Summary
A técnica de flutuação livre permite que os pesquisadores realizem colorações histológicas, incluindo imuno-histoquímica em seções de tecido fixas para visualizar estruturas biológicas, tipo de célula e expressão e localização de proteínas. Esta é uma técnica histoquímica eficiente e confiável que pode ser útil para investigar uma infinidade de tecidos, como cérebro, coração e fígado.
Abstract
A imuno-histoquímica é uma técnica amplamente utilizada para visualizar estruturas teciduais específicas, bem como a expressão e localização de proteínas. Duas abordagens alternativas são amplamente utilizadas para lidar com as seções de tecido durante o procedimento de coloração, uma abordagem consiste em montar as seções diretamente em lâminas de vidro, enquanto uma segunda abordagem, a flutuação livre, permite que as seções fixas sejam mantidas e manchadas enquanto suspensas em solução. Embora as abordagens de montagem em lâmina e flutuação livre possam produzir resultados semelhantes, a técnica de flutuação livre permite uma melhor penetração de anticorpos e, portanto, deve ser o método de escolha quando seções mais espessas devem ser usadas para reconstrução 3D dos tecidos, por exemplo, quando o foco do experimento é obter informações sobre projeções dendríticas e axonais em regiões cerebrais. Além disso, uma vez que as seções são mantidas em solução, uma única alíquota pode facilmente acomodar 30 a 40 seções, cujo manuseio é menos trabalhoso, particularmente em estudos biomédicos em larga escala. Aqui, ilustramos como aplicar o método de flutuação livre à coloração imuno-histoquímica fluorescente, com um foco importante em seções cerebrais. Também discutiremos como a técnica de flutuação livre pode ser facilmente modificada para atender às necessidades individuais dos pesquisadores e adaptada a outros tecidos, bem como a outras colorações histoquímicas, como hematoxilina e eosina e violeta cresil, desde que as amostras de tecido sejam adequadamente fixadas, tipicamente com paraformaldeído ou formalina.
Introduction
A imunocoloração é uma prática de pesquisa popular que começou há 130 anos com a descoberta de anticorpos séricos em 1890 por Von Behring1. Durante o início doséculo 20, corantes foram ligados a antígenos e, posteriormente, a anticorpos como forma de quantificar e visualizar reações1, e em 1941 Albert Coons desenvolveu os primeiros marcadores de anticorpos fluorescentes, uma descoberta que revolucionou a microscopia de luz 2,3. O termo "imunocoloração" engloba muitas técnicas que vêm sendo desenvolvidas utilizando esse princípio, incluindo Western blot, citometria de fluxo, ELISA, imunocitoquímica e imuno-histoquímica 3,4. Western blot detecta a presença de proteínas específicas de extratos de tecidos ou células5. As proteínas são separadas por tamanho usando eletroforese em gel, transferidas para uma membrana e sondadas usando anticorpos. Esta técnica indica a presença de proteína e quanta proteína está presente; no entanto, não revela qualquer informação sobre a localização da proteína dentro de células ou tecidos. Outro método, a imunocitoquímica (ICC), marca proteínas dentro das células, tipicamente células cultivadas in vitro. O ICC mostra tanto a expressão quanto a localização de proteínas dentro dos compartimentos celulares6. Para detectar e visualizar uma proteína específica no nível do tecido, a imuno-histoquímica (IHC) é utilizada.
A IHC é um método que os pesquisadores utilizam para atingir antígenos específicos dentro do tecido, aproveitando as propriedades químicas do sistema imunológico 7,8. Ao gerar anticorpos primários e secundários específicos ligados a uma enzima ou a um corante fluorescente, antígenos de interesse podem ser marcados e revelados na maioria dos tecidos (conforme revisado em Mepham e Britten)9. O termo "imuno-histoquímica" por si só não especifica o método de marcação que é usado para revelar o antígeno de interesse; assim, essa terminologia é frequentemente combinada com a técnica de detecção para delinear claramente o método de marcação: imuno-histoquímica cromogênica (CIH) para indicar quando o anticorpo secundário é conjugado a uma enzima, como a peroxidase; ou IHC fluorescente para indicar quando o anticorpo secundário é conjugado a um fluoróforo, como isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou tetrametilrodamina (TRITC). A seletividade da IHC permite que clínicos e pesquisadores visualizem a expressão e a distribuição de proteínas pelos tecidos, em vários estados de saúde e doença10. No campo clínico, a IHC é comumente usada para diagnosticar o câncer, bem como para determinar diferenças em vários tipos de câncer. A IHC também tem sido usada para confirmar diferentes tipos de infecções microbianas dentro do corpo, como a hepatite B ou C11. Na pesquisa biomédica, a IHC é frequentemente usada para mapear a expressão de proteínas nos tecidos e é importante na identificação de proteínas anormais observadas em estados de doença. Por exemplo, a neurodegeneração é frequentemente acompanhada pelo acúmulo de proteínas anormais no cérebro, como placas Αβ e emaranhados neurofibrilares na doença de Alzheimer. Modelos animais são frequentemente desenvolvidos para imitar esses estados patológicos, e a IHC é um método que os pesquisadores utilizam para localizar e quantificar as proteínas de interesse10,12,13. Por sua vez, podemos aprender mais sobre as causas dessas doenças e as complicações que surgem com elas.
Há muitas etapas envolvidas na realização da IHC. Primeiro, o tecido de interesse é coletado e preparado para coloração. Indiscutivelmente, a maioria dos pesquisadores prepara amostras de tecido fixo, sendo ótima a perfusão do fixador via sistema circulatório, pois preserva a morfologia14,15. A pós-fixação de amostras de tecido também pode ser utilizada, mas pode produzir resultados abaixo do ideal16. Os fixadores de reticulação, como o formaldeído, atuam criando ligações químicas entre proteínas no tecido17. O tecido fixo é então cortado em camadas ou seções muito finas usando um micrótomo, com muitos pesquisadores preferindo coletar seções congeladas usando um criostato. A partir daí, o tecido é coletado e montado diretamente em uma lâmina de microscópio (método montado em lâmina) ou suspenso em uma solução (método de flutuação livre), como solução salina tamponada com fosfato (PBS)18. O método de coleta utilizado é predeterminado com base nas necessidades do pesquisador, com cada um desses dois métodos apresentando suas próprias vantagens e desvantagens.
O método montado em lâmina é de longe o mais comumente usado, com um benefício importante sendo que seções muito finas (10-14 μm) podem ser preparadas, o que é importante, por exemplo, para investigar interações proteína-proteína. Há também um manuseio mínimo do espécime, o que diminui o dano potencial à integridade estrutural do tecido19. Os pesquisadores costumam usar essa técnica com tecido fresco congelado (tecido que é imediatamente congelado usando gelo seco, isopentano, etc.), o que é muito delicado em comparação com o tecido fixo e muito cuidado para evitar o descongelamento da amostra precisa ser coletado. Outra vantagem de usar seções montadas em deslizamento é que grandes volumes de soluções para coloração geralmente não são necessários4. Assim, os pesquisadores podem usar uma quantidade menor de anticorpos caros ou outros produtos químicos para completar a mancha. Além disso, é possível montar seções de vários grupos experimentais diferentes no mesmo slide, o que pode ser vantajoso, especialmente durante a aquisição da imagem. Por outro lado, existem algumas desvantagens de usar seções montadas em lâmina, mais notavelmente que a seção de tecido é aderida à lâmina, restringindo assim a penetração de anticorpos a um lado da seção, o que limita a espessura da seção e a representação 3D do tecido. Também pode acontecer que, durante as lavagens, as bordas do tecido e seções inteiras possam se desprender da lâmina, tornando inútil todo o experimento. Além disso, a IHC geralmente tem que ser realizada de forma relativamente rápida ao usar a abordagem montada em lâmina para evitar a degradação do epítopo do antígeno 20,21 com lâminas não processadas normalmente armazenadas a -20 ou -80 °C, muitas vezes cobertas e armazenadas horizontalmente ou em caixas de lâmina, resultando em uma pegada de armazenamento relativamente grande. Por fim, a técnica montada em lâminas também pode ser demorada se os pesquisadores precisarem lidar com um grande número de lâminas para processar um grande número de seções de tecido.
Devido a alguns desses desafios usando o método montado em slide, uma modificação chamada método de flutuação livre tornou-se uma alternativa popular. Essa técnica entrou na literatura nas décadas de 1960-702,23,24, ganhando popularidade na década de 1980 25,26,27,28,29, e hoje é um método bem estabelecido que envolve a realização da coloração nas seções coletadas em suspensão, em vez de aderir a um slide 12,30,31 . O método de flutuação livre não é recomendado quando as secções teciduais são inferiores a 20 μm; no entanto, em nossa experiência, é a abordagem de escolha quando seções mais espessas (40-50 μm) devem ser coradas. Um benefício distinto é que os anticorpos podem penetrar em seções flutuantes livres de todos os ângulos e gerar menos coloração de fundo devido a uma lavagem mais eficaz, resultando em melhor sinalização ao fazer imagens. Além disso, as seções são montadas nas lâminas após o processamento, eliminando assim a possibilidade de descolamento tecidual, bem como diminuindo o tempo de ocupação do criostato. O método de flutuação livre também pode ser muito menos trabalhoso, especialmente para estudos biomédicos em larga escala. Por exemplo, é possível manchar muitas (18-40) seções da mesma amostra juntas no mesmo poço, o que economiza tempo na realização das etapas de lavagem e incubação de anticorpos. Além disso, uma vez que um número maior (12-16) de seções pode ser montado por slide usando essa abordagem, muitas vezes é mais conveniente e mais rápido para o pesquisador visualizar e visualizar seções de imagem. Notavelmente, durante a montagem de fatias de tecido nas lâminas, as seções podem ser anexadas e destacadas até que a orientação desejada seja obtida. Os pesquisadores também costumam usar concentrações ligeiramente mais baixas de anticorpos usando o método de flutuação livre e, como as incubações são realizadas em tubos de microcentrífuga, os anticorpos podem ser facilmente coletados e preservados com azida de sódio para reutilização (ver Etapa 5.1). Outra vantagem é que as seções podem ser armazenadas diretamente a -80 °C em pequenos tubos de microcentrífuga com solução crioprotetora32, minimizando assim o espaço de armazenamento e maximizando a longevidade das amostras33. Uma desvantagem de usar essa técnica é que as seções são muito manuseadas e, portanto, estão aptas a danos. Isso, no entanto, pode ser mitigado usando baixas velocidades de agitação e rotação, bem como treinando adequadamente os pesquisadores sobre como transferir as amostras e montar as seções nos slides.
Em conjunto, o IHC é uma ferramenta estabelecida e essencial para visualizar e localizar a expressão de proteínas nos campos de pesquisa clínica e biomédica. A IHC flutuante livre é um método eficiente, flexível e econômico, especialmente na realização de estudos histológicos em larga escala. Aqui, apresentamos um protocolo confiável de IHC fluorescente flutuante livre para a comunidade científica que pode ser adaptado de acordo com a IHC cromogênica e outras colorações, como hematoxilina e eosina ou coloração violeta cresil.
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Protocol
1. Preparação de tecidos para criosecção
- Incorpore tecidos fixos em um molde de incorporação apropriado (ver Tabela de Materiais) para criar um bloco de amostra usando uma matriz de amostra apropriada (ver Tabela de Materiais) e congelar em gelo seco. Conservar os blocos de amostras a -80 °C até estarem prontos para a secção.
NOTA: Os tecidos fixos são tipicamente preparados por perfusão de roedores adultos (aprox. 2,5 – 30 meses de idade) machos ou fêmeas (ratinho ou rato)34, de acordo com a autorização ética disponível, com um fixador adequado (por exemplo, formalina a 10%), seguido de tecidos pós-fixação no mesmo fixador durante 12 h a 4 °C, lavando os tecidos três vezes com 1x PBS, e colocar os tecidos em 15% e depois em 30% de sacarose em 1x PBS durante a noite ou até que os tecidos afundem35. Os pesquisadores podem tentar adaptar esse protocolo geral a diferentes estágios de desenvolvimento.
2. Criosecção
- Quando estiver pronto para a secção, aclimatete as amostras no criostato por pelo menos 1-2 h antes da secção para evitar a quebra do tecido.
- Usando um criostato, corte o tecido em seções (20-50 μm) e colete em inserções de 6 ou 12 poços (ver Tabela de Materiais) preenchidas com 1x solução de PBS.
NOTA: Dependendo da espessura da seção, da quantidade de tecido a ser coletado e do número de inserções de poço usadas, cada poço conterá um número variável de seções que vão de aproximadamente 10 a 40 fatias para poço. Por exemplo, se um cérebro inteiro é seccionado a 40 μm, aproximadamente 18-24 seções serão coletadas em cada poço usando inserções de 12 poços. Além disso, seções de 20 μm podem ser um pouco difíceis de manusear, portanto, 40 μm são recomendados para coloração em massa (ver Discussão).
3. Armazenando seções
- Uma vez recolhidas, lave as seções com PBS 1x recém-preparado por 5 min. Repita 3 vezes.
- Transfira as seções para tubos de microcentrífuga de 2 mL preenchidos com 1-1,5 mL de solução de armazenamento (para 250 mL, misture 70 g de sacarose, 75 mL de etilenoglicol e leve ao volume com tampão fosfato 0,1 M).
- Conservar a -80 °C até estarem prontos para a coloração.
4. Manchando o Dia I
- Retire as amostras do congelador e equilibre-se à temperatura ambiente (RT) durante 10 - 20 min.
- Despeje seções em uma inserção de poço em uma placa de 6 poços para separar a solução de armazenamento das seções.
- Mova a inserção do poço para outro poço contendo aproximadamente 6 mL de 1x TBS. Lave 3 vezes com 1x TBS por 5 min cada em um agitador orbital usando baixa velocidade em RT.
- Enquanto as seções estão lavando, prepare 7 mL (por amostra) de uma solução de bloqueio-permeabilizante consistindo de 1x TBS com 0,3% de Triton X-100 e 3% de soro normal (por exemplo, soro de cavalo normal). Seções de bloco por 30 min em RT no agitador orbital, usando baixa velocidade.
NOTA: O bloqueio com soros impede a ligação inespecífica de anticorpos ao tecido ou a receptores FC não específicos – recomenda-se um soro correspondente às espécies do anticorpo secundário, mas, se não estiver disponível, qualquer soro normal de uma espécie diferente do animal hospedeiro de anticorpos primários pode ser usado. O detergente Triton X-100 permite uma melhor penetração de anticorpos através da permeabilização do tecido. - Preparar 1 ml por amostra de solução de anticorpos primários que consista em anticorpos primários selecionados (diluídos adequadamente) em 1x TBS com Triton X-100 a 0,3% e 1% de soro normal (ver Passo 4.4 Nota). Seções de transferência do poço inseridas em um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo solução de anticorpos primários para se ligar ao(s) antígeno(s) de interesse.
NOTA: Múltiplos anticorpos primários podem ser usados (gerados em diferentes espécies hospedeiras). - Coloque um tubo de microcentrífuga de 2 mL com seções em um misturador rotativo usando baixa velocidade (por exemplo, velocidade 7 rpm) e incube durante a noite por 12-16 h a 4 °C.
5. Manchar o Dia II
- No dia seguinte, despeje seções em um poço inserido em uma placa de 6 poços para separar as seções da solução primária de anticorpos.
NOTA: A solução de anticorpos pode ser recolhida e reutilizada; adicionar 0,02% (p/v) de azida de sódio para inibir o crescimento microbiano. - Lavar as secções 3 vezes com 1x TBS no RT (30 s para as primeiras 2 lavagens e 10 min para a lavagem final).
- Preparar 1 ml por amostra de solução de anticorpos secundários que consista em anticorpo secundário apropriado (diluído em conformidade) em 1x TBS com Triton X-100 a 0,3% e soro normal a 1% (solução de escudo da luz).
NOTA: A marcação indireta com um anticorpo secundário conjugado amplifica o sinal e permite a visualização colorimétrica ou fluorescente do alvo da proteína. - Transfira as seções para um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo solução de anticorpos secundários. Incubar por 2 h em RT em agitador orbital usando baixa velocidade (solução de escudo da luz).
- Despeje seções em uma inserção de poço em uma placa de 6 poços para separar as seções da solução secundária de anticorpos.
- Continuando a proteger as amostras da luz, lave 2 vezes com 1x TBS por 30 s no RT. Em seguida, lave por 15 min em 1x TBS, adicione DAPI (1-0,1 μg / ml), se desejar.
6. Montagem
- Despeje seções em uma câmara histológica retangular de vidro preenchida três quartos com 1x TBS.
- Submerja um slide de vidro no 1x TBS e use um pincel fino para persuadir as seções em direção ao slide.
- Toque suavemente nas seções no slide, certificando-se de que não haja rugas ou dobras.
- Repita até que todas as seções sejam montadas no(s) slide(s).
NOTA: Quando um cérebro inteiro, por exemplo, é seccionado a 40 μm, coletado em inserções de 12 poços com uma alíquota contendo 18-24 seções; fatias são normalmente montadas em 1-2 slides, mas menos seções também podem ser montadas por slide, dependendo da preferência do pesquisador.
7. Deslizamento da tampa
- Depois que as seções forem secas na(s) lâmina(s), cerca de 10-15 minutos no RT ou até que as seções pareçam opacas (lembre-se de proteger as lâminas da luz), aplique um meio de montagem aquoso apropriado (endurecimento ou não endurecimento). O antidesbotamento é preferido se estiver usando um anticorpo secundário conjugado fluorescente.
NOTA: A qualidade de fluorescência pode ser menor ao usar um meio de montagem de endurecimento, mas as lâminas devem durar mais tempo. - Usando uma pinça, coloque uma tampa em cima do meio. Cubra com papel de filtro e pressione firmemente para remover o excesso de meio de montagem.
NOTA: Se estiver usando um suporte sem endurecimento, pinte as bordas da tampa deslizante com esmalte de unhas transparente para selar. - Seções de imagem usando um microscópio apropriado. Conservar numa caixa de deslizamento escura a 4 °C.
NOTA: As seções podem ser fotografadas usando uma variedade de microscópios, como varredura a laser confocal e fluorescência de campo largo invertida ou vertical, em ampliações (por exemplo, 10x, 20x, 40x) com base nas necessidades do pesquisador.
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Representative Results
O esquema geral do uso do método de flutuação livre para realizar um ensaio imuno-histoquímico fluorescente é ilustrado na Figura 1. Um exemplo representativo de IHC fluorescente usando o método de flutuação livre no cérebro de camundongos examinando a expressão da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) é mostrado na Figura 2 em ampliação mais baixa e maior para ilustrar a qualidade geral da coloração. Essa abordagem também é apropriada para revelar proteínas de baixa expressão, com um exemplo de um cérebro de camundongo transgênico de baixa expressão de GFP mostrado na Figura 3. O método de flutuação livre também pode ser usado em outros protocolos de coloração histoquímica, como o violeta cresil, como mostrado na Figura 4, seguindo as Etapas 1 a 4.3 do protocolo e, em seguida, montando as seções conforme indicado na Etapa 6. Depois disso, as seções podem ser processadas usando qualquer coloração que exija seções montadas em slides. Ao usar esse protocolo para IHC cromogênica, siga o protocolo das etapas 1 a 5.6 (não adicione DAPI à última lavagem), ajustando de acordo se estiver usando uma etapa de amplificação (por exemplo, complexo avidina-biotina). Substitua o tampão por um reagente cromagênio/substrato, incubando 5-20 min até que o tecido fique com a cor desejada. A reação pode ser monitorada verificando o tecido periodicamente com um microscópio de baixa potência. Termine a reação movendo a inserção do poço com as seções para um tampão fresco, lavando-as três vezes, pelo menos 5 min cada. Prossiga com a Etapa 6 para montar as seções em lâminas de vidro, permitindo que as seções sequem em um aquecedor de lâminas por pelo menos 3-4 h. Desidratar as lâminas com concentrações crescentes de etanol (ou seja, 70%, 90%, 95%, 99,5%, 2-5 min cada) seguidas de xileno (5-10 min) e, em seguida, cobrir com um meio de montagem dura (por exemplo, Entellan), permitindo que as lâminas sequem pelo menos 1-2 h em uma área ventilada. Se o fundo for muito alto, extingua a atividade endógena da peroxidase por 15 min no RT com 3% H2 O2 em 1x TBS seguido de três lavagens tampão, 15-20 min cada, antes do bloqueio (Passo 4.4). Vários tecidos periféricos também são passíveis de uso dessa técnica sem a necessidade de modificações no protocolo, com um exemplo de cortes hepáticos de um camundongo expressando GFP mostrado na Figura 5.
Figura 1: Fluxograma do ensaio imuno-histoquímico fluorescente flutuante. Dissecar o órgão de interesse (de preferência tecido fixo) e incorporar o tecido em moldes de incorporação (ver Tabela de Materiais) utilizando uma matriz de amostra (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, congelar no gelo seco e armazenar a -80 °C. Separe o tecido usando um criostato a 20-50 μm e colete fatias em inserções de poços (ver Tabela de Materiais) preenchidas com 1x PBS. Usando um agitador orbital em baixa velocidade, lave as seções 3x por 5 min cada em 1x PBS. Neste ponto, armazene seções extras no buffer de armazenamento a -80 °C até que seja necessário. Lave as seções restantes 3x por 5 min com 1x TBS. Seções de bloco por 30 min em agitação RT em baixa velocidade. Preparar a solução primária de anticorpos e incubar secções durante a noite em tubo(s) de microcentrífuga a 4 °C (12-14 h). No dia seguinte, lave as seções com 1x TBS 3x, as duas primeiras lavagens por 30 s, com a terceira lavagem por 10 min. Incubar seções em solução secundária de anticorpos em tubo(s) de microcentrífuga por 2h no RT, certificando-se de proteger as seções da luz, quando possível, a partir deste passo adiante. Em seguida, lave 3x com 1x TBS, as duas primeiras lavagens por 30 s e a terceira lavagem por 15 min. Adicione DAPI à última lavagem, se desejado e se não estiver presente no meio de montagem. Despeje seções em uma caixa de câmara, três quartos cheia de 1x TBS, e use um pincel para aderir seções na(s) lâmina(s). Deixe as corrediças secarem (~10-15 min) antes de cobrir o deslizamento com o meio de montagem de escolha. Seções de imagem usando um microscópio apropriado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imuno-histoquímica fluorescente utilizando cortes cerebrais flutuantes. As regiões cerebrais do hipocampo que examinam a expressão de GFAP em camundongos adultos são mostradas e marcadas usando um anticorpo primário anti-GFAP criado em coelho e um anticorpo secundário anti-coelho Alexa568 criado em burro. O DAPI foi utilizado na última lavagem para a marcação dos núcleos. O tecido foi seccionado a 40 μm com criostato. As imagens foram obtidas com ampliação de 10x (superior) e 40x (inferior) utilizando microscópio confocal de varredura por ponto laser. Barra de escala de imagem de 10x = 400 μm. Barra de escala de imagem de 40x = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imuno-histoquímica fluorescente em proteínas de baixa expressão utilizando o método de flutuação livre. Regiões cerebrais do hipocampo de um rato adulto transgênico com baixa expressão de GFP são mostradas. Os neurônios que expressam GFP foram marcados usando um anticorpo primário anti-GFP criado em cabra e um anticorpo secundário anti-cabra Alexa488 criado em burro. O DAPI foi utilizado na última lavagem para a marcação dos núcleos. O tecido foi seccionado a 40 μm com criostato. As imagens foram obtidas com ampliação de 40x utilizando microscópio confocal de varredura por ponto laser. Barra de escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Coloração violeta cresil usando seções cerebrais flutuantes. Usando um criostato, seções de 40 μm do bulbo olfatório de camundongo adulto ao cerebelo foram coletadas, lavadas, montadas em lâminas, coradas com violeta cresil e cobertas. As imagens foram obtidas com ampliação de 10x utilizando microscópio de campo largo invertido. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imuno-histoquímica fluorescente utilizando cortes hepáticos flutuantes. São apresentadas secções de fígado tomadas a 40 μm utilizando um criostato de um rato adulto transgénico que expresse baixos níveis de GFP. Um anticorpo primário anti-GFP criado em cabra com um anticorpo secundário anti-cabra Alexa488 criado em burro foi usado para marcar células que expressam GFP. DAPI foi adicionado à última lavagem para rotular núcleos. As imagens foram coletadas em microscópio confocal de varredura a laser com ampliação de 40x. Barra de escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A imuno-histoquímica (IHC) é uma técnica versátil que se tornou crucial na identificação da expressão e localização de proteínas dentro de seções de tecidos. Este ensaio é usado em toda a comunidade científica para entender melhor as características do tecido em todos os estágios da função normal para os estados de doença. A IHC é empregada em uma variedade de campos, desde o diagnóstico clínico de doenças como o câncer até as descobertas iniciais em pesquisas pré-clínicas10,36.
A técnica mais comumente usada para executar IHC é o método montado em slide no qual as seções são imediatamente aderidas ao slide após serem fatiadas. Algumas vantagens de usar essa técnica é que os pesquisadores podem lidar com seções muito finas necessárias para estudos de colocalização de proteínas e usar pouca solução para manchar as seções por lâmina. Os anticorpos são muitas vezes caros; portanto, essa abordagem pode ser uma opção econômica se poucas seções forem processadas. Este também é o método de escolha para pesquisadores que usam espécimes frescos congelados, porque o manuseio do tecido é mínimo, portanto, a integridade estrutural do tecido será protegida. O uso da abordagem montada em lâmina também seria apropriado se apenas algumas seções fossem coletadas e imediatamente coradas, como é o caso da patologia clínica. Por outro lado, existem algumas desvantagens, como apenas o lado exposto do tecido é acessado durante a coloração, limitando assim a espessura da seção devido à fraca penetração de anticorpos e lavagem eficaz. Outra desvantagem é que, uma vez que o tecido é seccionado e coletado em lâminas, o IHC normalmente deve ser concluído rapidamente, com o armazenamento de lâminas não processadas ocupando muito espaço no freezer. Além disso, ao processar experimentos maiores (por exemplo, várias regiões do cérebro com níveis múltiplos e representativos a serem corados), essa abordagem pode realmente usar mais reagentes, ser bastante demorada e muitas vezes limitar o número de lâminas a serem processadas por experimento.
Algumas limitações associadas ao método de montagem deslizante podem ser superadas pela técnica de coloração flutuante que se tornou uma alternativa cada vez mais popular ao trabalhar com seções mais espessas. Embora esse método não seja uma abordagem nova, em nossa experiência, tem sido uma abordagem confiável, reprodutível e flexível, especialmente para a coloração de amostras de tecido a granel, permitindo assim o processamento de estudos em maior escala de maneira eficiente. Os pesquisadores também podem efetivamente executar vários e grandes experimentos IHC ao mesmo tempo com esse método. Além disso, as amostras são coradas em suspensão, de modo que as soluções podem penetrar nas seções de todos os ângulos, particularmente importante para seções mais espessas, muitas vezes levando a uma coloração de maior qualidade (Figura 2, Figura 3 e Figura 5). Seções flutuantes podem ser cortadas em qualquer lugar de 20-50 μm de espessura37, com seções mais espessas úteis para os pesquisadores verem estruturas ou células em diferentes planícies de visão. Por exemplo, no tecido cerebral, seções mais espessas permitem que os pesquisadores vejam a estrutura de dendritos e axônios em todas as suas amostras. A capacidade de coletar fatias mais finas (20 μm) amplia ainda mais o espectro de aplicações; no entanto, fatias mais finas podem ser difíceis de manusear e muitas vezes exigem mais tempo e esforço para minimizar os danos, portanto, as seções não devem ser mais finas do que 40 μm para coloração a granel. Um dos principais benefícios do método de flutuação livre é que os pesquisadores podem rapidamente seccionar cérebros inteiros (ou outros tecidos), coletando todas as seções em pequenos tubos com cada alíquota tendo uma fatia representativa para todas as diferentes regiões do cérebro, permitindo assim que os pesquisadores manchem rapidamente todo o cérebro. Tubos contendo fatias podem ser armazenados em crioprotetor a -80 °C por vários anos33, com alíquotas não ocupando muito espaço no freezer, permitindo efetivamente que os pesquisadores gerem uma "biblioteca de tecidos". Este método também reduz a quantidade de materiais desperdiçados, incluindo lâminas, coberturas e, especialmente, anticorpos, que podem ser facilmente recuperados e preservados para reutilização, bem como tecidos animais preciosos, uma vez que as seções podem ser armazenadas e salvas pelo tempo que os usuários escolherem.
A abordagem de flutuação livre e o protocolo aqui apresentado também dão aos pesquisadores a opção de modificar facilmente o protocolo ou redirecionar recursos. Por exemplo, os cortes coletados podem ser utilizados para muitas colorações histoquímicas diferentes, além da imunofluorescência com modificações simples do protocolo, como IHC cromogênica, hematoxilina e eosina (H&E), violeta cresil (Figura 4) e RNAscope38. A IHC cromogênica permite a visualização da expressão de antígenos quando um substrato solúvel é convertido por uma enzima conjugada a um anticorpo secundário a um produto cromogênico insolúvel. As duas enzimas mais comumente utilizadas são a peroxidase de rábano (HRP), que converte a diaminobenzidina 3,3' (DAB) em um produto final marrom escuro, e a fosfatase alcalina (AP), que converte o substrato 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) em um produto vermelho39. Realizamos rotineiramente a coloração violeta cresil e usamos seções flutuantes para examinar a organização e a morfologia do cérebro grosso40. Também aplicamos com sucesso esse protocolo a muitos tecidos diferentes, incluindo cérebro, fígado, coração, rim e baço (Figura 5). Outros pesquisadores também utilizaram com sucesso essa técnica para tecidos periféricos, incluindo fígado, rim e ovário22,23,24.
Uma grande preocupação ao usar a técnica de flutuação livre é o potencial de danos estruturais às seções de tecido, especialmente às fatias cerebrais, porque ao longo do protocolo, as amostras estão em agitadores e rotadores durante quase todas as etapas para garantir que sejam uniformemente lavadas, bloqueadas e manchadas. Ocasionalmente, regiões específicas do cérebro podem se desprender, especialmente nos níveis cerebelares; no entanto, o uso de um atlas cerebral e uma forma de ampliação, como a lâmpada de um joalheiro, durante o processo de montagem pode ser útil para juntar seções. Esse desafio geralmente pode ser evitado através do manuseio suave das amostras e mantendo as máquinas rotativas na configuração correta e baixa.
Em conclusão, apresentamos uma técnica de IHC flutuante livre estabelecida que provou ser uma modalidade indispensável, confiável, flexível e eficiente que usamos regularmente para visualizar a expressão e localização de proteínas, bem como a estrutura tecidual em uma variedade de tecidos. O protocolo aqui pode ser facilmente modificado para atender às necessidades individuais de pesquisa, tornando-o valioso para a comunidade científica.
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Disclosures
Nada a divulgar
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Instituto Nacional de Envelhecimento (K99/R00 AG055683 a JMR), ao Instituto George e Anne Ryan de Neurociência (EP, GC, JMR), à Faculdade de Farmácia da Universidade de Rhode Island (EP, GC, JMR) e a Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Agradecemos à doutoranda Rebecca Senft, treinando com a professora Susan Dymecki, Departamento de Genética da Harvard Medical School, por nos apresentar o método de flutuação livre. Algumas imagens usadas na Figura 1 foram obtidas de fontes "livres para usar, compartilhar ou modificar, mesmo comercialmente": tubo de rato e microcentrífuga (Pixabay), cérebro de rato (Jonas Töle, Wikimedia Commons), seção de criostato e cérebro de rato (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), recipiente de vidro (OpenClipart, FreeSvg.org) e microscópio (Theresa Knott, Open Clip Art Library).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3513 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Clear nail polish | User preference | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Embedding molds | Thermo Scientific | 1841 | |
| Ethylene glycol | User preference | N/A | |
| Formalin solution | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco | 26050088 | |
| Microscope slide boxes | Electron Microscopy Services | 71370 | |
| PBS | User preference | N/A | |
| Primary antibody | User preference | N/A | |
| Rectangular Coverslips | VWR | 48393-081 | 24 x 50 mm |
| Rectangular staining dish | Electron Microscopy Services | 70312 | |
| Round artist paintbrush #2 | Princeton Select Series | 3750R | Brand not important |
| Secondary antibody | User preference | N/A | |
| Specimen matrix for embedding | OCT Tissue-Tek, Sakura | 4583 | |
| Stain tray – slide staining system | Electron Microscopy Services | 71396-B | Use dark lid |
| Sucrose | User preference | N/A | |
| Superfrost Plus Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| TBS | User preference | N/A | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Non-hardening |
| Well inserts for 12-well plates | Corning Netwells | 3477 | |
| Well inserts for 6-well plates | Corning Netwells | 3479 | |
| Whatman filter paper | Millapore-Sigma | WHA1440042 |
References
- Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
- Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374 (1999).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Hermersdörfer, H. Immunocytochemistry. A Practical Approach. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).
- Schacht, V., Kern, J. S.
- Coons, A. H.
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Li, A., Yang, D. H.
- Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
- Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
- Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- van der Loos, C.
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
- Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
- Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
- Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
- Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
- Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
- Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
- Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
- Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
- Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
- Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
- Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
- Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
- Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
- Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
- Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
- Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
- Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , Springer. 207-262 (1981).
- Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).
