओं को पूरे मस्तिष्क को जल्दी से दागने की अनुमति मिलती है। स्लाइस युक्त ट्यूबों को कई वर्षों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोप्रोटेक्टेंट में संग्रहीत किया जा सकता है, जिसमें एलिकोट ज्यादा फ्रीजर स्पेस नहीं लेते हैं,प्रभावी रूप से शोधकर्ताओं को "ऊतक पुस्तकालय" उत्पन्न करने की अनुमति देते हैं। यह विधि स्लाइड, कवरलिप्स और विशेष रूप से एंटीबॉडी सहित बर्बाद सामग्री की मात्रा को भी कम करती है, जिसे आसानी से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है और पुन: उपयोग के लिए संरक्षित किया जा सकता है, साथ ही साथ कीमती जानवरों के ऊतकों को भी वर्गों को संग्रहीत और सहेजा जा सकता है जब तक उपयोगकर्ता चुनते हैं।

फ्री-फ्लोटिंग दृष्टिकोण और यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को प्रोटोकॉल को आसानी से संशोधित करने या संसाधनों को पुन: उपयोग करने का विकल्प भी देता है। उदाहरण के लिए, एकत्रित वर्गों का उपयोग सरल प्रोटोकॉल संशोधनों के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस के अलावा कई अलग-अलग हिस्टोकेमिकल दागों के लिए किया जा सकता है, जैसे क्रोमोजेनिक आईएचसी, हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई), क्रेसिल वायलेट (चित्रा 4), और आरएनएस्कोप38। क्रोमोजेनिक आईएचसी एंटीजन अभिव्यक्ति के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है जब एक घुलनशील सब्सट्रेट को एक एंजाइम द्वारा संयुग्मित एंजाइम द्वारा एक अघुलनशील क्रोमोजेनिक उत्पाद में द्वितीयक एंटीबॉडी में परिवर्तित किया जाता है। सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले दो एंजाइम हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) हैं, जो 3,3 'डायमिनोबेंज़िडाइन (डीएबी) को गहरे भूरे रंग के अंत-उत्पाद में परिवर्तित करता है, और क्षारीय फॉस्फेट (एपी), जो 3-एमिनो-9-एथिलकार्बाज़ोल (एईसी) सब्सट्रेट को लाल उत्पाद39 में परिवर्तित करता है। हम नियमित रूप से क्रेसिल वायलेट धुंधला करते हैं और सकल मस्तिष्क संगठन और आकृति विज्ञान40 की जांच करने के लिए फ्री-फ्लोटिंग सेक्शन का उपयोग करते हैं। हमने इस प्रोटोकॉल को मस्तिष्क, यकृत, हृदय, गुर्दे और प्लीहा (चित्रा 5) सहित कई अलग-अलग ऊतकों पर सफलतापूर्वक लागू किया है। अन्य शोधकर्ताओं ने भी यकृत, गुर्दे और अंडाशय 22,23,24 सहित परिधीयऊतकों के लिए इस तकनीक का सफलतापूर्वक उपयोग किया है।

फ्री-फ्लोटिंग तकनीक का उपयोग करते समय एक प्रमुख चिंता ऊतक वर्गों को संरचनात्मक क्षति की संभावना है, विशेष रूप से मस्तिष्क स्लाइस के लिए, क्योंकि पूरे प्रोटोकॉल के दौरान, नमूने लगभग हर चरण के दौरान शेकर्स और रोटेटर पर होते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे समान रूप से धोए गए, अवरुद्ध और दागदार हों। कभी-कभी, विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र अलग हो सकते हैं, खासकर अनुमस्तिष्क स्तरों पर; हालांकि, बढ़ती प्रक्रिया के दौरान एक मस्तिष्क एटलस और आवर्धन के एक रूप का उपयोग करना, जैसे कि जौहरी का दीपक, वर्गों को एक साथ जोड़ने के लिए सहायक हो सकता है। इस चुनौती को आमतौर पर नमूनों की कोमल हैंडलिंग के माध्यम से और सही, कम सेटिंग पर घूर्णन मशीनों को रखकर रोका जा सकता है।

निष्कर्ष में, हम एक स्थापित फ्री-फ्लोटिंग आईएचसी तकनीक प्रस्तुत करते हैं जो एक अपरिहार्य, भरोसेमंद, लचीला और कुशल साधन साबित हुआ है जिसे हम नियमित रूप से प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण के साथ-साथ विभिन्न ऊतकों में ऊतक संरचना की कल्पना करने के लिए उपयोग करते हैं। यहां प्रोटोकॉल को आसानी से व्यक्तिगत अनुसंधान आवश्यकताओं को फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है जिससे यह वैज्ञानिक समुदाय के लिए मूल्यवान हो जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं

Acknowledgments

हम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग (K99/R00 AG055683 से JMR), जॉर्ज एंड ऐनी रयान इंस्टीट्यूट फॉर न्यूरोसाइंस (EP, GC, JMR), रोड आइलैंड विश्वविद्यालय में फार्मेसी कॉलेज (EP, GC, JMR), और कोनुंग गुस्ताफ V: s och Drottning Victorias Frimuraresttelse (JMR) को स्वीकार करना चाहते हैं। हम डॉक्टरेट छात्र रेबेका सेंफ्ट, प्रोफेसर सुसान डाइमेकी, जेनेटिक्स विभाग, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल के साथ प्रशिक्षण, हमें फ्री-फ्लोटिंग विधि से परिचित कराने के लिए धन्यवाद देते हैं। चित्रा 1 में उपयोग की गई कुछ छवियों को "उपयोग करने, साझा करने या संशोधित करने के लिए स्वतंत्र, यहां तक कि व्यावसायिक रूप से" स्रोतों से प्राप्त किया गया था: माउस और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (पिक्साबे), माउस मस्तिष्क (जोनास टोले, विकिमीडिया कॉमन्स), क्रायोस्टेट और माउस मस्तिष्क अनुभाग (डेटाबेस सेंटर फॉर लाइफ साइंस, विकिमीडिया कॉमन्स), ग्लास कंटेनर (ओपनक्लिपार्ट, FreeSvg.org), और माइक्रोस्कोप (थेरेसा नॉट, ओपन क्लिप आर्ट लाइब्रेरी)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 3513
6-well plates Corning 3516
Clear nail polish User preference N/A
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Embedding molds Thermo Scientific 1841
Ethylene glycol User preference N/A
Formalin solution Fisher Scientific SF98-4
Horse serum, heat inactivated Gibco 26050088
Microscope slide boxes Electron Microscopy Services 71370
PBS User preference N/A
Primary antibody User preference N/A
Rectangular Coverslips VWR 48393-081 24 x 50 mm
Rectangular staining dish Electron Microscopy Services 70312
Round artist paintbrush #2 Princeton Select Series 3750R Brand not important
Secondary antibody User preference N/A
Specimen matrix for embedding OCT Tissue-Tek, Sakura 4583
Stain tray – slide staining system Electron Microscopy Services 71396-B Use dark lid
Sucrose User preference N/A
Superfrost Plus Micro Slides VWR 48311-703
TBS User preference N/A
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vectashield antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000 Non-hardening
Well inserts for 12-well plates Corning Netwells 3477
Well inserts for 6-well plates Corning Netwells 3479
Whatman filter paper Millapore-Sigma WHA1440042

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
  2. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  3. Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
  4. Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374 (1999).
  5. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  6. Hermersdörfer, H. Immunocytochemistry. A Practical Approach. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).
  7. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of Immunohistochemistry. Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  8. Coons, A. H. International Review of Cytology. International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).
  9. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
  10. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).
  11. Li, A., Yang, D. H. Methods in Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. 2108, Clifton, N.J. 43-55 (2020).
  12. Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
  13. Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
  15. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, Clifton, N.J. 55-61 (2010).
  16. van der Loos, C. A focus on fixation. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  19. Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
  20. Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
  21. Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
  22. Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
  23. Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
  24. Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
  25. Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
  26. Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
  27. Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
  28. Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
  29. Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
  30. Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
  31. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
  32. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
  33. Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
  34. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  35. Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
  36. Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
  37. Burry, R. W. Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
  38. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
  39. Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , Springer. 207-262 (1981).
  40. Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).

Tags

जीव विज्ञान अंक 162 हिस्टोकेमिस्ट्री इम्यूनोफ्लोरेसेंस इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री फ्री फ्लोटिंग मस्तिष्क उम्र बढ़ने न्यूरोडीजेनेरेशन प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोटीन विज़ुअलाइज़ेशन एंटीबॉडी लेबलिंग
फ्री-फ्लोटिंग ऊतक अनुभागों का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल-आधारित धुंधलापन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross,… More

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (162), e61622, doi:10.3791/61622 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter