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Biology

Colorations histologiques utilisant des sections de tissus flottant librement

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61622
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1George & Anne Ryan Institute for Neuroscience, College of Pharmacy, Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, University of Rhode Island, 2Department of Neuroscience, Biomedicum, Karolinska Institutet

Summary

La technique de flottaison libre permet aux chercheurs d’effectuer des colorations histologiques, y compris l’immunohistochimie, sur des coupes de tissus fixes afin de visualiser les structures biologiques, le type cellulaire et l’expression et la localisation des protéines. Il s’agit d’une technique histochimique efficace et fiable qui peut être utile pour étudier une multitude de tissus, tels que le cerveau, le cœur et le foie.

Abstract

L’immunohistochimie est une technique largement utilisée pour visualiser des structures tissulaires spécifiques ainsi que l’expression et la localisation des protéines. Deux approches alternatives sont largement utilisées pour manipuler les sections de tissu pendant la procédure de coloration, une approche consiste à monter les sections directement sur des lames de verre, tandis qu’une seconde approche, la flottante, permet de maintenir et de colorer les sections fixes en suspension. Bien que les approches montées sur glissière et flottantes puissent donner des résultats similaires, la technique de flottaison libre permet une meilleure pénétration des anticorps et devrait donc être la méthode de choix lorsque des sections plus épaisses doivent être utilisées pour la reconstruction 3D des tissus, par exemple lorsque l’objectif de l’expérience est d’obtenir des informations sur les projections dendritiques et axonales dans les régions du cerveau. De plus, comme les sections sont maintenues en solution, une seule partie aliquote peut facilement accueillir 30 à 40 sections, dont la manipulation est moins laborieuse, notamment dans les études biomédicales à grande échelle. Ici, nous illustrons comment appliquer la méthode de flottaison libre à la coloration immunohistochimique fluorescente, en mettant l’accent sur les sections du cerveau. Nous discuterons également de la façon dont la technique de flottaison libre peut facilement être modifiée pour répondre aux besoins individuels des chercheurs et adaptée à d’autres tissus ainsi qu’à d’autres colorations histochimiques, telles que l’hématoxyline, l’éosine et le violet de crésyle, à condition que les échantillons de tissus soient correctement fixés, généralement avec du paraformaldéhyde ou du formol.

Introduction

L’immunomarquage est une pratique de recherche populaire qui a commencé il y a 130 ans avec la découverte des anticorps sériques en 1890 par Von Behring1. Au début du 20esiècle, des colorants ont été attachés à des antigènes et plus tard à des anticorps afin de quantifier et de visualiser les réactions1, et en 1941 Albert Coons a développé les premiers marqueurs d’anticorps fluorescents, une découverte qui a révolutionné la microscopie optique 2,3. Le terme « immunomarquage » englobe de nombreuses techniques qui ont été développées en utilisant ce principe, y compris le transfert Western, la cytométrie en flux, l’ELISA, l’immunocytochimie et l’immunohistochimie 3,4. Le transfert Western détecte la présence de protéines spécifiques provenant d’extraits tissulaires ou cellulaires5. Les protéines sont séparées par taille à l’aide d’une électrophorèse sur gel, transférées sur une membrane et sondées à l’aide d’anticorps. Cette technique indique la présence de protéines et la quantité de protéines présentes; Cependant, il ne révèle aucune information sur la localisation de la protéine dans les cellules ou les tissus. Une autre méthode, l’immunocytochimie (ICC), marque les protéines dans les cellules, généralement des cellules cultivées in vitro. ICC montre à la fois l’expression et la localisation des protéines dans les compartiments cellulaires6. Pour détecter et visualiser une protéine spécifique au niveau tissulaire, l’immunohistochimie (IHC) est utilisée.

IHC est une méthode que les chercheurs utilisent pour cibler des antigènes spécifiques dans les tissus, en tirant parti des propriétés chimiques du système immunitaire 7,8. En générant des anticorps primaires et secondaires spécifiques liés à une enzyme ou à un colorant fluorescent, les antigènes d’intérêt peuvent être marqués et révélés dans la plupart des tissus (comme indiqué dans Mepham et Britten)9. Le terme « immunohistochimie » en lui-même ne précise pas la méthode de marquage utilisée pour révéler l’antigène d’intérêt; ainsi, cette terminologie est souvent combinée avec la technique de détection pour délimiter clairement la méthode de marquage : immunohistochimie chromogène (ICH) pour indiquer quand l’anticorps secondaire est conjugué à une enzyme, telle que la peroxydase ; ou IHC fluorescent pour indiquer quand l’anticorps secondaire est conjugué à un fluorophore, tel que l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou la tétraméthylrhodamine (TRITC). La sélectivité de l’IHC permet aux cliniciens et aux chercheurs de visualiser l’expression et la distribution des protéines dans les tissus, à travers divers états de santé et de maladie10. Dans le domaine clinique, IHC est couramment utilisé pour diagnostiquer le cancer, ainsi que pour déterminer les différences dans divers types de cancer. IHC a également été utilisé pour confirmer différents types d’infections microbiennes dans le corps, telles que l’hépatite B ou C11. Dans la recherche biomédicale, l’IHC est souvent utilisé pour cartographier l’expression des protéines dans les tissus et est important pour identifier les protéines anormales observées dans les états pathologiques. Par exemple, la neurodégénérescence s’accompagne souvent d’une accumulation de protéines anormales dans le cerveau, telles que des plaques Αβ et des enchevêtrements neurofibrillaires dans la maladie d’Alzheimer. Des modèles animaux sont souvent développés pour imiter ces états pathologiques, et IHC est une méthode que les chercheurs utilisent pour localiser et quantifier les protéines d’intérêt10,12,13. À notre tour, nous pouvons en apprendre davantage sur les causes de ces maladies et les complications qui en découlent.

L’exécution de l’IHC comporte de nombreuses étapes. Tout d’abord, le tissu d’intérêt est recueilli et préparé pour la coloration. On peut soutenir que la plupart des chercheurs préparent des échantillons de tissus fixes, la perfusion du fixateur via le système circulatoire étant optimale car elle préserve la morphologie14,15. La post-fixation d’échantillons de tissus peut également être utilisée, mais peut donner des résultats inférieurs à l’idéal16. Les fixateurs de réticulation, tels que le formaldéhyde, agissent en créant des liaisons chimiques entre les protéines du tissu17. Les tissus fixes sont ensuite découpés en couches ou sections très minces à l’aide d’un microtome, de nombreux chercheurs préférant collecter des sections congelées à l’aide d’un cryostat. De là, le tissu est recueilli et soit monté directement sur une lame de microscope (méthode montée sur lame), soit suspendu dans une solution (méthode flottante), telle qu’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)18. La méthode de collecte utilisée est prédéterminée en fonction des besoins du chercheur, chacune de ces deux méthodes présentant ses propres avantages et inconvénients.

La méthode montée sur lame est de loin la plus couramment utilisée, avec un avantage important étant que des sections très minces (10-14 μm) peuvent être préparées, ce qui est important, par exemple, pour étudier les interactions protéine-protéine. La manipulation de l’échantillon est également minimale, ce qui réduit les dommages potentiels à l’intégrité structurelle du tissu19. Les chercheurs utilisent souvent cette technique avec des tissus frais congelés (tissus immédiatement congelés à l’aide de glace sèche, d’isopentane, etc.), ce qui est très délicat par rapport aux tissus fixes et il faut prendre beaucoup de précautions pour empêcher la décongélation de l’échantillon. Un autre avantage de l’utilisation de sections montées sur glissière est que de grands volumes de solutions pour la coloration ne sont généralement pas nécessaires4. Ainsi, les chercheurs peuvent utiliser une plus petite quantité d’anticorps coûteux ou d’autres produits chimiques pour compléter la coloration. De plus, il est possible de monter des sections de plusieurs groupes expérimentaux différents sur la même diapositive, ce qui peut être avantageux, en particulier lors de l’acquisition d’images. D’autre part, l’utilisation de sections montées sur lame présente certains inconvénients, notamment le fait que la section de tissu est collée à la lame, limitant ainsi la pénétration des anticorps d’un côté de la section, ce qui limite l’épaisseur de la section et la représentation 3D du tissu. Il peut également arriver que pendant les lavages, les bords du tissu et des sections entières se détachent de la lame, rendant inutile toute l’expérience. De plus, l’IHC doit généralement être effectuée relativement rapidement lors de l’utilisation de l’approche montée sur lame pour éviter la dégradation de l’épitope de l’antigène 20,21 avec des lames non traitées généralement stockées à -20 ou -80 ° C, souvent glissées et stockées horizontalement ou dans des boîtes à lames, ce qui entraîne un encombrement de stockage relativement important. Enfin, la technique montée sur lame peut également prendre beaucoup de temps si les chercheurs doivent manipuler un grand nombre de lames pour traiter un grand nombre de sections de tissus.

En raison de certains de ces défis utilisant la méthode montée sur glissière, une modification appelée méthode flottante est devenue une alternative populaire. Cette technique est entrée dans la littérature dans les années 1960-70 22,23,24, gagnant en popularité dans les années 1980 25,26,27,28,29, et est maintenant une méthode bien établie qui consiste à effectuer la coloration sur les sections collectées en suspension plutôt que d’adhérer à une lame 12,30,31 . La méthode de flottaison libre n’est pas recommandée lorsque les coupes de tissu sont inférieures à 20 μm; Cependant, d’après notre expérience, c’est l’approche de choix lorsque des sections plus épaisses (40-50 μm) doivent être colorées. Un avantage distinct est que les anticorps peuvent pénétrer les sections flottantes sous tous les angles et générer moins de coloration de fond en raison d’un lavage plus efficace, ce qui entraîne une meilleure signalisation lors de l’imagerie. De plus, les sections sont montées sur les lames après le traitement, éliminant ainsi la possibilité de détachement des tissus et réduisant le temps d’occupation du cryostat. La méthode de flottaison libre peut également être beaucoup moins exigeante en main-d’œuvre, en particulier pour les études biomédicales à grande échelle. Par exemple, il est possible de colorer plusieurs sections (18-40) du même échantillon dans le même puits, ce qui permet de gagner du temps dans les étapes de lavage et d’incubation des anticorps. De plus, étant donné qu’un plus grand nombre (12-16) de sections peuvent être montées par diapositive en utilisant cette approche, il est souvent plus pratique et plus rapide pour le chercheur de visualiser et d’imager les sections. Notamment, lors du montage des tranches de tissu sur les lames, les sections peuvent être attachées et détachées jusqu’à ce que l’orientation souhaitée soit obtenue. Les chercheurs utilisent aussi souvent des concentrations légèrement inférieures d’anticorps en utilisant la méthode de flottaison libre, et comme les incubations sont effectuées dans des tubes de microcentrifugation, les anticorps peuvent être facilement recueillis et conservés avec de l’azoture de sodium pour la réutilisation (voir l’étape 5.1). Un autre avantage est que les sections peuvent être directement stockées à -80 °C dans de petits tubes microcentrifugés avec une solution cryoprotectrice32, minimisant ainsi l’espace de stockage et maximisant la longévité des échantillons33. Un inconvénient de l’utilisation de cette technique est que les sections sont beaucoup manipulées et sont donc susceptibles d’être endommagées. Cependant, cela peut être atténué en utilisant de faibles vitesses d’agitation et de rotation ainsi qu’en formant correctement les chercheurs à transférer les échantillons et à monter les sections sur les lames.

Pris ensemble, IHC est un outil établi et essentiel pour visualiser et localiser l’expression des protéines dans les domaines de la recherche clinique et biomédicale. L’IHC flottant est une méthode efficace, flexible et économique, en particulier lors de la réalisation d’études histologiques à grande échelle. Ici, nous présentons un protocole IHC fluorescent flottant fiable pour la communauté scientifique qui peut être adapté en conséquence pour l’IHC chromogène et d’autres colorations telles que l’hématoxyline et l’éosine ou la coloration au violet de crésyle.

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Protocol

1. Préparation tissulaire pour la cryosectionnement

  1. Incorporer les tissus fixes dans un moule d’encastrement approprié (voir le tableau des matériaux) pour créer un bloc d’échantillon à l’aide d’une matrice d’échantillons appropriée (voir le tableau des matériaux) et congeler sur de la glace sèche. Conserver les blocs d’échantillons à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être sectionnés.
    NOTE: Les tissus fixes sont généralement préparés par des rongeurs adultes (environ 2,5 à 30 mois) mâles ou femelles (souris ou rat)34, conformément au permis éthique disponible, avec un fixateur approprié (par exemple 10% de formol), suivi de post-fixation dans le même fixateur pendant 12 h à 4 °C, en lavant les mouchoirs trois fois avec 1x PBS, et placer les tissus dans 15% puis 30% de saccharose dans 1x PBS pour la nuit ou jusqu’à ce que les tissus coulent35. Les chercheurs peuvent essayer d’adapter ce protocole général à différents stades de développement.

2. Cryosectionnement

  1. Lorsque vous êtes prêt à sectionner, acclimater les échantillons dans le cryostat pendant au moins 1 à 2 heures avant la section, afin d’éviter l’éclatement des tissus.
  2. À l’aide d’un cryostat, couper le tissu en sections (20-50 μm) et recueillir dans des inserts de 6 ou 12 puits (voir le tableau des matériaux) remplis de 1x solution de PBS.
    REMARQUE : Selon l’épaisseur de la section, la quantité de tissu à recueillir et le nombre d’inserts de puits utilisés, chaque puits contiendra un nombre variable de sections allant d’environ 10 à 40 tranches pour le puits. Par exemple, si un cerveau entier est sectionné à 40 μm, environ 18 à 24 sections seront collectées dans chaque puits à l’aide d’inserts de 12 puits. De plus, les sections de 20 μm peuvent être quelque peu difficiles à manipuler, c’est pourquoi 40 μm sont recommandés pour la coloration en vrac (voir Discussion).

3. Stockage des sections

  1. Une fois recueillies, laver les sections avec 1x PBS fraîchement préparé pendant 5 min. Répétez 3 fois.
  2. Transférer les sections dans des tubes microcentrifugés de 2 mL remplis de 1 à 1,5 mL de solution de stockage (pour 250 mL, mélanger 70 g de saccharose, 75 mL d’éthylène glycol et porter au volume avec un tampon phosphate de 0,1 M).
  3. Conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être taché.

4. Jour de coloration I

  1. Retirer les échantillons du congélateur et équilibrer à température ambiante (TR) pendant 10 à 20 min.
  2. Verser les sections dans un insert de puits dans une plaque à 6 puits pour séparer la solution de stockage des sections.
  3. Déplacer l’insert de puits vers un autre puits contenant environ 6 mL de 1x TBS. Laver 3 fois avec 1x TBS pendant 5 minutes chacun sur un agitateur orbital en utilisant basse vitesse à RT.
  4. Pendant le lavage des sections, préparer 7 mL (par échantillon) d’une solution bloquante-perméabilisante composée de 1 TBS avec 0,3 % de Triton X-100 et 3 % de sérum normal (p. ex. sérum normal pour cheval). Bloquer les sections pendant 30 min à RT sur agitateur orbital, en utilisant basse vitesse.
    REMARQUE: Le blocage avec des sérums empêche la liaison non spécifique d’anticorps aux tissus ou aux récepteurs Fc non spécifiques – un sérum correspondant à l’espèce de l’anticorps secondaire est recommandé, mais s’il n’est pas disponible, tout sérum normal d’une espèce différente de l’animal hôte d’anticorps primaire peut être utilisé. Le détergent Triton X-100 permet une meilleure pénétration des anticorps en perméabilisant le tissu.
  5. Préparer 1 mL par échantillon de solution d’anticorps primaires composée d’anticorps primaires sélectionnés (dilués de manière appropriée) dans 1x TBS avec 0,3% de Triton X-100 et 1% de sérum normal (voir étape 4.4 Note). Transférer les sections de l’insert de puits dans un tube microcentrifuge de 2 mL contenant une solution d’anticorps primaires pour se lier au(x) antigène(s) d’intérêt.
    REMARQUE : Plusieurs anticorps primaires peuvent être utilisés (générés chez différentes espèces hôtes).
  6. Placer un tube microcentrifuge de 2 mL avec des sections sur un mélangeur rotatif à basse vitesse (p. ex., vitesse 7 tr/min) et incuber pendant une nuit pendant 12 à 16 h à 4 °C.

5. Jour II de la coloration

  1. Le lendemain, verser des sections dans un insert de puits dans une plaque à 6 puits pour séparer les sections de la solution d’anticorps primaires.
    NOTE: La solution d’anticorps peut être recueillie et réutilisée; Ajouter 0,02 % (p/v) d’azoture de sodium pour inhiber la croissance microbienne.
  2. Lavez les sections 3 fois avec 1x TBS à TA (30 s pour les 2 premiers lavages et 10 min pour le lavage final).
  3. Préparer 1 mL par échantillon de solution d’anticorps secondaires composée d’anticorps secondaires appropriés (dilués en conséquence) dans 1x TBS avec 0,3% de Triton X-100 et 1% de sérum normal (solution protectrice de la lumière).
    REMARQUE : Le marquage indirect avec un anticorps secondaire conjugué amplifie le signal et permet une visualisation colorimétrique ou fluorescente de la protéine cible.
  4. Transvaser les sections dans un tube microcentrifuge de 2 mL contenant une solution d’anticorps secondaire. Incuber pendant 2 h à RT sur agitateur orbital à basse vitesse (solution de protection de la lumière).
  5. Verser les sections dans un insert de puits dans une plaque à 6 puits pour séparer les sections de la solution d’anticorps secondaire.
  6. En continuant à protéger les échantillons de la lumière, laver 2 fois avec 1x TBS pendant 30 s à TA. Ensuite, laver pendant 15 min dans 1x TBS, ajouter DAPI (1-0,1 μg/ml) si désiré.

6. Montage

  1. Versez des sections dans une chambre histologique rectangulaire en verre remplie aux trois quarts de 1x TBS.
  2. Immergez une lame de verre dans le TBS 1x et utilisez un pinceau fin pour amadouer les sections vers la glissière.
  3. Tapotez doucement les sections sur la lame, en vous assurant qu’il n’y a pas de rides ou de plis.
  4. Répétez l’opération jusqu’à ce que toutes les sections soient montées sur la ou les diapositives.
    REMARQUE : Lorsqu’un cerveau entier, par exemple, est sectionné à 40 μm, recueilli dans des inserts de 12 puits avec une partie aliquote contenant 18 à 24 sections; Les tranches sont généralement montées sur 1-2 lames, mais moins de sections peuvent également être montées par diapositive selon les préférences du chercheur.

7. Glissade de couverture

  1. Après le séchage des sections sur la ou les lames, environ 10 à 15 minutes à TA ou jusqu’à ce que les sections semblent opaques (n’oubliez pas de protéger les lames de la lumière), appliquez un support de montage aqueux approprié (durcissement ou non). L’antidécoloration est préférable si vous utilisez un anticorps secondaire conjugué fluorescent.
    REMARQUE: La qualité de fluorescence peut être inférieure lors de l’utilisation d’un support de montage durcisseur, mais les lames doivent durer plus longtemps.
  2. À l’aide d’une pince à épiler, placez une housse sur le support. Couvrir avec du papier filtre et appuyer fermement pour enlever l’excès de support de montage.
    REMARQUE: Si vous utilisez un support non durcissant, peignez les bords de la lame couverclée avec du vernis à ongles transparent pour sceller.
  3. Coupes d’images à l’aide d’un microscope approprié. Conserver dans une boîte à diapositive sombre à 4 °C.
    REMARQUE : Les coupes peuvent être imagées à l’aide de divers microscopes, tels que la fluorescence confocale et à grand champ à balayage laser inversée ou verticale, à des grossissements (p. ex., 10x, 20x, 40x) en fonction des besoins du chercheur.

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Representative Results

Le schéma général de l’utilisation de la méthode flottante pour effectuer un test immunohistochimique fluorescent est illustré à la figure 1. Un exemple représentatif d’IHC fluorescente utilisant la méthode de flottaison libre dans le cerveau de souris examinant l’expression de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) est présenté à la figure 2 à un grossissement inférieur et supérieur pour illustrer la qualité globale de la coloration. Cette approche est également appropriée pour révéler des protéines à faible expression, avec un exemple provenant d’un cerveau de souris transgénique à faible expression GFP illustré à la figure 3. La méthode de flottaison libre peut également être utilisée dans d’autres protocoles de coloration histochimique, tels que le violet de crésyle, comme le montre la figure 4, en suivant les étapes 1 à 4.3 du protocole, puis en montant les sections comme indiqué à l’étape 6. Par la suite, les sections peuvent être traitées en utilisant toute coloration nécessitant des sections montées sur glissière. Lorsque vous utilisez ce protocole pour l’IHC chromogénique, suivez le protocole des étapes 1 à 5.6 (n’ajoutez pas de DAPI au dernier lavage), en ajustant en conséquence si vous utilisez une étape d’amplification (par exemple, complexe avidine-biotine). Remplacez le tampon par un réactif chromagène / substrat, en incubant 5-20 minutes jusqu’à ce que le tissu prenne la couleur désirée. La réaction peut être surveillée en vérifiant périodiquement le tissu avec un microscope de faible puissance. Terminez la réaction en déplaçant l’insert du puits avec les sections vers un tampon frais, en les lavant trois fois, au moins 5 minutes chacune. Passez à l’étape 6 pour monter les sections sur des lames de verre, en laissant les sections sécher sur un chauffe-lames pendant au moins 3-4 heures. Déshydrater les lames avec des concentrations croissantes d’éthanol (c.-à-d. 70 %, 90 %, 95 %, 99,5 %, 2 à 5 min chacune), puis les couvrir avec un milieu de montage dur (p. ex., Entellan), en laissant sécher les lames au moins 1 à 2 heures dans un endroit ventilé. Si le bruit de fond est trop élevé, éteindre l’activité endogène de la peroxydase pendant 15 min à TA avec 3% H 2 O2dans 1x TBS suivi de trois lavages tampons, 15-20 min chacun, avant de bloquer (étape 4.4). Plusieurs tissus périphériques se prêtent également à l’utilisation de cette technique sans modification du protocole requise, avec un exemple de coupes hépatiques d’une souris exprimant la GFP illustrée à la figure 5.

Figure 1
Figure 1 : Organigramme du test immunohistochimique fluorescent flottant librement. Disséquer l’organe d’intérêt (de préférence un tissu fixe) et incorporer le tissu dans des moules d’encastrement (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’une matrice d’échantillons (voir le tableau des matériaux), puis congeler sur de la glace sèche et conserver à -80 °C. Couper les tissus à l’aide d’un cryostat à 20-50 μm et recueillir les tranches dans des inserts de puits (voir le tableau des matériaux) remplis de 1x PBS. À l’aide d’un agitateur orbital à basse vitesse, laver les sections 3x pendant 5 minutes chacune dans 1x PBS. À ce stade, stockez les sections supplémentaires dans un tampon de stockage à -80 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Lavez les sections restantes 3x pendant 5 min avec 1x TBS. Bloquer les sections pendant 30 min à RT en secouant à basse vitesse. Préparer la solution d’anticorps primaires et incuber les sections pendant la nuit dans le(s) tube(s) à microcentrifugeuse(s) à 4 °C (12-14 h). Le lendemain, laver les sections avec 1x TBS 3x, les deux premiers lavages pendant 30 s, avec le troisième lavage pendant 10 min. Incuber des sections dans une solution d’anticorps secondaire dans le(s) tube(s) microcentrifugé(s) pendant 2h à RT, en veillant à protéger les sections de la lumière lorsque cela est possible à partir de cette avancée. Ensuite, lavez 3x avec 1x TBS, les deux premiers lavages pendant 30 s et le troisième lavage pendant 15 min. Ajouter DAPI au dernier lavage si désiré et s’il n’est pas présent dans le support de montage. Versez les sections dans une boîte de chambre, aux trois quarts pleine de 1x TBS, et utilisez un pinceau pour coller les sections sur la ou les diapositives. Laisser sécher les lames (~10-15 min) avant de couvrir le glissement avec le support de montage de votre choix. Coupes d’images à l’aide d’un microscope approprié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Immunohistochimie fluorescente utilisant des coupes cérébrales flottantes librement. Les régions cérébrales de l’hippocampe examinant l’expression du GFAP chez la souris adulte sont montrées et marquées à l’aide d’un anticorps primaire anti-GFAP élevé chez le lapin et d’un anticorps secondaire anti-lapin Alexa568 élevé chez l’âne. Le DAPI a été utilisé lors du dernier lavage pour marquer les noyaux. Le tissu a été sectionné à 40 μm à l’aide d’un cryostat. Les images ont été prises à un grossissement de 10x (supérieur) et 40x (inférieur) à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser ponctuel. Barre d’échelle d’image 10x = 400 μm. Barre d’échelle d’image 40x = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Immunohistochimie fluorescente sur des protéines exprimées plus faiblement par la méthode du flottement libre. Les régions cérébrales de l’hippocampe d’une souris adulte transgénique à faible expression de GFP sont montrées. Les neurones exprimant la GFP ont été marqués à l’aide d’un anticorps primaire anti-GFP élevé chez la chèvre et d’un anticorps secondaire anti-chèvre Alexa488 élevé chez l’âne. Le DAPI a été utilisé lors du dernier lavage pour marquer les noyaux. Le tissu a été sectionné à 40 μm à l’aide d’un cryostat. Les images ont été prises à un grossissement de 40x à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser ponctuel. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Coloration au violet de crésyle à l’aide de coupes de cerveau flottantes librement. À l’aide d’un cryostat, des coupes de 40 μm allant du bulbe olfactif de souris adulte au cervelet ont été collectées, lavées, montées sur des lames, colorées au violet cresyl et recouvrées. Les images ont été prises à un grossissement de 10x à l’aide d’un microscope à grand champ inversé. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Immunohistochimie fluorescente utilisant des sections de foie flottantes librement. Des coupes de foie prélevées à 40 μm à l’aide d’un cryostat provenant d’une souris adulte transgénique exprimant de faibles niveaux de GFP sont montrées. Un anticorps primaire anti-GFP élevé chez la chèvre avec un anticorps secondaire anti-chèvre Alexa488 élevé chez l’âne a été utilisé pour marquer les cellules exprimant la GFP. DAPI a été ajouté au dernier lavage pour marquer les noyaux. Les images ont été recueillies à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser à un grossissement de 40x. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’immunohistochimie (IHC) est une technique polyvalente qui est devenue cruciale dans l’identification de l’expression et de la localisation des protéines dans les sections de tissus. Ce test est utilisé dans toute la communauté scientifique pour mieux comprendre les caractéristiques des tissus à travers les stades de la fonction normale jusqu’aux états pathologiques. IHC est employé dans une variété de domaines allant du diagnostic clinique de maladies telles que le cancer aux découvertes initiales dans la recherche préclinique10,36.

La technique la plus couramment utilisée pour effectuer l’IHC est la méthode montée sur lame dans laquelle les sections sont immédiatement collées à la lame après avoir été tranchées. Certains avantages de l’utilisation de cette technique sont que les chercheurs peuvent manipuler des sections très minces nécessaires aux études de colocalisation des protéines et utiliser peu de solution pour colorer les sections par lame. Les anticorps sont souvent coûteux; Par conséquent, cette approche peut être une option économique si peu de sections doivent être traitées. C’est également la méthode de choix pour les chercheurs utilisant des spécimens fraîchement congelés, car la manipulation du tissu est minimale, donc l’intégrité structurelle du tissu sera protégée. L’utilisation de l’approche montée sur diapositive serait également appropriée si seulement quelques sections doivent être prélevées et immédiatement colorées, comme c’est le cas en pathologie clinique. D’autre part, il y a quelques inconvénients, tels que seul le côté exposé du tissu est accessible pendant la coloration, limitant ainsi l’épaisseur de la section en raison d’une mauvaise pénétration des anticorps et d’un lavage efficace. Un autre inconvénient est qu’une fois que le tissu est sectionné et recueilli sur des lames, l’IHC doit normalement être complété assez rapidement, le stockage des lames non traitées occupant beaucoup d’espace dans le congélateur. De plus, lors du traitement d’expériences plus importantes (par exemple, plusieurs régions du cerveau avec plusieurs niveaux représentatifs à colorer), cette approche peut en fait utiliser plus de réactifs, prendre beaucoup de temps et peut souvent limiter le nombre de lames à traiter par expérience.

Certaines limitations associées à la méthode montée sur glissière peuvent être surmontées par la technique de coloration flottante qui est devenue une alternative de plus en plus populaire lorsque vous travaillez avec des sections plus épaisses. Bien que cette méthode ne soit pas une approche nouvelle, d’après notre expérience, elle a été une approche fiable, reproductible et flexible, en particulier pour colorer des échantillons de tissus en vrac, permettant ainsi le traitement efficace d’études à plus grande échelle. Les chercheurs peuvent également mener efficacement plusieurs grandes expériences IHC en même temps avec cette méthode. De plus, les échantillons sont colorés en suspension, de sorte que les solutions peuvent pénétrer dans les sections sous tous les angles, ce qui est particulièrement important pour les sections plus épaisses, ce qui conduit souvent à une coloration de meilleure qualité (Figure 2, Figure 3 et Figure 5). Les sections flottantes peuvent être tranchées de 20 à 50 μm d’épaisseur37, avec des sections plus épaisses utiles aux chercheurs pour voir des structures ou des cellules dans différentes plaines de vue. Par exemple, dans le tissu cérébral, des sections plus épaisses permettent aux chercheurs de voir la structure des dendrites et des axones dans leurs échantillons. La capacité de collecter des tranches plus minces (20 μm) élargit encore plus le spectre des applications; Cependant, les tranches plus minces peuvent être difficiles à manipuler et nécessitent souvent plus de temps et d’efforts pour minimiser les dommages, de sorte que les sections ne doivent pas être plus minces que 40 μm pour la coloration en vrac. L’un des principaux avantages de la méthode de flottaison libre est que les chercheurs peuvent rapidement sectionner des cerveaux entiers (ou d’autres tissus), collectant toutes les sections dans de petits tubes, chaque aliquote ayant une tranche représentative pour toutes les différentes régions du cerveau, permettant ainsi aux chercheurs de colorer rapidement le cerveau entier. Les tubes contenant des tranches peuvent être conservés dans un cryoprotecteur à -80 °C pendant plusieurs années33, les aliquotes ne prenant pas beaucoup de place dans le congélateur, ce qui permet aux chercheurs de générer une « bibliothèque de tissus ». Cette méthode réduit également la quantité de matériaux gaspillés, y compris les lames, les lames de couverture et surtout les anticorps, qui peuvent facilement être récupérés et conservés pour la réutilisation, ainsi que les précieux tissus animaux puisque les sections peuvent être stockées et conservées aussi longtemps que les utilisateurs le souhaitent.

L’approche flottante et le protocole présentés ici donnent également aux chercheurs la possibilité de modifier facilement le protocole ou de réutiliser les ressources. Par exemple, les coupes collectées peuvent être utilisées pour de nombreuses colorations histochimiques différentes en plus de l’immunofluorescence avec des modifications de protocole simples, telles que l’IHC chromogénique, l’hématoxyline et l’éosine (H & E), le violet de crésyle (Figure 4) et l’ARNscope38. L’IHC chromogène permet de visualiser l’expression de l’antigène lorsqu’un substrat soluble est converti par une enzyme conjuguée à un anticorps secondaire à un produit chromogène insoluble. Les deux enzymes les plus couramment utilisées sont la peroxydase de raifort (HRP), qui convertit la 3,3' diaminobenzidine (DAB) en un produit final brun foncé, et la phosphatase alcaline (AP), qui convertit le substrat du 3-amino-9-éthylcarbazole (AEC) en un produit rouge39. Nous effectuons régulièrement une coloration au violet cresyl et utilisons des sections flottantes afin d’examiner l’organisation cérébrale globale et la morphologie40. Nous avons également appliqué avec succès ce protocole à de nombreux tissus différents, notamment le cerveau, le foie, le cœur, les reins et la rate (Figure 5). D’autres chercheurs ont également utilisé avec succès cette technique pour les tissus périphériques, y compris le foie, les reins et les ovaires22,23,24.

Une préoccupation majeure lors de l’utilisation de la technique de flottaison libre est le potentiel de dommages structurels aux sections de tissus, en particulier aux tranches de cerveau, car tout au long du protocole, les échantillons sont sur des agitateurs et des rotateurs à presque chaque étape pour s’assurer qu’ils sont lavés, bloqués et colorés uniformément. Parfois, des régions spécifiques du cerveau peuvent se détacher, en particulier au niveau cérébelleux; Cependant, l’utilisation d’un atlas cérébral et d’une forme de grossissement, telle qu’une lampe de bijoutier, pendant le processus de montage peut être utile pour assembler les sections. Ce défi peut généralement être évité par une manipulation douce des échantillons et en maintenant les machines tournantes sur le réglage bas correct.

En conclusion, nous présentons une technique IHC de flottaison libre établie qui s’est avérée être une modalité indispensable, fiable, flexible et efficace que nous utilisons régulièrement pour visualiser l’expression et la localisation des protéines ainsi que la structure tissulaire dans une variété de tissus. Le présent protocole peut facilement être modifié pour répondre aux besoins individuels de la recherche, ce qui le rend précieux pour la communauté scientifique.

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Disclosures

Rien à divulguer

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le National Institute on Aging (K99/R00 AG055683 à JMR), le George and Anne Ryan Institute for Neuroscience (EP, GC, JMR), le College of Pharmacy de l’Université de Rhode Island (EP, GC, JMR) et Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Nous remercions la doctorante Rebecca Senft, en formation avec le professeur Susan Dymecki, Département de génétique, Harvard Medical School, de nous avoir présenté la méthode de flottaison libre. Certaines images utilisées dans la figure 1 ont été obtenues à partir de sources « libres d’utilisation, de partage ou de modification, même commerciales » : tube de souris et microcentrifugeuse (Pixabay), cerveau de souris (Jonas Töle, Wikimedia Commons), section cryostat et cerveau de souris (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), récipient en verre (OpenClipart, FreeSvg.org) et microscope (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 3513
6-well plates Corning 3516
Clear nail polish User preference N/A
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Embedding molds Thermo Scientific 1841
Ethylene glycol User preference N/A
Formalin solution Fisher Scientific SF98-4
Horse serum, heat inactivated Gibco 26050088
Microscope slide boxes Electron Microscopy Services 71370
PBS User preference N/A
Primary antibody User preference N/A
Rectangular Coverslips VWR 48393-081 24 x 50 mm
Rectangular staining dish Electron Microscopy Services 70312
Round artist paintbrush #2 Princeton Select Series 3750R Brand not important
Secondary antibody User preference N/A
Specimen matrix for embedding OCT Tissue-Tek, Sakura 4583
Stain tray – slide staining system Electron Microscopy Services 71396-B Use dark lid
Sucrose User preference N/A
Superfrost Plus Micro Slides VWR 48311-703
TBS User preference N/A
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vectashield antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000 Non-hardening
Well inserts for 12-well plates Corning Netwells 3477
Well inserts for 6-well plates Corning Netwells 3479
Whatman filter paper Millapore-Sigma WHA1440042

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Colorations histologiques utilisant des sections de tissus flottant librement
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Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross,… More

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (162), e61622, doi:10.3791/61622 (2020).

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