Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Histologiskt baserade färgningar med fritt flytande vävnadssnitt

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61622
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1George & Anne Ryan Institute for Neuroscience, College of Pharmacy, Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, University of Rhode Island, 2Department of Neuroscience, Biomedicum, Karolinska Institutet

Summary

Den fritt flytande tekniken gör det möjligt för forskare att utföra histologiskt baserade färgningar inklusive immunhistokemi på fasta vävnadssnitt för att visualisera biologiska strukturer, celltyp och proteinuttryck och lokalisering. Detta är en effektiv och pålitlig histokemisk teknik som kan vara användbar för att undersöka en mängd vävnader, såsom hjärna, hjärta och lever.

Abstract

Immunohistokemi är en allmänt använd teknik för att visualisera specifika vävnadsstrukturer samt proteinuttryck och lokalisering. Två alternativa tillvägagångssätt används ofta för att hantera vävnadssektionerna under färgningsproceduren, ett tillvägagångssätt består av att montera sektionerna direkt på glasskivor, medan ett andra tillvägagångssätt, det fritt flytande, gör det möjligt att bibehålla och färga fasta sektioner medan de är upphängda i lösning. Även om glidmonterade och fritt flytande tillvägagångssätt kan ge liknande resultat, möjliggör den fritt flytande tekniken bättre antikroppspenetration och bör därför vara den valda metoden när tjockare sektioner ska användas för 3D-rekonstruktion av vävnaderna, till exempel när experimentets fokus är att få information om dendritiska och axonala projektioner i hjärnregioner. Dessutom, eftersom sektionerna hålls i lösning, kan en enda alikvot lätt rymma 30 till 40 sektioner, vars hantering är mindre mödosam, särskilt i storskaliga biomedicinska studier. Här illustrerar vi hur man kan tillämpa den fritt flytande metoden på fluorescerande immunhistokemisk färgning, med stort fokus på hjärnsektioner. Vi kommer också att diskutera hur den fritt flytande tekniken enkelt kan modifieras för att passa forskarnas individuella behov och anpassas till andra vävnader samt andra histokemiska baserade färgningar, såsom hematoxylin och eosin och kresylviolett, så länge vävnadsprover är ordentligt fixerade, vanligtvis med paraformaldehyd eller formalin.

Introduction

Immunfärgning är en populär forskningspraxis som började för 130 år sedan med upptäckten av serumantikroppar 1890 av Von Behring1. Under början av20-talet fästes färgämnen på antigener och senare till antikroppar som ett sätt att kvantifiera och visualisera reaktioner1, och 1941 utvecklade Albert Coons de första fluorescerande antikroppsetiketterna, en upptäckt som revolutionerade ljusmikroskopi 2,3. Termen "immunfärgning" omfattar många tekniker som har utvecklats med hjälp av denna princip, inklusive Western blot, flödescytometri, ELISA, immunocytokemi och immunohistokemi 3,4. Western blot detekterar närvaron av specifika proteiner från vävnads- eller cellextrakt5. Proteiner separeras efter storlek med hjälp av gelelektrofores, överförs till ett membran och sonderas med antikroppar. Denna teknik indikerar närvaron av protein och hur mycket protein som är närvarande; Emellertid, Det avslöjar inte någon information om lokaliseringen av proteinet i celler eller vävnader. En annan metod, immunocytokemi (ICC), märker proteiner i celler, vanligtvis celler odlade in vitro. ICC visar både proteinuttryck och lokalisering inom cellulära fack6. För att detektera och visualisera ett specifikt protein på vävnadsnivå används immunohistokemi (IHC).

IHC är en metod som forskare använder för att rikta in sig på specifika antigener i vävnad och dra nytta av kemiska egenskaper hos immunsystemet 7,8. Genom att generera specifika primära och sekundära antikroppar kopplade till antingen ett enzym eller ett fluorescerande färgämne kan antigener av intresse märkas och avslöjas i de flesta vävnader (som granskats i Mepham och Britten)9. Termen "immunhistokemi" i sig specificerar inte märkningsmetoden som används för att avslöja antigenet av intresse; Således kombineras denna terminologi ofta med detektionstekniken för att tydligt avgränsa märkningsmetoden: kromogen immunohistokemi (CIH) för att indikera när den sekundära antikroppen är konjugerad till ett enzym, såsom peroxidas; eller fluorescerande IHC för att indikera när den sekundära antikroppen är konjugerad till en fluorofor, såsom fluoresceinisotiocyanat (FITC) eller tetrametylrhodamin (TRITC). Selektiviteten hos IHC gör det möjligt för kliniker och forskare att visualisera proteinuttryck och distribution genom vävnader, över olika tillstånd av hälsa och sjukdom10. I det kliniska området används IHC ofta för att diagnostisera cancer, liksom för att bestämma skillnader i olika typer av cancer. IHC har också använts för att bekräfta olika typer av mikrobiella infektioner i kroppen, såsom hepatit B eller C11. Inom biomedicinsk forskning används IHC ofta för att kartlägga proteinuttryck i vävnader och är viktigt för att identifiera onormala proteiner som ses i sjukdomstillstånd. Till exempel åtföljs neurodegeneration ofta av ackumulering av onormala proteiner i hjärnan, såsom Αβ-plack och neurofibrillära trassel vid Alzheimers sjukdom. Djurmodeller utvecklas ofta för att efterlikna dessa patologiska tillstånd, och IHC är en metod som forskare använder för att lokalisera och kvantifiera proteinerna av intresse10,12,13. I sin tur kan vi lära oss mer om orsakerna till dessa sjukdomar och de komplikationer som uppstår med dem.

Det finns många steg involverade i att utföra IHC. Först samlas vävnaden av intresse och förbereds för färgning. Förmodligen förbereder de flesta forskare fasta vävnadsprover, med perfusion av fixeringsmedlet via cirkulationssystemet som är optimalt eftersom det bevarar morfologi14,15. Efterfixering av vävnadsprover kan också användas men kan ge mindre än idealiska resultat16. Tvärbindningsfixativ, såsom formaldehyd, verkar genom att skapa kemiska bindningar mellan proteiner i vävnaden17. Fast vävnad skivas sedan i mycket tunna lager eller sektioner med hjälp av en mikrotom, med många forskare som föredrar att samla frysta sektioner med en kryostat. Därifrån samlas vävnaden upp och monteras antingen direkt på ett objektglas (slide-mounted method) eller suspenderas i en lösning (fritt flytande metod), såsom fosfatbuffrad saltlösning (PBS)18. Den använda insamlingsmetoden är förutbestämd utifrån forskarens behov, där var och en av dessa två metoder presenterar sina egna fördelar och nackdelar.

Den glidmonterade metoden är den absolut vanligaste, med en viktig fördel att mycket tunna sektioner (10-14 μm) kan framställas, vilket är viktigt för att till exempel undersöka protein-proteininteraktioner. Det finns också minimal hantering av provet, vilket minskar potentiell skada på vävnadens strukturella integritet19. Forskare använder ofta denna teknik med färsk frusen vävnad (vävnad som omedelbart fryses med torris, isopentan etc.), vilket är mycket känsligt jämfört med fast vävnad och mycket försiktighet för att förhindra upptining av provet måste tas. En annan fördel med att använda glidmonterade sektioner är att stora volymer lösningar för färgning vanligtvis inte krävs4. Således kan forskare använda en mindre mängd dyra antikroppar eller andra kemikalier för att slutföra fläcken. Dessutom är det möjligt att montera sektioner från flera olika experimentgrupper på samma bild, vilket kan vara fördelaktigt, särskilt under bildförvärv. Å andra sidan finns det några nackdelar med att använda glidmonterade sektioner, framför allt att vävnadssektionen fästs vid glaset och därmed begränsar antikroppspenetrationen till ena sidan av sektionen, vilket begränsar sektionstjockleken och 3D-representationen av vävnaden. Det kan också hända att under tvättar kan kanterna på vävnaden och hela sektionerna lossna från bilden, vilket gör hela experimentet värdelöst. Dessutom måste IHC vanligtvis utföras relativt snabbt när man använder den utsticksmonterade metoden för att undvika nedbrytning av antigenepitopen 20,21 med obearbetade utstryksglas som vanligtvis lagras vid -20 eller -80 °C, ofta täckgled och lagras horisontellt eller i glidlådor, vilket resulterar i ett relativt stort lagringsutrymme. Slutligen kan den glidmonterade tekniken också vara tidskrävande om forskare måste hantera ett stort antal glas för att bearbeta ett stort antal vävnadssnitt.

På grund av några av dessa utmaningar med hjälp av den glidmonterade metoden har en modifiering som kallas den fritt flytande metoden blivit ett populärt alternativ. Denna teknik kom in i litteraturen på 1960-70-talet 22,23,24, blev populär på 1980-talet 25,26,27,28,29, och är nu en väletablerad metod som innebär att fläcken utförs på de uppsamlade sektionerna i suspension snarare än att fästas vid en bild 12,30,31 . Den fritt flytande metoden rekommenderas inte när vävnadssnitten är mindre än 20 μm. Enligt vår erfarenhet är det dock det tillvägagångssätt som väljs när tjockare (40-50 μm) sektioner ska färgas. En tydlig fördel är att antikroppar kan penetrera fritt flytande sektioner från alla vinklar och generera mindre bakgrundsfärgning på grund av effektivare tvätt, vilket resulterar i bättre signalering vid avbildning. Dessutom monteras sektionerna på objektglasen efter bearbetning, vilket eliminerar risken för vävnadsavlossning samt minskar tiden som upptar kryostaten. Den fritt flytande metoden kan också vara mycket mindre arbetsintensiv, särskilt för storskaliga biomedicinska studier. Det är till exempel möjligt att färga många (18-40) sektioner från samma prov tillsammans i samma brunn, vilket sparar tid vid utförandet av både tvätt- och antikroppsinkubationsstegen. Dessutom, eftersom ett större antal (12-16) sektioner kan monteras per bild med detta tillvägagångssätt, är det ofta bekvämare och snabbare för forskaren att se och bildsektioner. I synnerhet under montering av vävnadsskivor på objektglasen kan sektioner fästas och lossas tills önskad orientering erhålls. Forskare använder också ofta något lägre koncentrationer av antikroppar med hjälp av den fritt flytande metoden, och eftersom inkubationerna utförs i mikrocentrifugrör kan antikropparna enkelt samlas upp och bevaras med natriumazid för återanvändning (se steg 5.1). En annan fördel är att sektionerna kan lagras direkt vid -80 °C i små mikrocentrifugrör med kryoskyddande lösning32, vilket minimerar lagringsutrymmet och maximerar provernas livslängd33. En nackdel med att använda denna teknik är att sektionerna hanteras mycket och därmed är benägna att skada. Detta kan dock mildras genom att använda låga skaknings- och rotationshastigheter samt korrekt utbilda forskare hur man överför proverna och monterar sektionerna på objektglasen.

Sammantaget är IHC ett etablerat, viktigt verktyg för att visualisera och lokalisera proteinuttryck inom både kliniska och biomedicinska forskningsområden. Fritt flytande IHC är en effektiv, flexibel och ekonomisk metod, särskilt när man utför storskaliga histologiska studier. Här presenterar vi ett pålitligt fritt flytande fluorescerande IHC-protokoll för det vetenskapliga samfundet som kan anpassas därefter för kromogen IHC och andra färgningar såsom hematoxylin och eosin eller kresylviolettfärgning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vävnadsberedning för kryosektion

  1. Bädda in fasta vävnader i en lämplig inbäddningsform (se materialförteckning) för att skapa ett provblock med en lämplig provmatris (se materialtabell) och frys på torris. Förvara provblocken vid -80 °C tills de är klara att delas upp.
    Anmärkning: Fasta vävnader bereds vanligtvis genom att vuxna (ca 2,5–30 månader gamla) han- eller hongnagare (mus eller råtta)34, i enlighet med tillgängliga etiska tillstånd, perfuseras med ett lämpligt fixeringsmedel (t.ex. 10 % formalin), följt av efterfixering av vävnader i samma fixeringsmedel i 12 timmar vid 4 °C, där vävnaderna tvättas tre gånger med 1x PBS, och placera vävnader i 15% och sedan 30% sackaros i 1x PBS för över natten eller tills vävnaderna sjunker35. Forskare kan försöka anpassa detta allmänna protokoll till olika utvecklingsstadier.

2. Kryosektion

  1. När du är redo att snitta, acklimatisera prover i kryostaten i minst 1-2 timmar före snittning för att förhindra splittring av vävnad.
  2. Skär vävnad i sektioner (20-50 μm) med en kryostat och samla i 6 eller 12 brunnsinsatser (se materialtabell) fyllda med 1x PBS-lösning.
    OBS: Beroende på sektionstjockleken, hur mycket vävnad som ska samlas in och antalet brunnsinsatser som används, kommer varje brunn att innehålla ett varierande antal sektioner som sträcker sig från cirka 10 till 40 skivor för brunn. Till exempel, om en hel hjärna är snittad vid 40 μm, kommer cirka 18-24 sektioner att samlas in i varje brunn med hjälp av 12-brunnsinsatser. Dessutom kan 20 μm sektioner vara något utmanande att hantera, därför rekommenderas 40 μm för bulkfärgning (se diskussion).

3. Förvaring av sektioner

  1. När de har samlats in, tvätta sektionerna med nyberedd 1x PBS i 5 minuter. Upprepa 3 gånger.
  2. Överför sektionerna till 2 ml mikrocentrifugrör fyllda med 1-1,5 ml lagringslösning (för 250 ml, blanda 70 g sackaros, 75 ml etylenglykol och bringa till volym med 0,1 M fosfatbuffert).
  3. Förvaras vid -80 °C tills det är klart för färgning.

4. Färgning dag I

  1. Ta ut proverna ur frysen och balansera i rumstemperatur (RT) i 10-20 minuter.
  2. Häll sektioner i en brunninsats i en 6-brunnsplatta för att separera lagringslösning från sektioner.
  3. Flytta brunninsatsen till en annan brunn som innehåller cirka 6 ml 1x TBS. Tvätta 3 gånger med 1x TBS i 5 minuter vardera på en orbitalskakare med låg hastighet vid RT.
  4. Medan sektionerna tvättas, förbered 7 ml (per prov) av en blockerande permeabiliserande lösning bestående av 1x TBS med 0,3% Triton X-100 och 3% normalt serum (t.ex. normalt hästserum). Blockera sektioner i 30 minuter vid RT på orbital shaker, med låg hastighet.
    OBS: Blockering med serum förhindrar icke-specifik bindning av antikroppar till vävnad eller icke-specifika Fc-receptorer – ett serum som matchar arten av den sekundära antikroppen rekommenderas, men om det inte finns tillgängligt kan vilket normalt serum som helst från en annan art än det primära antikroppsvärddjuret användas. Tvättmedlet Triton X-100 möjliggör bättre antikroppspenetration genom permeabilisering av vävnaden.
  5. Bered 1 ml per prov av primär antikroppslösning bestående av utvald primär antikropp (utspädd på lämpligt sätt) i 1x TBS med 0,3% Triton X-100 och 1% normalt serum (se steg 4.4 anmärkning). Överför sektioner från brunnen till ett 2 ml mikrocentrifugrör innehållande primär antikroppslösning för att binda till antigenet eller antigenerna av intresse.
    OBS: Flera primära antikroppar kan användas (genereras i olika värdarter).
  6. Placera 2 ml mikrocentrifugrör med sektioner på en roterande blandare med låg hastighet (t.ex. varvtal 7 rpm) och inkubera över natten i 12–16 timmar vid 4 °C.

5. Färgning dag II

  1. Följande dag, häll sektioner i en brunninsats i en 6-brunnsplatta för att separera sektioner från primär antikroppslösning.
    OBS: Antikroppslösning kan samlas in och återanvändas; Tillsätt 0,02% (w/v) natriumazid för att hämma mikrobiell tillväxt.
  2. Tvätta sektioner 3 gånger med 1x TBS vid RT (30 s för de första 2 tvättarna och 10 min för den slutliga tvätten).
  3. Bered 1 ml per prov av sekundär antikroppslösning bestående av lämplig sekundär antikropp (utspädd i enlighet därmed) i 1x TBS med 0,3% Triton X-100 och 1% normalt serum (sköldlösning från ljus).
    OBS: Indirekt märkning med en konjugerad sekundär antikropp förstärker signalen och möjliggör kolorimetrisk eller fluorescerande visualisering av proteinmålet.
  4. Överför sektioner till ett 2 ml mikrocentrifugrör innehållande sekundär antikroppslösning. Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur på orbitalskakapparat med låg hastighet (skärmlösning från ljus).
  5. Häll sektioner i en brunninsats i en 6-brunnsplatta för att separera sektioner från sekundär antikroppslösning.
  6. Fortsätt att skydda prover från ljus, tvätta 2 gånger med 1x TBS i 30 s vid RT. Tvätta sedan i 15 min i 1x TBS, tillsätt DAPI (1-0,1 μg / ml) om så önskas.

6. Montering

  1. Häll sektioner i ett glas, rektangulär histologisk kammare fylld tre fjärdedelar med 1x TBS.
  2. Sänk ner en glasskiva i 1x TBS och använd en fin pensel för att locka sektionerna mot bilden.
  3. Knacka försiktigt på sektionerna på bilden och se till att det inte finns några rynkor eller veck.
  4. Upprepa tills alla sektioner är monterade på bilden / bilderna.
    OBS: När en hel hjärna, till exempel, är snittad vid 40 μm, samlas i 12-brunnsinsatser med en alikvot innehållande 18-24 sektioner; Skivor monteras vanligtvis på 1-2 bilder, men färre sektioner kan också monteras per bild beroende på forskarens önskemål.

7. Täckning

  1. Efter att sektioner har torkats på objektglaset/objektglasen, cirka 10–15 minuter vid rumstemperatur eller tills sektionerna ser ogenomskinliga ut (kom ihåg att skärma objektglasen från ljus), applicera ett lämpligt vattenhaltigt monteringsmedium (härdning eller icke-härdning). Antifading är att föredra om man använder en fluorescerande konjugerad sekundär antikropp.
    OBS: Fluorescenskvaliteten kan vara lägre när du använder ett härdande monteringsmedium, men objektglasen bör hålla längre.
  2. Använd pincett och placera ett täckglas ovanpå mediet. Täck med filterpapper och tryck ner ordentligt för att ta bort överflödigt monteringsmedium.
    OBS: Om du använder ett icke-härdande fäste, måla kanterna på täckglaset med klart nagellack för att täta.
  3. Bildsektioner med ett lämpligt mikroskop. Förvaras i en mörk slidebox vid 4 °C.
    OBS: Sektioner kan avbildas med hjälp av en mängd olika mikroskop, såsom laserskanningskonfokal och inverterad eller upprätt widefield-fluorescens, vid förstoringar (t.ex. 10x, 20x, 40x) baserat på forskarens behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det övergripande schemat för användning av den fritt flytande metoden för att utföra en fluorescerande immunhistokemisk analys illustreras i figur 1. Representativt exempel på fluorescerande IHC med hjälp av den fritt flytande metoden i mushjärna som undersöker gliafibrillärt surt protein (GFAP) uttryck visas i figur 2 vid både lägre och högre förstoring för att illustrera färgningens övergripande kvalitet. Detta tillvägagångssätt är också lämpligt för att avslöja låguttryckande proteiner, med ett exempel från en GFP-låguttryckande transgen mushjärna som visas i figur 3. Den fritt flytande metoden kan också användas i andra histokemiska färgningsprotokoll, såsom kresylviolett, som visas i figur 4, genom att följa steg 1 till 4.3 i protokollet och sedan montera sektionerna enligt anvisningarna i steg 6. Därefter kan sektioner bearbetas med valfri färgning som kräver glidmonterade sektioner. När du använder detta protokoll för kromogen IHC, följ protokollet från steg 1 till 5.6 (tillsätt inte DAPI till den senaste tvätten) och justera därefter om du använder ett amplifieringssteg (t.ex. avidin-biotinkomplex). Byt ut bufferten mot kromagen/substratreagens, inkubera 5-20 min tills vävnaden får önskad färg. Reaktionen kan övervakas genom att kontrollera vävnaden regelbundet med ett mikroskop med låg effekt. Avsluta reaktionen genom att flytta brunninsatsen med sektionerna till ny buffert, tvätta dem tre gånger, minst 5 min vardera. Fortsätt med steg 6 för att montera sektionerna på glasskivor, så att sektionerna kan torka på en glidvärmare i minst 3-4 timmar. Dehydrera objektglasen med ökande etanolkoncentrationer (dvs. 70%, 90%, 95%, 99,5%, 2-5 min vardera) följt av xylen (5-10 min) och täck sedan med ett hårt monteringsmedium (t.ex. Entellan), så att objektglasen torkar minst 1-2 timmar i ett ventilerat område. Om bakgrunden är för hög, släck den endogena peroxidasaktiviteten i 15 minuter vid rumstemperatur med 3%H2O2i 1x TBS följt av tre bufferttvättar, 15-20 min vardera, innan du blockerar (steg 4.4). Flera perifera vävnader är också mottagliga för att använda denna teknik utan att några ändringar av protokollet krävs, med ett exempel på leversektioner från en GFP-uttryckande mus som visas i figur 5.

Figure 1
Figur 1: Flödesschema för den fritt flytande fluorescerande immunhistokemiska analysen. Dissekera organet av intresse (helst fast vävnad) och bädda in vävnad i inbäddningsformar (se materialtabell) med hjälp av en provmatris (se materialtabell) och frys sedan på torris och förvara vid -80 °C. Sektionsvävnad med en kryostat vid 20-50 μm och samla skivor i brunninsatser (se materialförteckning) fyllda med 1x PBS. Använd en orbitalskakapparat på låg hastighet, tvätta sektioner 3x i 5 minuter vardera i 1x PBS. Förvara nu extra sektioner i lagringsbuffert vid -80 °C tills det behövs. Tvätta återstående sektioner 3x i 5 minuter med 1x TBS. Blockera sektioner i 30 min vid RT-skakning med låg hastighet. Bered primär antikroppslösning och inkubera sektioner över natten i mikrocentrifugrör vid 4 °C (12–14 timmar). Följande dag, tvätta sektioner med 1x TBS 3x, först två tvättar i 30 s, med den tredje tvätten i 10 min. Inkubera sektioner i sekundär antikroppslösning i mikrocentrifugrör i 2 timmar vid RT, se till att skärma sektioner från ljus när det är möjligt från detta steg framåt. Tvätta sedan 3x med 1x TBS, först två tvättar i 30 s och tredje tvätt i 15 minuter. Tillsätt DAPI till sista tvätten om så önskas och om det inte finns i monteringsmediet. Häll sektioner i en kammarlåda, tre fjärdedelar fulla av 1x TBS, och använd en pensel för att fästa sektioner på bilden / bilderna. Låt glasen torka (~10-15 min) innan du täcker med valfritt monteringsmedium. Bildsektioner med ett lämpligt mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Fluorescerande immunhistokemi med fritt flytande hjärnsektioner. Hippocampus hjärnregioner som undersöker GFAP-uttryck hos vuxna möss visas och märktes med hjälp av en anti-GFAP primär antikropp uppvuxen i kanin och en anti-kanin Alexa568 sekundär antikropp uppvuxen i åsna. DAPI användes i den senaste tvätten för att märka kärnor. Vävnaden snittades vid 40 μm med hjälp av en kryostat. Bilderna togs med 10x (övre) och 40x (nedre) förstoring med hjälp av ett konfokalmikroskop med laserpunktsskanning. 10x bildskala bar = 400 μm. 40x bildskala bar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Fluorescerande immunhistokemi på proteiner med lägre uttryckta proteiner med hjälp av den fritt flytande metoden. Hippocampus hjärnregioner från en lågt uttryckande GFP transgen vuxen mus visas. Neuroner som uttrycker GFP märktes med hjälp av en anti-GFP primär antikropp upphöjd i get och en anti-get Alexa488 sekundär antikropp upphöjd i åsna. DAPI användes i den senaste tvätten för att märka kärnor. Vävnaden snittades vid 40 μm med hjälp av en kryostat. Bilderna togs med 40x förstoring med hjälp av ett konfokalmikroskop med laserpunktskanning. Skalstång = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Cresylviolett färgning med fritt flytande hjärnsektioner. Med hjälp av en kryostat samlades 40 μm sektioner från vuxen musluktlampa till cerebellum, tvättades, monterades på objektglas, färgades med kresylviolett och täckgavs. Bilderna togs med 10x förstoring med hjälp av ett inverterat widefield-mikroskop. Skalstång = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Fluorescerande immunhistokemi med fritt flytande leversnitt. Leversektioner tagna vid 40 μm med hjälp av en kryostat från en transgen vuxen mus som uttrycker låga nivåer av GFP visas. En anti-GFP primär antikropp uppvuxen i get med en anti-get Alexa488 sekundär antikropp upphöjd i åsna användes för att märka celler som uttrycker GFP. DAPI tillsattes till den sista tvätten för att märka kärnor. Bilder samlades in med hjälp av ett laserpunktscanningskonfokalmikroskop med 40x förstoring. Skalstång = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immunhistokemi (IHC) är en mångsidig teknik som har blivit avgörande för att identifiera proteinuttryck och lokalisering inom vävnadssnitt. Denna analys används i hela det vetenskapliga samfundet för att ytterligare förstå egenskaper hos vävnad över stadier av normal funktion till sjukdomstillstånd. IHC används inom en mängd olika områden från klinisk diagnos av sjukdomar som cancer till initiala upptäckter i preklinisk forskning10,36.

Den teknik som oftast används för att utföra IHC är den glidmonterade metoden där sektionerna omedelbart fästs vid glaset efter att ha skivats. Några fördelar med att använda denna teknik är att forskare kan hantera mycket tunna sektioner som behövs för proteinsamlokaliseringsstudier och använda liten lösning för att färga sektionerna per bild. Antikroppar är ofta dyra; Därför kan detta tillvägagångssätt vara ett ekonomiskt alternativ om få avsnitt ska behandlas. Detta är också den metod som valts för forskare som använder färskfrysta prover eftersom hanteringen av vävnaden är minimal, vilket innebär att vävnadens strukturella integritet kommer att skyddas. Att använda det glidmonterade tillvägagångssättet skulle också vara lämpligt om endast några få sektioner ska samlas in och omedelbart färgas, vilket är fallet i klinisk patologi. Å andra sidan finns det vissa nackdelar, såsom att endast den exponerade sidan av vävnaden nås under färgning, vilket begränsar sektionstjockleken på grund av dålig antikroppspenetration och effektiv tvättning. En annan nackdel är att när vävnaden är snittad och uppsamlad på objektglas, måste IHC normalt slutföras ganska snabbt med lagring av obearbetade glas som tar upp mycket frysutrymme. Dessutom, vid bearbetning av större experiment (t.ex. flera hjärnregioner med flera, representativa nivåer som ska färgas), kan detta tillvägagångssätt faktiskt använda fler reagens, vara ganska tidskrävande och kan ofta begränsa antalet bilder som ska bearbetas per experiment.

Vissa begränsningar i samband med den glidmonterade metoden kan övervinnas av den fritt flytande färgningstekniken som har blivit ett alltmer populärt alternativ när man arbetar med tjockare sektioner. Även om denna metod inte är ett nytt tillvägagångssätt har det enligt vår erfarenhet varit ett tillförlitligt, reproducerbart och flexibelt tillvägagångssätt, särskilt för färgning av vävnadsprover i bulk, vilket möjliggör bearbetning av storskaliga studier på ett effektivt sätt. Forskare kan också effektivt köra flera, stora IHC-experiment samtidigt med denna metod. Dessutom färgas proverna i suspension, vilket innebär att lösningarna kan tränga igenom sektionerna från alla vinklar, vilket är särskilt viktigt för tjockare sektioner, vilket ofta leder till en fläck av högre kvalitet (figur 2, figur 3 och figur 5). Fritt flytande sektioner kan skivas var som helst från 20-50 μm i tjocklek37, med tjockare sektioner som är användbara för forskare att se strukturer eller celler i olika slätter. Till exempel, i hjärnvävnad, tillåter tjockare sektioner forskare att se strukturen hos dendriter och axoner genom sina prover. Möjligheten att samla tunnare skivor (20 μm) breddar spektrumet av applikationer ännu mer; Tunnare skivor kan dock vara svåra att hantera och kräver ofta mer tid och ansträngning för att minimera skador, så sektioner bör inte vara tunnare än 40 μm för bulkfärgning. En viktig fördel med den fritt flytande metoden är att forskare snabbt kan sektionera hela hjärnor (eller annan vävnad), samla alla sektioner i små rör med varje alikvot som har en representativ skiva för alla olika hjärnregioner, vilket gör det möjligt för forskare att snabbt fläcka hela hjärnan. Rör som innehåller skivor kan förvaras i kryoskyddsmedel vid -80 ° C i flera år33, med alikvoter som inte tar mycket frysutrymme, vilket effektivt gör det möjligt för forskare att generera ett "vävnadsbibliotek". Denna metod minskar också mängden bortkastade material, inklusive glas, täckglas och särskilt antikroppar, som lätt kan återvinnas och bevaras för återanvändning, liksom värdefulla djurvävnader eftersom sektioner kan lagras och sparas så länge användarna väljer.

Det fritt flytande tillvägagångssättet och protokollet som presenteras här ger också forskare möjlighet att enkelt ändra protokollet eller återanvända resurser. Till exempel kan de insamlade sektionerna användas för många olika histokemiska fläckar förutom immunofluorescens med enkla protokollmodifieringar, såsom kromogen IHC, hematoxylin och eosin (H&E), kresylviolett (figur 4) och RNAscope38. Kromogen IHC möjliggör visualisering av antigenuttryck när ett lösligt substrat omvandlas av ett enzym konjugerat till en sekundär antikropp till en olöslig kromogen produkt. De två enzymer som oftast används är pepparrotsperoxidas (HRP), som omvandlar 3,3'-diaminobensidinen (DAB) till en mörkbrun slutprodukt, och alkaliskt fosfatas (AP), som omvandlar 3-amino-9-etylkarbazolsubstratet (AEC) till en röd produkt39. Vi utför rutinmässigt cresylviolettfärgning och använder fritt flytande sektioner för att undersöka grov hjärnorganisation och morfologi40. Vi har också framgångsrikt tillämpat detta protokoll på många olika vävnader, inklusive hjärna, lever, hjärta, njure och mjälte (figur 5). Andra forskare har också framgångsrikt använt denna teknik för perifera vävnader inklusive lever, njure, och äggstockar22,23,24.

Ett stort problem när man använder fritt flytande teknik är potentialen för strukturella skador på vävnadssektionerna, särskilt på hjärnskivor, eftersom hela protokollet finns prover på shakers och rotatorer under nästan varje steg för att säkerställa att de tvättas jämnt, blockeras och färgas. Ibland kan specifika hjärnregioner lossna, särskilt på cerebellära nivåer; Att använda en hjärnatlas och en form av förstoring, till exempel en juvelerares lampa, under monteringsprocessen kan dock vara till hjälp för att sätta ihop sektioner. Denna utmaning kan vanligtvis förhindras genom skonsam hantering av proverna och genom att hålla roterande maskiner på rätt, låg inställning.

Sammanfattningsvis presenterar vi en etablerad fritt flytande IHC-teknik som har visat sig vara en oumbärlig, pålitlig, flexibel och effektiv modalitet som vi regelbundet använder för att visualisera proteinuttryck och lokalisering samt vävnadsstruktur i en mängd olika vävnader. Protokollet häri kan enkelt modifieras för att passa individuella forskningsbehov, vilket gör det värdefullt för det vetenskapliga samfundet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inget att avslöja

Acknowledgments

Vi vill tacka National Institute on Aging (K99/R00 AG055683 till JMR), George and Anne Ryan Institute for Neuroscience (EP, GC, JMR), College of Pharmacy vid University of Rhode Island (EP, GC, JMR) och Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Vi tackar doktoranden Rebecca Senft, utbildning med professor Susan Dymecki, Institutionen för genetik, Harvard Medical School, för att introducera oss till den fritt flytande metoden. Vissa bilder som används i figur 1 erhölls från "fria att använda, dela eller modifiera, även kommersiellt" källor: mus och mikrocentrifugrör (Pixabay), mushjärna (Jonas Töle, Wikimedia Commons), kryostat och mushjärnsektion (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), glasbehållare (OpenClipart, FreeSvg.org) och mikroskop (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 3513
6-well plates Corning 3516
Clear nail polish User preference N/A
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Embedding molds Thermo Scientific 1841
Ethylene glycol User preference N/A
Formalin solution Fisher Scientific SF98-4
Horse serum, heat inactivated Gibco 26050088
Microscope slide boxes Electron Microscopy Services 71370
PBS User preference N/A
Primary antibody User preference N/A
Rectangular Coverslips VWR 48393-081 24 x 50 mm
Rectangular staining dish Electron Microscopy Services 70312
Round artist paintbrush #2 Princeton Select Series 3750R Brand not important
Secondary antibody User preference N/A
Specimen matrix for embedding OCT Tissue-Tek, Sakura 4583
Stain tray – slide staining system Electron Microscopy Services 71396-B Use dark lid
Sucrose User preference N/A
Superfrost Plus Micro Slides VWR 48311-703
TBS User preference N/A
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vectashield antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000 Non-hardening
Well inserts for 12-well plates Corning Netwells 3477
Well inserts for 6-well plates Corning Netwells 3479
Whatman filter paper Millapore-Sigma WHA1440042

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
  2. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  3. Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
  4. Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374 (1999).
  5. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  6. Hermersdörfer, H. Immunocytochemistry. A Practical Approach. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).
  7. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of Immunohistochemistry. Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  8. Coons, A. H. International Review of Cytology. International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).
  9. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
  10. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).
  11. Li, A., Yang, D. H. Methods in Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. 2108, Clifton, N.J. 43-55 (2020).
  12. Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
  13. Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
  15. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, Clifton, N.J. 55-61 (2010).
  16. van der Loos, C. A focus on fixation. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  19. Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
  20. Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
  21. Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
  22. Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
  23. Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
  24. Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
  25. Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
  26. Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
  27. Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
  28. Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
  29. Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
  30. Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
  31. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
  32. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
  33. Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
  34. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  35. Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
  36. Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
  37. Burry, R. W. Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
  38. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
  39. Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , Springer. 207-262 (1981).
  40. Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).

Tags

Biologi utgåva 162 histokemi immunofluorescens immunhistokemi fritt flytande hjärna åldrande neurodegeneration proteinuttryck proteinvisualisering antikroppsmärkning
Histologiskt baserade färgningar med fritt flytande vävnadssnitt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross,… More

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (162), e61622, doi:10.3791/61622 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter