Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61622
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1George & Anne Ryan Institute for Neuroscience, College of Pharmacy, Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, University of Rhode Island, 2Department of Neuroscience, Biomedicum, Karolinska Institutet

Summary

טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, לב וכבד.

Abstract

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה נפוצה לדמיין מבני רקמות ספציפיים, כמו גם ביטוי חלבונים ולוקליזציה. שתי גישות חלופיות נמצאות בשימוש נרחב לטיפול בקטעי הרקמה במהלך הליך הצביעה, גישה אחת כוללת הרכבה ישירה של החלקים על שקופיות זכוכית, ואילו גישה שנייה, הציפה החופשית, מאפשרת לשמור על חלקים קבועים ולהכתים אותם כשהם תלויים בתמיסה. למרות שגישות המותקנות על שקופיות וצפות חופשיות עשויות להניב תוצאות דומות, טכניקת הציפה החופשית מאפשרת חדירת נוגדנים טובה יותר ולכן צריכה להיות השיטה המועדפת כאשר חלקים עבים יותר ישמשו לשחזור תלת-ממדי של הרקמות, למשל כאשר מוקד הניסוי הוא להשיג מידע על הקרנות דנדריטיות ואקסונליות באזורי מוח. בנוסף, מכיוון שהסעיפים נשמרים בתמיסה, אליציטוט יחיד יכול להכיל בקלות 30 עד 40 חלקים, שהטיפול בהם פחות מייגע, במיוחד במחקרים ביו-רפואיים בקנה מידה גדול. במאמר זה נמחיש כיצד ליישם את שיטת הציפה החופשית על צביעה פלואורסצנטית של אימונוהיסטוכימיה, תוך התמקדות בעיקר במקטעי מוח. נדון גם כיצד ניתן לשנות בקלות את טכניקת הציפה החופשית כך שתתאים לצרכים האישיים של החוקרים ותותאם לרקמות אחרות, כמו גם לכתמים היסטוכימיים אחרים, כגון המטוקסילין ואאוזין וקרסיל סגול, כל עוד דגימות הרקמה קבועות כראוי, בדרך כלל עם פרפורמלדהיד או פורמלין.

Introduction

Immunostaining היא פרקטיקה מחקרית פופולרית שהחלה לפני 130 שנה עם גילוי נוגדנים בסרום בשנת 1890 על ידי Von Behring1. בתחילת המאהה-20 הוצמדו צבעים לאנטיגנים ומאוחר יותר לנוגדנים כדרך לכמת ולדמיין תגובות1, ובשנת 1941 פיתח אלברט קונס את תוויות הנוגדנים הפלואורסצנטיות הראשונות, תגלית שחוללה מהפכה במיקרוסקופ אור 2,3. המונח "immunostaining" מקיף טכניקות רבות שפותחו באמצעות עיקרון זה, כולל כתם מערבי, ציטומטריית זרימה, ELISA, אימונוציטוכימיה ואימונוהיסטוכימיה 3,4. כתם מערבי מזהה נוכחות של חלבונים ספציפיים מתמציות רקמות או תאים5. חלבונים מופרדים לפי גודל באמצעות אלקטרופורזה בג'ל, מועברים לקרום ונבדקים באמצעות נוגדנים. טכניקה זו מצביעה על נוכחות של חלבון וכמה חלבון קיים; עם זאת, הוא אינו חושף מידע על לוקליזציה של החלבון בתוך תאים או רקמות. שיטה אחרת, אימונוציטוכימיה (ICC), מסמנת חלבונים בתוך תאים, בדרך כלל תאים המעובדים במבחנה. ICC מראה הן ביטוי חלבונים והן לוקליזציה בתוך תאים6. כדי לזהות ולדמיין חלבון מסוים ברמת הרקמה, נעשה שימוש באימונוהיסטוכימיה (IHC).

IHC היא שיטה שחוקרים משתמשים בה כדי להתמקד באנטיגנים ספציפיים בתוך רקמות, תוך ניצול התכונות הכימיות של מערכת החיסון 7,8. על ידי יצירת נוגדנים ראשוניים ומשניים ספציפיים הקשורים לאנזים או לצבע פלואורסצנטי, אנטיגנים בעלי עניין יכולים להיות מסומנים ומתגלים ברוב הרקמות (כפי שנסקר ב- Mepham ו- Britten)9. המונח "אימונוהיסטוכימיה" כשלעצמו אינו מפרט את שיטת הסימון המשמשת לחשיפת האנטיגן המעניין; לפיכך, מינוח זה משולב לעתים קרובות עם טכניקת הזיהוי כדי להגדיר בבירור את שיטת התיוג: אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית (CIH) כדי לציין מתי הנוגדן המשני מצומד לאנזים, כגון פרוקסידאז; או IHC פלואורסצנטי כדי לציין מתי הנוגדן המשני מצומד לפלואורופור, כגון פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) או טטרמתילרודאמין (TRITC). הסלקטיביות של IHC מאפשרת לרופאים ולחוקרים לדמיין ביטוי ופיזור חלבונים ברקמות, במצבי בריאות ומחלות שונים10. בתחום הקליני, IHC משמש בדרך כלל לאבחון סרטן, כמו גם לקביעת הבדלים בסוגים שונים של סרטן. IHC שימש גם כדי לאשר סוגים שונים של זיהומים מיקרוביאליים בגוף, כגון הפטיטיס B או C11. במחקר ביו-רפואי, IHC משמש לעתים קרובות למיפוי ביטוי חלבונים ברקמות והוא חשוב בזיהוי חלבונים חריגים הנראים במצבי מחלה. לדוגמה, ניוון עצבי מלווה לעתים קרובות בהצטברות של חלבונים חריגים במוח, כגון פלאקים Αβ וסבכים נוירופיברילריים במחלת אלצהיימר. מודלים של בעלי חיים מפותחים לעתים קרובות כדי לחקות מצבים פתולוגיים אלה, ו-IHC היא שיטה אחת שבה משתמשים החוקרים כדי לאתר ולכמת את החלבונים המעניינים 10,12,13. בתורו, אנו יכולים ללמוד יותר על הגורמים למחלות אלה, ואת הסיבוכים המתעוררים איתם.

ישנם שלבים רבים הכרוכים בביצוע IHC. ראשית, רקמת העניין נאספת ומוכנה להכתמה. ניתן לטעון שרוב החוקרים מכינים דגימות רקמה קבועות, כאשר זילוח של הקיבוע באמצעות מערכת הדם הוא אופטימלי מכיוון שהוא משמר מורפולוגיה14,15. ניתן להשתמש גם לאחר קיבוע של דגימות רקמה אך עשוי להניב תוצאות פחות מאידיאליות16. קיבוע צולב, כגון פורמלדהיד, פועל על ידי יצירת קשרים כימיים בין חלבונים ברקמה17. לאחר מכן פורסים רקמות קבועות לשכבות או מקטעים דקים מאוד באמצעות מיקרוטום, כאשר חוקרים רבים מעדיפים לאסוף חלקים קפואים באמצעות הקפאה. משם הרקמה נאספת ומורכבת ישירות על מגלשת מיקרוסקופ (שיטת החלקה על החלקה), או תלויה בתמיסה (שיטת ציפה חופשית), כגון מלח חוצץ פוספט (PBS)18. שיטת האיסוף בה נעשה שימוש נקבעת מראש על פי צרכי החוקר, כאשר כל אחת משתי שיטות אלה מציגה יתרונות וחסרונות משלה.

השיטה המותקנת בהחלקה היא ללא ספק הנפוצה ביותר, כאשר יתרון חשוב הוא שניתן להכין חלקים דקים מאוד (10-14 מיקרומטר), מה שחשוב, למשל, לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון. יש גם טיפול מינימלי בדגימה, מה שמקטין את הנזק הפוטנציאלי לשלמות המבנית של הרקמה19. חוקרים משתמשים לעתים קרובות בטכניקה זו עם רקמה קפואה טרייה (רקמה שמוקפאת מיד באמצעות קרח יבש, איזופנטאן וכו '), שהיא עדינה מאוד בהשוואה לרקמה קבועה ויש לנקוט בזהירות רבה כדי למנוע הפשרה של הדגימה. יתרון נוסף של שימוש בחלקים המותקנים על שקופיות הוא שבדרך כלל אין צורך בכמויות גדולות של פתרונות לצביעה4. לכן, חוקרים יכולים להשתמש בכמות קטנה יותר של נוגדנים יקרים או כימיקלים אחרים כדי להשלים את הכתם. בנוסף, ניתן להעלות קטעים ממספר קבוצות ניסוי שונות על אותה שקופית, מה שיכול להיות יתרון, במיוחד במהלך רכישת תמונה. מצד שני, ישנם כמה חסרונות בשימוש במקטעים המותקנים על שקופיות, ובראשם שקטע הרקמה מוצמד לשקופית ובכך מגביל את חדירת הנוגדנים לצד אחד של המקטע, מה שמגביל את עובי הקטע ואת הייצוג התלת ממדי של הרקמה. זה יכול לקרות גם כי במהלך שטיפות, הקצוות של הרקמה וחלקים שלמים עשויים להתנתק מן השקופית, מה שהופך את הניסוי כולו חסר תועלת. יתר על כן, IHC בדרך כלל צריך להתבצע במהירות יחסית בעת שימוש בגישה המותקנת על שקופיות כדי למנוע השפלה של אפיטופ האנטיגן 20,21 עם שקופיות לא מעובדות המאוחסנות בדרך כלל ב -20 או -80 ° C, לעתים קרובות מכוסה ומאוחסן אופקית או בתיבות שקופיות, וכתוצאה מכך טביעת רגל אחסון גדולה יחסית. לבסוף, טכניקת ההרכבה על שקופיות יכולה גם לקחת זמן רב אם החוקרים צריכים לטפל במספר רב של שקופיות כדי לעבד מספר גדול של קטעי רקמות.

בשל חלק מהאתגרים הללו באמצעות שיטת ההרכבה על השקופיות, שינוי שנקרא שיטת הציפה החופשית הפך לחלופה פופולרית. טכניקה זו נכנסה לספרות בשנות ה-60-70 22,23,24, צברה פופולריות בשנות ה-80 25,26,27,28,29, וכיום היא שיטה מבוססת היטב הכוללת ביצוע הכתם על הקטעים שנאספו בהשעיה ולא היצמדה לשקופית 12,30,31 . שיטת הציפה החופשית אינה מומלצת כאשר קטעי הרקמה הם פחות מ -20 מיקרומטר; עם זאת, מניסיוננו זוהי הגישה הנבחרת כאשר חלקים עבים יותר (40-50 מיקרומטר) להיות מוכתם. יתרון מובהק אחד הוא שנוגדנים יכולים לחדור חלקים צפים חופשיים מכל הזוויות וליצור פחות צביעת רקע הודות לשטיפה יעילה יותר, כל זאת וכתוצאה מכך איתות טוב יותר בעת ההדמיה. בנוסף, החלקים מותקנים על השקופיות לאחר העיבוד, ובכך מבטלים את האפשרות של ניתוק רקמות, כמו גם מפחיתים את הזמן התופס את ההקפאה. שיטת הציפה החופשית יכולה גם להיות הרבה פחות אינטנסיבית עבודה, במיוחד עבור מחקרים ביו-רפואיים בקנה מידה גדול. למשל, ניתן להכתים חלקים רבים (18-40) מאותה דגימה יחד באותה באר, מה שחוסך זמן בביצוע שלבי השטיפה והדגירה של הנוגדנים. יתר על כן, מכיוון שניתן להרכיב מספר גדול יותר (12-16) של מקטעים בכל שקופית באמצעות גישה זו, לעתים קרובות נוח ומהיר יותר לחוקר להציג ולצלם קטעים. יש לציין כי במהלך הרכבה של פרוסות רקמות על השקפים, ניתן לחבר ולנתק חלקים עד לקבלת הכיוון הרצוי. החוקרים גם משתמשים לעתים קרובות בריכוזים מעט נמוכים יותר של נוגדנים בשיטת הציפה החופשית, ומכיוון שהדגירות מבוצעות בצינורות מיקרוצנטריפוגות, ניתן לאסוף את הנוגדנים בקלות ולשמר אותם עם נתרן אזיד לשימוש חוזר (ראה שלב 5.1). יתרון נוסף הוא שניתן לאחסן את המקטעים ישירות ב -80 מעלות צלזיוס בצינורות מיקרוצנטריפוגות קטנות עם תמיסה קריופרוטקגנטית32, ובכך למזער את שטח האחסון ולמקסם את תוחלת החיים של הדגימות33. החיסרון בשימוש בטכניקה זו הוא שהקטעים מטופלים הרבה, ולכן הם נוטים לפגוע. עם זאת, ניתן להקל על כך על ידי שימוש בטלטול נמוך ובמהירויות סיבוב נמוכות, כמו גם הכשרה נכונה של החוקרים כיצד להעביר את הדגימות ולהרכיב את המקטעים על השקפים.

יחד, IHC הוא כלי מבוסס וחיוני להדמיה וללוקליזציה של ביטוי חלבונים הן בתחום המחקר הקליני והן בתחום המחקר הביו-רפואי. IHC צף חופשי היא שיטה יעילה, גמישה, כמו גם כלכלית, במיוחד בעת ביצוע מחקרים היסטולוגיים בקנה מידה גדול. כאן, אנו מציגים פרוטוקול IHC פלואורסצנטי אמין וצף חופשי עבור הקהילה המדעית שניתן להתאים בהתאם לכתמים כרומוגניים של IHC וכתמים אחרים כגון המטוקסילין ואאוסין או צביעה סגולה קרזיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת רקמות להקפאה

  1. הטמיעו רקמות קבועות בתבנית הטבעה מתאימה (ראו טבלת חומרים) ליצירת גוש דגימה באמצעות מטריצת דגימות מתאימה (ראו טבלת חומרים) והקפיאו על קרח יבש. אחסנו את גושי הדגימה בטמפרטורה של -80°C עד שהם מוכנים לחתוך.
    הערה: רקמות קבועות מוכנות בדרך כלל על ידי ניקוב מכרסמים בוגרים (בני 2.5 עד 30 חודשים) זכרים או נקבות (עכבר או חולדה)34, בהתאם להיתר אתי זמין, עם קיבוע מתאים (למשל 10% פורמלין), ואחריו רקמות לאחר קיבוע באותו קיבוע במשך 12 שעות ב 4 מעלות צלזיוס, שטיפת רקמות שלוש פעמים עם PBS 1x, והנחת רקמות ב-15% ולאחר מכן 30% סוכרוז ב-1x PBS למשך הלילה או עד שהרקמות שוקעות35. חוקרים עשויים לנסות להתאים את הפרוטוקול הכללי הזה לשלבי התפתחות שונים.

2. Cryosectioning

  1. כאשר מוכנים לחתך, אקלום דגימות בהקפאה לפחות 1-2 שעות לפני החתך כדי למנוע ריסוק של רקמה.
  2. בעזרת הקפאה, חותכים רקמות למקטעים (20-50 מיקרומטר) ואוספים פנימה 6 או 12 תוספות באר (ראה טבלת חומרים) מלאות בתמיסת PBS אחת.
    הערה: בהתאם לעובי המקטע, כמות הרקמה שיש לאסוף ומספר תוספות הבאר בהן נעשה שימוש, כל באר תכיל מספר משתנה של חתכים המשתרעים על פני כ-10 עד 40 פרוסות לבאר. לדוגמה, אם מוח שלם נחתך ב-40 מיקרומטר, ייאספו כ-18-24 מקטעים בכל באר באמצעות תוספות של 12 בארות. כמו כן, חתכים של 20 מיקרומטר יכולים להיות מעט מאתגרים לטיפול, ולכן 40 מיקרומטר מומלץ לצביעה בתפזורת (ראה דיון).

3. אחסון חלקים

  1. לאחר האיסוף, לשטוף את החלקים עם 1x PBS מוכן טרי במשך 5 דקות. חזור על הפעולה 3 פעמים.
  2. מעבירים את החלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 2 מ"ל מלאים בתמיסת אחסון של 1-1.5 מ"ל (עבור 250 מ"ל, מערבבים 70 גרם סוכרוז, 75 מ"ל אתילן גליקול, ומביאים לנפח עם חיץ פוספט 0.1 M).
  3. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד להכנה לצביעה.

4. יום הכתמה I

  1. מוציאים את הדגימות מהמקפיא ומאזנים אותן בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 - 20 דקות.
  2. יוצקים חלקים לתוך באר להכניס צלחת 6 באר כדי להפריד פתרון אחסון מקטעים.
  3. העבירו את הכנסת הבאר לבאר אחרת המכילה כ-6 מ"ל של 1x TBS. שטפו 3 פעמים עם 1x TBS במשך 5 דקות כל אחת בשייקר מסלול במהירות נמוכה ב-RT.
  4. בזמן שהמקטעים שוטפים, הכינו 7 מ"ל (לדגימה) של תמיסה חודרת-חוסמת המורכבת מ-1x TBS עם 0.3% Triton X-100 ו-3% סרום רגיל (למשל, נסיוב סוסים רגיל). חסום קטעים למשך 30 דקות ב- RT בשייקר מסלולי, תוך שימוש במהירות נמוכה.
    הערה: חסימה באמצעות סרה מונעת קשירה לא ספציפית של נוגדנים לרקמות או קולטני Fc לא ספציפיים – מומלץ להשתמש בסרום התואם את מין הנוגדן המשני, אך אם אינו זמין, ניתן להשתמש בכל סרום רגיל ממין שונה מהחיה המארחת של הנוגדנים הראשוניים. חומר הניקוי Triton X-100 מאפשר חדירת נוגדנים טובה יותר על ידי חדירת הרקמה.
  5. הכינו 1 מ"ל לכל דגימה של תמיסת נוגדנים ראשונית המורכבת מנוגדנים ראשוניים נבחרים (מדוללים כראוי) ב-1x TBS עם 0.3% Triton X-100 ו-1% סרום רגיל (ראו שלב 4.4 הערה). מעבירים קטעים מבאר מוכנסים לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל תמיסת נוגדנים ראשונית כדי להיקשר לאנטיגן(ים) המעניין.
    הערה: ניתן להשתמש במספר נוגדנים ראשוניים (שנוצרו במינים מארחים שונים).
  6. מניחים צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל עם חלקים על מיקסר מסתובב במהירות נמוכה (למשל, מהירות 7 סל"ד) ודגרים למשך לילה במשך 12-16 שעות ב-4°C.

5. יום הצביעה II

  1. למחרת, יוצקים חלקים לתוך באר להכניס צלחת 6 באר כדי להפריד חלקים מתמיסת נוגדנים ראשונית.
    הערה: ניתן לאסוף תמיסת נוגדנים ולעשות בה שימוש חוזר; הוסף 0.02% (w/v) נתרן אזיד כדי לעכב צמיחה מיקרוביאלית.
  2. יש לכבס את המקטעים 3 פעמים עם 1x TBS ב-RT (30 שניות עבור 2 השטיפות הראשונות ו-10 דקות עבור השטיפה הסופית).
  3. הכינו 1 מ"ל לכל דגימה של תמיסת נוגדנים משנית המורכבת מנוגדן משני מתאים (מדולל בהתאם) ב-1x TBS עם 0.3% Triton X-100 ו-1% סרום רגיל (תמיסת מגן מפני אור).
    הערה: תיוג עקיף עם נוגדן משני מצומד מגביר את האות ומאפשר הדמיה קולורימטרית או פלואורסצנטית של מטרת החלבון.
  4. העברת קטעים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל המכיל תמיסת נוגדנים משנית. יש לדגור במשך שעתיים ב-RT על שייקר מסלולי, תוך שימוש במהירות נמוכה (תמיסת מגן מפני אור).
  5. יוצקים חלקים לתוך באר להכניס צלחת 6 באר כדי להפריד חלקים מתמיסת נוגדנים משנית.
  6. כדי להמשיך להגן על הדגימות מפני אור, שטפו פעמיים עם 1x TBS במשך 30 שניות ב-RT. לאחר מכן שטפו במשך 15 דקות בכף אחת, הוסיפו DAPI (1-0.1 מיקרוגרם/מ"ל) אם רוצים.

6. הרכבה

  1. יוצקים חלקים לתוך תא היסטולוגי זכוכית, מלבני מלא שלושה רבעים עם 1x TBS.
  2. השקיעו שקופית זכוכית ב-1x TBS והשתמשו במברשת צבע עדינה כדי לשדל את המקטעים לכיוון השקופית.
  3. הקש בעדינות על המקטעים על השקופית, וודא שאין קמטים או קפלים.
  4. חזור על הפעולה עד שכל המקטעים יוטענו בשקופיות.
    הערה: כאשר מוח שלם, למשל, נחתך ב 40 מיקרומטר, נאסף ב 12 תוספות באר עם aliquot אחד המכיל 18-24 חלקים; פרוסות מותקנות בדרך כלל על 1-2 שקופיות, אך ניתן גם להרכיב פחות מקטעים בכל שקופית, בהתאם להעדפת החוקר.

7. כיסויים

  1. לאחר ייבוש המקטעים על המגלשה(ים), כ-10-15 דקות ב-RT או עד שהמקטעים נראים אטומים (זכרו להגן על שקופיות מפני אור), מרחו אמצעי הרכבה מימי מתאים (התקשות או אי-התקשות). אנטי-דהייה עדיפה אם משתמשים בנוגדן משני מצומד פלואורסצנטי.
    הערה: איכות הפלואורסצנטיות עשויה להיות פחותה בעת שימוש באמצעי הרכבה מתקשה, אך שקופיות אמורות להחזיק מעמד זמן רב יותר.
  2. בעזרת פינצטה, מניחים כיסוי על גבי המדיום. כסו בנייר סינון ולחצו בחוזקה כלפי מטה כדי להסיר אמצעי הרכבה עודפים.
    הערה: אם אתם משתמשים בתושבת שאינה מתקשה, צבעו את קצוות השקופית המכוסה בלק שקוף לאיטום.
  3. קטעי תמונה באמצעות מיקרוסקופ מתאים. יש לאחסן בקופסת שקופיות חשוכה בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: ניתן לצלם מקטעים באמצעות מגוון מיקרוסקופים, כגון סריקת לייזר פלואורסצנטית קונפוקלית והפוכה או זקופה, בהגדלות (למשל, 10x, 20x, 40x) בהתאם לצרכי החוקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוכנית הכוללת של השימוש בשיטת הציפה החופשית לביצוע בדיקה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מודגמת באיור 1. דוגמה מייצגת של IHC פלואורסצנטי המשתמש בשיטת הציפה החופשית במוח עכבר הבוחן ביטוי חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP) מוצגת באיור 2 בהגדלה נמוכה וגבוהה יותר כדי להמחיש את האיכות הכוללת של הצביעה. גישה זו מתאימה גם לחשיפת חלבונים בעלי ביטוי נמוך, עם דוגמה ממוח עכבר מהונדס בעל ביטוי נמוך GFP המוצג באיור 3. ניתן להשתמש בשיטת הציפה החופשית גם בפרוטוקולי צביעה היסטוכימיים אחרים, כגון סגול קרזיל, כפי שמוצג באיור 4, על-ידי ביצוע שלבים 1 עד 4.3 של הפרוטוקול ולאחר מכן הרכבת המקטעים כפי שמצוין בשלב 6. לאחר מכן, ניתן לעבד מקטעים באמצעות כל צביעה הדורשת חלקים המותקנים בשקופיות. בעת שימוש בפרוטוקול זה עבור IHC כרומוגני, בצע את הפרוטוקול משלבים 1 עד 5.6 (אל תוסיף DAPI לשטיפה האחרונה), והתאם בהתאם אם אתה משתמש בשלב הגברה (למשל, קומפלקס אבידין-ביוטין). החליפו את החיץ בריאגנט כרומגן/סובסטרט, תוך דגירה של 5-20 דקות עד שהרקמה תהפוך לצבע הרצוי. ניתן לעקוב אחר התגובה על ידי בדיקת הרקמה מעת לעת במיקרוסקופ בעוצמה נמוכה. לסיים את התגובה על ידי העברת הבאר להכניס עם החלקים למאגר טרי, לשטוף אותם שלוש פעמים, לפחות 5 דקות כל אחד. המשך לשלב 6 כדי להרכיב את המקטעים על מגלשות זכוכית, ולאפשר לחלקים להתייבש על מגלשה חמה יותר למשך 3-4 שעות לפחות. יש לייבש את המגלשות עם עלייה בריכוזי אתנול (כלומר, 70%, 90%, 95%, 99.5%, 2-5 דקות כל אחת) ולאחר מכן קסילן (5-10 דקות) ולאחר מכן לכסות עם מדיום קשיח (למשל, אנטלן), המאפשר למגלשות להתייבש לפחות 1-2 שעות באזור מאוורר. אם הרקע גבוה מדי, הרוו את פעילות הפרוקסידז האנדוגנית למשך 15 דקות ב-RT עם 3% H 2 O2ב-1x TBS ולאחר מכן שלוש שטיפות חיץ, 15-20 דקות כל אחת, לפני החסימה (שלב 4.4). מספר רקמות היקפיות ניתנות גם לשימוש בטכניקה זו ללא שינויים בפרוטוקול הנדרש, עם דוגמה של קטעי כבד מעכבר המבטא GFP המוצגים באיור 5.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה של הבדיקה האימונוהיסטוכימית הפלואורסצנטית הצפה. יש לנתח את האיבר המעניין (רצוי רקמה קבועה) ולהטמיע רקמה בתבניות הטבעה (ראו טבלת חומרים) באמצעות מטריצת דגימות (ראו טבלת חומרים), ולאחר מכן להקפיא על קרח יבש ולאחסן בטמפרטורה של -80°C. חתכו רקמות באמצעות קריוסטט ב 20-50 מיקרומטר ואספו פרוסות בתוספות באר (ראה טבלת חומרים) מלאות 1x PBS. באמצעות שייקר אורביטלי במהירות נמוכה, שטפו מקטעים 3x למשך 5 דקות כל אחד ב-1x PBS. בשלב זה, אחסן חלקים נוספים במאגר אחסון בטמפרטורה של -80°C עד לצורך. שטפו את המקטעים הנותרים 3 פעמים למשך 5 דקות עם 1x TBS. חסמו מקטעים למשך 30 דקות ברעד RT במהירות נמוכה. הכינו תמיסת נוגדנים ראשונית ודגרו על חלקים למשך הלילה בצינור(ות) מיקרוצנטריפוגות בטמפרטורה של 4°C (12-14 שעות). למחרת, שטפו חלקים עם 1x TBS 3x, שתי השטיפות הראשונות במשך 30 שניות, והכביסה השלישית למשך 10 דקות. לדגור על מקטעים בתמיסת נוגדנים משנית בשפופרות מיקרוצנטריפוגות למשך שעתיים ב- RT, תוך הקפדה על הגנה על חלקים מפני אור במידת האפשר משלב זה והלאה. לאחר מכן שטפו 3x עם 1x כפות, שתי שטיפות ראשונות במשך 30 שניות, וכביסה שלישית במשך 15 דקות. הוסף DAPI לכביסה אחרונה אם תרצה ואם אינו קיים באמצעי הרכבה. מזגו מקטעים לקופסה קאמרית, שלושת רבעי מלאה ב-1x TBS, והשתמשו במברשת צבע כדי להדביק מקטעים על השקפים. אפשר לשקופיות להתייבש (~ 10-15 דקות) לפני ההחלקה עם אמצעי הרכבה לבחירה. קטעי תמונה באמצעות מיקרוסקופ מתאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית באמצעות חלקי מוח שצפים בחופשיות. אזורי מוח בהיפוקמפוס הבוחנים ביטוי GFAP בעכבר בוגר מוצגים וסומנו באמצעות נוגדן ראשוני נגד GFAP שגדל בארנב ונוגדן משני נגד ארנב Alexa568 שגודל בחמור. DAPI שימש בכביסה האחרונה כדי לסמן גרעינים. הרקמה נחתכה ב 40 מיקרומטר באמצעות קריוסטט. התמונות צולמו בהגדלה של 10x (עליון) ו-40x (תחתון) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודת לייזר. סרגל קנה מידה של תמונה 10x = 400 מיקרומטר. סרגל קנה מידה של תמונה 40x = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלבונים בעלי ביטוי נמוך יותר בשיטת הציפה החופשית. אזורי מוח בהיפוקמפוס מעכבר בוגר מהונדס GFP בעל ביטוי נמוך מוצגים. תאי עצב המבטאים GFP סומנו באמצעות נוגדן ראשוני נגד GFP שגודל בעז ונוגדן משני נגד עז Alexa488 שגודל בחמור. DAPI שימש בכביסה האחרונה כדי לסמן גרעינים. הרקמה נחתכה ב 40 מיקרומטר באמצעות קריוסטט. התמונות צולמו בהגדלה של פי 40 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודת לייזר. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: צביעה בצבע סגול קרסיל באמצעות חלקי מוח שצפים בחופשיות. באמצעות הקפאה, חלקים של 40 מיקרומטר מנורת ריח של עכבר בוגר ועד המוח הקטן נאספו, נשטפו, הותקנו על שקופיות, הוכתמו בסגול קרסיל וכוסו. התמונות צולמו בהגדלה של פי 10 באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב הפוך. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית באמצעות חלקי כבד צפים חופשי. חלקים של כבד שנלקחו ב 40 מיקרומטר באמצעות cryostat של עכבר בוגר מהונדס המבטא רמות נמוכות של GFP מוצגים. נוגדן ראשוני נגד GFP שגודל בעז עם נוגדן משני נגד עז Alexa488 שגודל בחמור שימש לסימון תאים המבטאים GFP. DAPI נוסף לכביסה האחרונה כדי לסמן גרעינים. התמונות נאספו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודת לייזר בהגדלה של פי 40. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה רב-תכליתית שהפכה לחיונית בזיהוי ביטוי חלבונים ולוקליזציה בתוך חלקי רקמות. בדיקה זו משמשת ברחבי הקהילה המדעית כדי להבין עוד יותר מאפיינים של רקמה משלבים של תפקוד תקין למצבי מחלה. IHC מועסק במגוון תחומים, החל מאבחון קליני של מחלות כגון סרטן ועד תגליות ראשוניות במחקר פרה-קליני10,36.

הטכניקה הנפוצה ביותר לביצוע IHC היא שיטת ההרכבה על שקופיות שבה הקטעים נצמדים מיד לשקופית לאחר שנחתכו. חלק מהיתרונות של שימוש בטכניקה זו היא שחוקרים יכולים לטפל במקטעים דקים מאוד הדרושים למחקרי קולוקליזציה של חלבונים ולהשתמש בתמיסה קטנה כדי להכתים את הקטעים בכל שקופית. נוגדנים הם לעתים קרובות יקרים; לכן, גישה זו יכולה להיות אופציה כלכלית אם יש לעבד כמה חלקים. זוהי גם שיטת הבחירה של חוקרים המשתמשים בדגימות קפואות טריות מכיוון שהטיפול ברקמה הוא מינימלי, ולכן שלמותה המבנית של הרקמה תהיה מוגנת. שימוש בגישה המותקנת על שקופיות יהיה מתאים גם אם רק כמה חלקים ייאספו ויוכתמו מיד, כפי שקורה בפתולוגיה קלינית. מצד שני, ישנם כמה חסרונות, כגון גישה רק לצד החשוף של הרקמה בזמן הצביעה, ובכך מגביל את עובי הקטע עקב חדירת נוגדנים לקויה ושטיפה יעילה. חיסרון נוסף הוא שברגע שהרקמה נחתכת ונאספת על שקופיות, IHC בדרך כלל חייב להסתיים די מהר עם אחסון של שקופיות לא מעובדות שתופסות הרבה מקום במקפיא. יתר על כן, בעת עיבוד ניסויים גדולים יותר (למשל, מספר אזורים במוח עם רמות מרובות ומייצגות שיש להכתים), גישה זו עשויה למעשה להשתמש ביותר ריאגנטים, לגזול זמן רב, ולעתים קרובות יכולה להגביל את מספר השקפים שיש לעבד לכל ניסוי.

ניתן להתגבר על כמה מגבלות הקשורות לשיטת ההרכבה על החלקה על ידי טכניקת הצביעה החופשית שהפכה לחלופה פופולרית יותר ויותר בעבודה עם חלקים עבים יותר. למרות ששיטה זו אינה גישה חדשנית, מניסיוננו, זו הייתה גישה אמינה, ניתנת לשחזור וגמישה, במיוחד עבור צביעת דגימות רקמה בכמויות גדולות, ובכך אפשרה עיבוד של מחקרים בקנה מידה גדול יותר בצורה יעילה. חוקרים יכולים גם להריץ ביעילות ניסויי IHC מרובים וגדולים בו זמנית בשיטה זו. יתר על כן, הדגימות מוכתמות בתרחיף, ולכן התמיסות יכולות לחדור את החלקים מכל הזוויות, דבר חשוב במיוחד עבור מקטעים עבים יותר, מה שמוביל לעתים קרובות לכתם איכותי יותר (איור 2, איור 3 ואיור 5). חלקים צפים חופשיים יכולים להיות פרוסים בכל מקום בין 20-50 מיקרומטר בעובי37, עם חלקים עבים יותר שימושיים לחוקרים לראות מבנים או תאים במישורי ראייה שונים. לדוגמה, ברקמת המוח, חלקים עבים יותר מאפשרים לחוקרים לראות את המבנה של דנדריטים ואקסונים לאורך הדגימות שלהם. היכולת לאסוף פרוסות דקות יותר (20 מיקרומטר) מרחיבה עוד יותר את קשת היישומים; עם זאת, פרוסות דקות יותר יכולות להיות קשות לטיפול ולעתים קרובות דורשות יותר זמן ומאמץ כדי למזער את הנזק, ולכן חלקים לא צריכים להיות דקים יותר מ -40 מיקרומטר עבור כתמים בתפזורת. אחד היתרונות העיקריים של שיטת הציפה החופשית הוא שחוקרים יכולים לחתוך במהירות מוחות שלמים (או רקמות אחרות), לאסוף את כל החלקים בצינורות קטנים כאשר לכל אליקוט יש פרוסה מייצגת לכל אזורי המוח השונים, ובכך לאפשר לחוקרים להכתים במהירות את המוח כולו. צינורות המכילים פרוסות ניתן לאחסן cryoprotectant ב -80 מעלות צלזיוס במשך מספר שנים33, עם aliquots לא תופסים הרבה מקום במקפיא, למעשה מאפשר לחוקרים ליצור "ספריית רקמות". שיטה זו גם מפחיתה את כמות החומרים המבוזבזים, כולל שקופיות, כיסויים ובעיקר נוגדנים, אותם ניתן לשחזר ולשמר בקלות לשימוש חוזר, כמו גם רקמות יקרות של בעלי חיים, שכן ניתן לאחסן ולשמור חלקים כל עוד המשתמשים בוחרים.

גישת הציפה החופשית והפרוטוקול המוצג כאן גם נותנים לחוקרים את האפשרות לשנות בקלות את הפרוטוקול או לשנות את ייעוד המשאבים. לדוגמה, המקטעים שנאספו יכולים לשמש עבור כתמים היסטוכימיים רבים ושונים בנוסף לאימונופלואורסנציה עם שינויים פשוטים בפרוטוקול, כגון IHC כרומוגני, המטוקסילין ואאוזין (H&E), קרסיל סגול (איור 4) ורנוסקופ38. IHC כרומוגני מאפשר הדמיה של ביטוי אנטיגן כאשר סובסטרט מסיס מומר על ידי אנזים מצומד לנוגדן משני למוצר כרומוגני בלתי מסיס. שני האנזימים הנפוצים ביותר הם חזרת פרוקסידאז (HRP), אשר ממיר את 3,3' diaminobenzidine (DAB) למוצר סופי חום כהה, ואת phosphatase אלקליין (AP), אשר ממיר את המצע 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) למוצר אדום39. אנו מבצעים באופן שגרתי צביעה סגולה קרסיל ומשתמשים במקטעים צפים חופשיים על מנת לבחון את ארגון המוח הגס ואת המורפולוגיה40. כמו כן, יישמנו בהצלחה את הפרוטוקול הזה על רקמות רבות ושונות, כולל מוח, כבד, לב, כליות וטחול (איור 5). חוקרים אחרים השתמשו בהצלחה גם בטכניקה זו עבור רקמות היקפיות כולל כבד, כליות ושחלות22,23,24.

דאגה עיקרית בשימוש בטכניקת ציפה חופשית היא הפוטנציאל לנזק מבני לחלקי הרקמה, במיוחד לפרוסות המוח, מכיוון שלאורך כל הפרוטוקול, הדגימות נמצאות על מטלטלים ומסובבים כמעט בכל שלב כדי להבטיח שהן נשטפות, חסומות ומוכתמות באופן שווה. לעיתים, אזורים מסוימים במוח יכולים להיות מנותקים, במיוחד ברמות המוח הקטן; עם זאת, שימוש באטלס מוח וצורה של הגדלה, כגון מנורת תכשיטן, במהלך תהליך ההרכבה יכול להיות מועיל לחיבור חלקים. בדרך כלל ניתן למנוע אתגר זה באמצעות טיפול עדין בדגימות ועל ידי שמירה על מכונות מסתובבות במצב הנכון והנמוך.

לסיכום, אנו מציגים טכניקת IHC עצמאית מבוססת שהוכיחה את עצמה כשיטה חיונית, אמינה, גמישה ויעילה בה אנו משתמשים באופן קבוע כדי להמחיש ביטוי ולוקליזציה של חלבונים, כמו גם מבנה רקמות במגוון רקמות. ניתן לשנות בקלות את הפרוטוקול כאן כך שיתאים לצרכי מחקר אינדיבידואליים, מה שהופך אותו לבעל ערך עבור הקהילה המדעית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין מה לחשוף

Acknowledgments

ברצוננו להודות למכון הלאומי להזדקנות (K99/R00 AG055683 ל-JMR), למכון ג'ורג' ואן ריאן למדעי המוח (EP, GC, JMR), למכללה לרוקחות באוניברסיטת רוד איילנד (EP, GC, JMR) ול-Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). אנו מודים לדוקטורנטית רבקה סנפט, בהכשרתה עם פרופ' סוזן דימצקי, המחלקה לגנטיקה, בית הספר לרפואה של הרווארד, על שהכירה לנו את שיטת הציפה החופשית. חלק מהתמונות ששימשו באיור 1 התקבלו ממקורות "חופשיים לשימוש, לשיתוף או לשינוי, אפילו מסחריים": עכבר ושפופרת מיקרוצנטריפוגה (Pixabay), מוח עכבר (Jonas Töle, Wikimedia Commons), אזור מוח קריוסטט ועכבר (מרכז DataBase למדעי החיים, ויקישיתוף), מיכל זכוכית (OpenClipart, FreeSvg.org) ומיקרוסקופ (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 3513
6-well plates Corning 3516
Clear nail polish User preference N/A
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Embedding molds Thermo Scientific 1841
Ethylene glycol User preference N/A
Formalin solution Fisher Scientific SF98-4
Horse serum, heat inactivated Gibco 26050088
Microscope slide boxes Electron Microscopy Services 71370
PBS User preference N/A
Primary antibody User preference N/A
Rectangular Coverslips VWR 48393-081 24 x 50 mm
Rectangular staining dish Electron Microscopy Services 70312
Round artist paintbrush #2 Princeton Select Series 3750R Brand not important
Secondary antibody User preference N/A
Specimen matrix for embedding OCT Tissue-Tek, Sakura 4583
Stain tray – slide staining system Electron Microscopy Services 71396-B Use dark lid
Sucrose User preference N/A
Superfrost Plus Micro Slides VWR 48311-703
TBS User preference N/A
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vectashield antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000 Non-hardening
Well inserts for 12-well plates Corning Netwells 3477
Well inserts for 6-well plates Corning Netwells 3479
Whatman filter paper Millapore-Sigma WHA1440042

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
  2. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  3. Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
  4. Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374 (1999).
  5. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  6. Hermersdörfer, H. Immunocytochemistry. A Practical Approach. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).
  7. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of Immunohistochemistry. Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  8. Coons, A. H. International Review of Cytology. International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).
  9. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
  10. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).
  11. Li, A., Yang, D. H. Methods in Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. 2108, Clifton, N.J. 43-55 (2020).
  12. Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
  13. Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
  15. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, Clifton, N.J. 55-61 (2010).
  16. van der Loos, C. A focus on fixation. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  19. Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
  20. Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
  21. Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
  22. Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
  23. Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
  24. Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
  25. Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
  26. Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
  27. Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
  28. Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
  29. Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
  30. Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
  31. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
  32. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
  33. Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
  34. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  35. Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
  36. Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
  37. Burry, R. W. Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
  38. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
  39. Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , Springer. 207-262 (1981).
  40. Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).

Tags

ביולוגיה גיליון 162 היסטוכימיה אימונופלואורסצנציה אימונוהיסטוכימיה ציפה חופשית מוח הזדקנות ניוון עצבי ביטוי חלבונים ויזואליזציה של חלבונים תיוג נוגדנים
כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross,… More

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (162), e61622, doi:10.3791/61622 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter