Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Histologische kleuringen met behulp van vrij zwevende weefselsecties

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61622
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1George & Anne Ryan Institute for Neuroscience, College of Pharmacy, Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, University of Rhode Island, 2Department of Neuroscience, Biomedicum, Karolinska Institutet

Summary

De vrij zwevende techniek stelt onderzoekers in staat om histologische kleuringen uit te voeren, waaronder immunohistochemie op vaste weefselsecties om biologische structuren, celtype en eiwitexpressie en lokalisatie te visualiseren. Dit is een efficiënte en betrouwbare histochemische techniek die nuttig kan zijn voor het onderzoeken van een groot aantal weefsels, zoals hersenen, hart en lever.

Abstract

Immunohistochemie is een veelgebruikte techniek om specifieke weefselstructuren te visualiseren, evenals eiwitexpressie en lokalisatie. Twee alternatieve benaderingen worden veel gebruikt om de weefselsecties tijdens de kleuringsprocedure te behandelen, één benadering bestaat uit het rechtstreeks op glasplaten monteren van de secties, terwijl een tweede benadering, de vrij zwevende, het mogelijk maakt om vaste secties te behouden en te kleuren terwijl ze in oplossing worden opgehangen. Hoewel op dia's gemonteerde en vrij zwevende benaderingen vergelijkbare resultaten kunnen opleveren, zorgt de vrij zwevende techniek voor een betere penetratie van antilichamen en zou dus de voorkeursmethode moeten zijn wanneer dikkere secties moeten worden gebruikt voor 3D-reconstructie van de weefsels, bijvoorbeeld wanneer de focus van het experiment ligt op het verkrijgen van informatie over dendritische en axonale projecties in hersengebieden. Bovendien, omdat de secties in oplossing worden gehouden, kan een enkele aliquot gemakkelijk 30 tot 40 secties herbergen, waarvan de behandeling minder bewerkelijk is, vooral in grootschalige biomedische studies. Hier illustreren we hoe de vrij zwevende methode kan worden toegepast op fluorescerende immunohistochemische kleuring, met een grote focus op hersensecties. We zullen ook bespreken hoe de vrij zwevende techniek gemakkelijk kan worden aangepast aan de individuele behoeften van onderzoekers en kan worden aangepast aan andere weefsels en andere op histochemische basis gebaseerde kleuringen, zoals hematoxyline en eosine en cresylviolet, zolang weefselmonsters correct zijn gefixeerd, meestal met paraformaldehyde of formaline.

Introduction

Immunostaining is een populaire onderzoekspraktijk die 130 jaar geleden begon met de ontdekking van serumantistoffen in 1890 door Von Behring1. In het begin van de20e eeuw werden kleurstoffen gehecht aan antigenen en later aan antilichamen als een manier om reacties te kwantificeren en te visualiseren1, en in 1941 ontwikkelde Albert Coons de eerste fluorescerende antilichaamlabels, een ontdekking die een revolutie teweegbracht in lichtmicroscopie 2,3. De term "immunostaining" omvat vele technieken die zijn ontwikkeld met behulp van dit principe, waaronder Western blot, flowcytometrie, ELISA, immunocytochemie en immunohistochemie 3,4. Western blot detecteert de aanwezigheid van specifieke eiwitten uit weefsel- of celextracten5. Eiwitten worden gescheiden op grootte met behulp van gel-elektroforese, overgebracht naar een membraan en onderzocht met behulp van antilichamen. Deze techniek geeft de aanwezigheid van eiwit aan en hoeveel eiwit er aanwezig is; het onthult echter geen informatie over de lokalisatie van het eiwit in cellen of weefsels. Een andere methode, immunocytochemie (ICC), labelt eiwitten in cellen, meestal cellen die in vitro worden gekweekt. ICC toont zowel eiwitexpressie als lokalisatie binnen cellulaire compartimenten6. Om een specifiek eiwit op weefselniveau te detecteren en te visualiseren, wordt immunohistochemie (IHC) gebruikt.

IHC is een methode die onderzoekers gebruiken om specifieke antigenen in weefsel aan te pakken, gebruikmakend van chemische eigenschappen van het immuunsysteem 7,8. Door specifieke primaire en secundaire antilichamen te genereren die verband houden met een enzym of een fluorescerende kleurstof, kunnen antigenen van belang worden gelabeld en onthuld in de meeste weefsels (zoals besproken in Mepham en Britten)9. De term "immunohistochemie" op zichzelf specificeert niet de etiketteringsmethode die wordt gebruikt om het antigeen van belang te onthullen; deze terminologie wordt dus vaak gecombineerd met de detectietechniek om de etiketteringsmethode duidelijk af te bakenen: chromogene immunohistochemie (CIH) om aan te geven wanneer het secundaire antilichaam is geconjugeerd aan een enzym, zoals peroxidase; of fluorescerend IHC om aan te geven wanneer het secundaire antilichaam is geconjugeerd aan een fluorofoor, zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) of tetramethylrhodamine (TRITC). De selectiviteit van IHC stelt clinici en onderzoekers in staat om eiwitexpressie en -distributie door weefsels te visualiseren, over verschillende gezondheidstoestanden en ziekte10. In het klinische domein wordt IHC vaak gebruikt om kanker te diagnosticeren, evenals om verschillen in verschillende soorten kanker te bepalen. IHC is ook gebruikt om verschillende soorten microbiële infecties in het lichaam te bevestigen, zoals Hepatitis B of C11. In biomedisch onderzoek wordt IHC vaak gebruikt om eiwitexpressie in weefsels in kaart te brengen en is het belangrijk bij het identificeren van abnormale eiwitten die worden gezien in ziektetoestanden. Neurodegeneratie gaat bijvoorbeeld vaak gepaard met accumulatie van abnormale eiwitten in de hersenen, zoals Αβ-plaques en neurofibrillaire klitten bij de ziekte van Alzheimer. Diermodellen worden dan vaak ontwikkeld om deze pathologische toestanden na te bootsen, en IHC is een methode die onderzoekers gebruiken om de eiwitten van belang te lokaliseren en te kwantificeren 10,12,13. Op onze beurt kunnen we meer te weten komen over de oorzaken van deze ziekten en de complicaties die ermee gepaard gaan.

Er zijn veel stappen betrokken bij het uitvoeren van IHC. Eerst wordt het weefsel van belang verzameld en voorbereid voor kleuring. Aantoonbaar bereiden de meeste onderzoekers vaste weefselmonsters voor, waarbij de perfusie van het fixatief via de bloedsomloop optimaal is omdat het morfologie behoudt 14,15. Postfixatie van weefselmonsters kan ook worden gebruikt, maar kan minder dan ideale resultaten opleveren16. Crosslinking fixatieven, zoals formaldehyde, werken door chemische bindingen te creëren tussen eiwitten in het weefsel17. Vast weefsel wordt vervolgens in zeer dunne lagen of secties gesneden met behulp van een microtoom, waarbij veel onderzoekers er de voorkeur aan geven bevroren secties te verzamelen met behulp van een cryostaat. Van daaruit wordt het weefsel verzameld en ofwel rechtstreeks op een microscoopglaasje gemonteerd (slide-mounted methode), ofwel gesuspendeerd in een oplossing (free-floating methode), zoals fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)18. De gebruikte verzamelmethode is vooraf bepaald op basis van de behoeften van de onderzoeker, waarbij elk van deze twee methoden zijn eigen voor- en nadelen heeft.

De slide-mounted methode is veruit de meest gebruikte, met als belangrijk voordeel dat zeer dunne secties (10-14 μm) kunnen worden bereid, wat bijvoorbeeld belangrijk is om eiwit-eiwitinteracties te onderzoeken. Er is ook een minimale behandeling van het monster, wat potentiële schade aan de structurele integriteit van het weefsel vermindert19. Onderzoekers gebruiken deze techniek vaak met vers ingevroren weefsel (weefsel dat onmiddellijk wordt ingevroren met behulp van droogijs, isopentane, enz.), Dat zeer delicaat is in vergelijking met vast weefsel en veel zorg moet worden genomen om ontdooiing van het monster te voorkomen. Een ander voordeel van het gebruik van op dia's gemonteerde secties is dat grote hoeveelheden oplossingen voor vlekken meestal niet nodig zijn4. Onderzoekers kunnen dus een kleinere hoeveelheid dure antilichamen of andere chemicaliën gebruiken om de vlek te voltooien. Bovendien is het mogelijk om secties van verschillende experimentele groepen op dezelfde dia te monteren, wat voordelig kan zijn, vooral tijdens beeldacquisitie. Aan de andere kant zijn er enkele nadelen van het gebruik van op dia's gemonteerde secties, met name dat het weefselgedeelte aan de dia wordt gehecht, waardoor de penetratie van antilichamen aan één kant van de sectie wordt beperkt, wat de sectiedikte en de 3D-weergave van het weefsel beperkt. Het kan ook gebeuren dat tijdens het wassen de randen van het weefsel en hele secties los kunnen komen van de dia, waardoor het hele experiment nutteloos wordt. Bovendien moet IHC meestal relatief snel worden uitgevoerd bij gebruik van de op glijden gemonteerde benadering om degradatie van het antigeenepithop20,21 te voorkomen, waarbij onbewerkte dia's meestal worden opgeslagen bij -20 of -80 °C, vaak bedekt en horizontaal of in schuifdozen worden opgeslagen, wat resulteert in een relatief grote opslagvoetafdruk. Ten slotte kan de op dia's gemonteerde techniek ook tijdrovend zijn als onderzoekers grote aantallen dia's moeten verwerken om grote aantallen weefselsecties te verwerken.

Vanwege enkele van deze uitdagingen met behulp van de op dia's gemonteerde methode, is een wijziging genaamd de free-floating-methode een populair alternatief geworden. Deze techniek kwam in de literatuur in de jaren 1960-70 22,23,24, won aan populariteit in de jaren 1980 25,26,27,28,29, en is nu een gevestigde methode waarbij de vlek op de verzamelde secties in suspensie wordt uitgevoerd in plaats van vast te kleven aan een dia 12,30,31 . De vrij zwevende methode wordt niet aanbevolen wanneer weefselsecties minder dan 20 μm bedragen; in onze ervaring is het echter de benadering van keuze wanneer dikkere (40-50 μm) secties moeten worden gekleurd. Een duidelijk voordeel is dat antilichamen vanuit alle hoeken vrij zwevende secties kunnen binnendringen en minder achtergrondvlekken kunnen genereren als gevolg van effectiever wassen, wat allemaal resulteert in een betere signalering bij beeldvorming. Bovendien worden de secties na verwerking op de dia's gemonteerd, waardoor de mogelijkheid van weefselloslating wordt geëlimineerd en de tijd die de cryostaat in beslag neemt, wordt verkort. De free-floating methode kan ook veel minder arbeidsintensief zijn, vooral voor grootschalige biomedische studies. Het is bijvoorbeeld mogelijk om veel (18-40) secties van hetzelfde monster samen in dezelfde put te kleuren, wat tijd bespaart bij het uitvoeren van zowel de was- als antilichaamincubatiestappen. Bovendien, omdat een groter aantal (12-16) secties per dia kan worden gemonteerd met behulp van deze aanpak, is het vaak handiger en sneller voor de onderzoeker om secties te bekijken en af te beelden. Met name tijdens het monteren van weefselplakken op de dia's kunnen secties worden bevestigd en losgemaakt totdat de gewenste oriëntatie is verkregen. Onderzoekers gebruiken ook vaak iets lagere concentraties antilichamen met behulp van de vrij zwevende methode, en omdat de incubaties worden uitgevoerd in microcentrifugebuizen, kunnen de antilichamen gemakkelijk worden verzameld en bewaard met natriumazide voor hergebruik (zie stap 5.1). Een ander voordeel is dat de secties direct bij -80 °C kunnen worden opgeslagen in kleine microcentrifugebuizen met cryoprotectantoplossing32, waardoor de opslagruimte wordt geminimaliseerd en de levensduur van de monsters wordt gemaximaliseerd33. Een nadeel van het gebruik van deze techniek is dat de secties veel worden behandeld en dus vatbaar zijn voor schade. Dit kan echter worden verzacht door lage schud- en rotatiesnelheden te gebruiken en onderzoekers goed te trainen hoe ze de monsters kunnen overbrengen en de secties op de dia's kunnen monteren.

Alles bij elkaar is IHC een gevestigd, essentieel hulpmiddel voor het visualiseren en lokaliseren van eiwitexpressie in zowel het klinische als het biomedische onderzoek. Free-floating IHC is een efficiënte, flexibele en economische methode, vooral bij het uitvoeren van grootschalige histologische studies. Hier presenteren we een betrouwbaar vrij zwevend fluorescerend IHC-protocol voor de wetenschappelijke gemeenschap dat dienovereenkomstig kan worden aangepast voor chromogene IHC en andere kleuringen zoals hematoxyline en eosine of cresylvioletkleuring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Weefselvoorbereiding voor cryosectie

  1. Integreer vaste weefsels in een geschikte insluitvorm (zie Tabel van Materialen) om een monsterblok te maken met behulp van een geschikte monstermatrix (zie Tabel van Materialen) en vries in op droogijs. Bewaar de blokken van het monster bij -80 °C totdat u klaar bent om te worden doorgesneden.
    OPMERKING: Vaste weefsels worden meestal bereid door volwassen (ca. 2,5 - 30 maanden oud) mannelijke of vrouwelijke knaagdieren (muis of rat) te perfuseren 34, in overeenstemming met de beschikbare ethische vergunning, met een geschikt fixatief (bijv. 10% formaline), gevolgd door postfixatieweefsels in hetzelfde fixatief gedurende 12 uur bij 4 °C, driemaal wassen met 1x PBS, en het plaatsen van weefsels in 15% en vervolgens 30% sucrose in 1x PBS voor een nacht of totdat de weefsels35 zinken. Onderzoekers kunnen proberen dit algemene protocol aan te passen aan verschillende ontwikkelingsstadia.

2. Cryosectie

  1. Wanneer u klaar bent om te sectieren, acclimatiseert u monsters in de cryostaat gedurende ten minste 1-2 uur voorafgaand aan het snijden om verbrijzeling van weefsel te voorkomen.
  2. Snijd met behulp van een cryostaat weefsel in secties (20-50 μm) en verzamel in 6 of 12-well inserts (zie Materiaaltabel) gevuld met 1x PBS-oplossing.
    OPMERKING: Afhankelijk van de sectiedikte, hoeveel weefsel moet worden verzameld en het aantal putinzetstukken dat wordt gebruikt, bevat elke put een variabel aantal secties van ongeveer 10 tot 40 plakjes voor put. Als bijvoorbeeld een volledig brein op 40 μm wordt gesneden, worden ongeveer 18-24 secties in elke put verzameld met behulp van 12-putinzetstukken. Ook kunnen secties van 20 μm enigszins uitdagend zijn om te hanteren, dus 40 μm wordt aanbevolen voor bulkkleuring (zie Discussie).

3. Secties opslaan

  1. Eenmaal verzameld, was de secties met vers bereide 1x PBS gedurende 5 minuten. Herhaal dit 3 keer.
  2. Breng de secties over in 2 ml microcentrifugebuizen gevuld met 1-1,5 ml opslagoplossing (meng voor 250 ml 70 g sucrose, 75 ml ethyleenglycol en breng tot volume met 0,1 M fosfaatbuffer).
  3. Bewaren bij -80 °C totdat het klaar is voor kleuring.

4. Vlekkendag I

  1. Verwijder monsters uit de vriezer en balanceer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 - 20 min.
  2. Giet secties in een putinzetstuk in een 6-wellsplaat om de opslagoplossing van secties te scheiden.
  3. Verplaats de putinzet naar een andere put met ongeveer 6 ml 1x TBS. Was 3 keer met 1x TBS gedurende elk 5 minuten op een orbitale schudder met lage snelheid bij RT.
  4. Bereid tijdens het wassen 7 ml (per monster) van een blokkerende-permeabiliserende oplossing bestaande uit 1x TBS met 0,3% Triton X-100 en 3% normaal serum (bijv. Normaal paardenserum). Blok secties gedurende 30 minuten bij RT op orbitale shaker, met behulp van lage snelheid.
    OPMERKING: Blokkeren met sera voorkomt niet-specifieke binding van antilichamen aan weefsel of niet-specifieke Fc-receptoren - een serum dat overeenkomt met de soort van het secundaire antilichaam wordt aanbevolen, maar indien niet beschikbaar, kan elk normaal serum van een andere soort dan het primaire antilichaamgastdier worden gebruikt. Het wasmiddel Triton X-100 zorgt voor een betere penetratie van antilichamen door het weefsel te permeabiliseren.
  5. Bereid 1 ml per monster van primaire antilichaamoplossing bestaande uit geselecteerd primair antilichaam (op de juiste manier verdund) in 1x TBS met 0,3% Triton X-100 en 1% normaal serum (zie stap 4.4 Opmerking). Breng secties over van putinzet in een microcentrifugebuis van 2 ml met primaire antilichaamoplossing om te binden aan het (de) antigeen (en) van belang.
    OPMERKING: Er kunnen meerdere primaire antilichamen worden gebruikt (gegenereerd in verschillende gastheersoorten).
  6. Plaats 2 ml microcentrifugebuis met secties op een roterende mixer met een lage snelheid (bijv. snelheid 7 rpm) en incubeer 's nachts gedurende 12-16 uur bij 4 °C.

5. Kleuring Dag II

  1. Giet de volgende dag secties in een putinzetstuk in een 6-wellsplaat om secties van de primaire antilichaamoplossing te scheiden.
    OPMERKING: Antilichaamoplossing kan worden verzameld en hergebruikt; voeg 0,02% (w/v) natriumazide toe om de microbiële groei te remmen.
  2. Was secties 3 keer met 1x TBS bij RT (30 s voor de eerste 2 wasbeurten en 10 min voor de laatste wasbeurt).
  3. Bereid 1 ml per monster secundaire antilichaamoplossing bestaande uit geschikt secundair antilichaam (dienovereenkomstig verdund) in 1x TBS met 0,3% Triton X-100 en 1% normaal serum (schildoplossing tegen licht).
    OPMERKING: Indirecte etikettering met een geconjugeerd secundair antilichaam versterkt het signaal en maakt colorimetrische of fluorescerende visualisatie van het eiwitdoel mogelijk.
  4. Breng secties over in een microcentrifugebuis van 2 ml met secundaire antilichaamoplossing. Incubeer gedurende 2 uur bij RT op orbitale schudder met lage snelheid (beschermoplossing tegen licht).
  5. Giet secties in een putinzetstuk in een 6-wellsplaat om secties te scheiden van secundaire antilichaamoplossing.
  6. Blijf monsters afschermen van licht, was 2 keer met 1x TBS gedurende 30 s op RT. Daarna 15 min wassen in 1x TBS, indien gewenst DAPI (1-0,1 μg/ml) toevoegen.

6. Montage

  1. Giet secties in een glazen, rechthoekige histologische kamer gevuld met driekwart gevuld met 1x TBS.
  2. Dompel een glazen glijbaan onder in de 1x TBS en gebruik een fijne kwast om de secties naar de glijbaan te leiden.
  3. Tik de secties voorzichtig op de dia en zorg ervoor dat er geen rimpels of plooien zijn.
  4. Herhaal dit totdat alle secties op de dia('s) zijn gemonteerd.
    OPMERKING: Wanneer een volledig brein bijvoorbeeld wordt gesneden op 40 μm, verzameld in 12-well inserts met één aliquot met 18-24 secties; segmenten worden meestal op 1-2 dia's gemonteerd, maar er kunnen ook minder secties per dia worden gemonteerd, afhankelijk van de voorkeur van de onderzoeker.

7. Coverslipping

  1. Nadat secties op de dia('s) zijn gedroogd, ongeveer 10-15 minuten bij RT of totdat secties er ondoorzichtig uitzien (vergeet niet om dia's tegen licht af te schermen), breng je een geschikt waterig montagemedium aan (verhardend of niet-verhardend). Antifading heeft de voorkeur bij gebruik van een fluorescerend geconjugeerd secundair antilichaam.
    OPMERKING: De fluorescentiekwaliteit kan minder zijn bij gebruik van een verhardingsmedium, maar dia's moeten langer meegaan.
  2. Plaats met een pincet een coverslip op het medium. Dek af met filtreerpapier en druk stevig aan om overtollig montagemedium te verwijderen.
    OPMERKING: Als u een niet-verhardende houder gebruikt, verft u de randen van de afgedekte dia met heldere nagellak om af te dichten.
  3. Beeldsecties met behulp van een geschikte microscoop. Bewaren in een donkere schuifdoos bij 4 °C.
    OPMERKING: Secties kunnen worden afgebeeld met behulp van verschillende microscopen, zoals laserscanning confocale en omgekeerde of rechtopstaande widefield fluorescentie, bij vergrotingen (bijv. 10x, 20x, 40x) op basis van de behoeften van de onderzoeker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het algemene schema van het gebruik van de vrij zwevende methode om een fluorescerende immunohistochemische test uit te voeren, wordt geïllustreerd in figuur 1. Representatief voorbeeld van fluorescerende IHC met behulp van de vrij zwevende methode in muizenhersenen die gliale fibrillaire zure eiwitexpressie (GFAP) onderzoeken, wordt weergegeven in figuur 2 bij zowel lagere als hogere vergroting om de algehele kwaliteit van de kleuring te illustreren. Deze aanpak is ook geschikt voor het onthullen van laagexpressie-eiwitten, met een voorbeeld van een GFP laag tot expressie brengend transgeen muizenbrein in figuur 3. De vrij zwevende methode kan ook worden gebruikt in andere histochemische kleuringsprotocollen, zoals cresylviolet, zoals weergegeven in figuur 4, door de stappen 1 tot en met 4.3 van het protocol te volgen en vervolgens de secties te monteren zoals aangegeven in stap 6. Daarna kunnen secties worden verwerkt met behulp van vlekken die op schuiven gemonteerde secties vereisen. Wanneer u dit protocol gebruikt voor chromogene IHC, volgt u het protocol van stap 1 tot en met 5.6 (voeg geen DAPI toe aan de laatste wasbeurt), en pas u dienovereenkomstig aan als u een versterkingsstap gebruikt (bijv. Avidin-biotinecomplex). Vervang de buffer door chromageen/substraatreagens en broed 5-20 minuten totdat het weefsel de gewenste kleur krijgt. De reactie kan worden gecontroleerd door het weefsel periodiek te controleren met een microscoop met laag vermogen. Beëindig de reactie door het putinzetstuk met de secties naar een verse buffer te verplaatsen en ze drie keer te wassen, elk minstens 5 minuten. Ga verder met stap 6 om de secties op glazen dia's te monteren, zodat de secties minstens 3-4 uur op een schuifwarmer kunnen drogen. Droog de dia's uit met toenemende ethanolconcentraties (d.w.z. 70%, 90%, 95%, 99,5%, elk 2-5 minuten), gevolgd door xyleen (5-10 min) en bedekt vervolgens de lip met een hardmontagemedium (bijv. Entellan), waardoor dia's ten minste 1-2 uur in een geventileerde ruimte kunnen drogen. Als de achtergrond te hoog is, dooft u de endogene peroxidaseactiviteit gedurende 15 minuten bij RT met 3% H2O2 in 1x TBS gevolgd door drie bufferwasbeurten, elk 15-20 minuten, voordat u blokkeert (stap 4.4). Verschillende perifere weefsels zijn ook vatbaar voor het gebruik van deze techniek zonder dat wijzigingen van het protocol vereist zijn, met een voorbeeld van leversecties van een GFP-expresserende muis in figuur 5.

Figure 1
Figuur 1: Stroomschema van de vrij zwevende fluorescerende immunohistochemische assay. Ontleed het orgaan van belang (bij voorkeur vast weefsel) en integreer weefsel in in ingebedde mallen (zie Tabel van materialen) met behulp van een monstermatrix (zie Tabel van materialen), en vries vervolgens in op droogijs en bewaar bij -80 °C. Sectie weefsel met behulp van een cryostaat op 20-50 μm en verzamel plakjes in putinzetstukken (zie Materiaaltabel) gevuld met 1x PBS. Gebruik een orbitale shaker op lage snelheid, was secties 3x gedurende 5 minuten elk in 1x PBS. Bewaar op dit punt extra secties in de opslagbuffer bij -80 °C totdat u nodig bent. Was de resterende secties 3x gedurende 5 min met 1x TBS. Bloksecties gedurende 30 minuten bij RT schudden op lage snelheid. Bereid primaire antilichaamoplossing en incubeer secties 's nachts in microcentrifugebuis(en) bij 4 °C (12-14 uur). De volgende dag, wassecties met 1x TBS 3x, eerste twee wasbeurten gedurende 30 s, met de derde was gedurende 10 minuten. Incubeer secties in secundaire antilichaamoplossing in microcentrifugebuis (en) gedurende 2 uur bij RT, waarbij u ervoor zorgt dat secties indien mogelijk worden beschermd tegen licht van deze stap voorwaarts. Was vervolgens 3x met 1x TBS, eerst twee wasbeurten voor 30 s en derde was gedurende 15 minuten. Voeg indien gewenst DAPI toe aan de laatste wasbeurt en indien niet aanwezig in montagemedium. Giet secties in een kamerdoos, driekwart vol met 1x TBS, en gebruik een penseel om secties op de dia('s) te plakken. Laat dia's drogen (~ 10-15 min) voordat u afdekt met montagemedium naar keuze. Beeldsecties met behulp van een geschikte microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Fluorescerende immunohistochemie met behulp van vrij zwevende hersensecties. Hippocampale hersengebieden die GFAP-expressie bij volwassen muizen onderzoeken, worden getoond en werden gelabeld met behulp van een anti-GFAP primair antilichaam dat is opgegroeid bij konijn en een anti-konijn Alexa568 secundair antilichaam dat is opgegroeid bij ezel. DAPI werd in de laatste was gebruikt om kernen te labelen. Weefsel werd gesneden op 40 μm met behulp van een cryostaat. Beelden werden genomen met een vergroting van 10x (boven) en 40x (onder) met behulp van een laserpunt scanning confocale microscoop. 10x beeldschaalbalk = 400 μm. 40x beeldschaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Fluorescerende immunohistochemie op lager tot expressie gebrachte eiwitten met behulp van de vrij zwevende methode. Hippocampale hersengebieden van een laag tot expressie brengende GFP transgene volwassen muis worden getoond. Neuronen die GFP tot expressie brachten, werden gelabeld met behulp van een anti-GFP primair antilichaam dat is grootgebracht in een geit en een anti-geit Alexa488 secundair antilichaam dat is opgegroeid in ezel. DAPI werd in de laatste was gebruikt om kernen te labelen. Weefsel werd gesneden op 40 μm met behulp van een cryostaat. Beelden werden genomen met 40x vergroting met behulp van een laser point scanning confocale microscoop. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Cresyl violet kleuring met behulp van vrij zwevende hersensecties. Met behulp van een cryostaat werden 40 μm-secties van olfactorische bulbus voor volwassen muizen tot cerebellum verzameld, gewassen, op dia's gemonteerd, gekleurd met cresylviolet en bedekt. Beelden werden gemaakt met 10x vergroting met behulp van een omgekeerde widefield microscoop. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Fluorescerende immunohistochemie met behulp van vrij zwevende leversecties. Delen van de lever genomen op 40 μm met behulp van een cryostaat van een transgene volwassen muis die lage niveaus van GFP tot expressie brengt, worden getoond. Een anti-GFP primair antilichaam gekweekt in geit met een anti-geit Alexa488 secundair antilichaam verhoogd in ezel werden gebruikt om cellen te labelen die GFP tot expressie brengen. DAPI werd toegevoegd aan de laatste wasbeurt om kernen te labelen. Beelden werden verzameld met behulp van een laserpunt scanning confocale microscoop bij 40x vergroting. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immunohistochemie (IHC) is een veelzijdige techniek die cruciaal is geworden bij het identificeren van eiwitexpressie en lokalisatie binnen weefselsecties. Deze test wordt in de hele wetenschappelijke gemeenschap gebruikt om de kenmerken van weefsel verder te begrijpen in stadia van normale functie tot ziektetoestanden. IHC wordt op verschillende gebieden ingezet, van klinische diagnose van ziekten zoals kanker tot eerste ontdekkingen in preklinisch onderzoek10,36.

De techniek die het meest wordt gebruikt om IHC uit te voeren, is de op de dia gemonteerde methode waarbij de secties onmiddellijk aan de dia worden gehecht nadat ze zijn gesneden. Enkele voordelen van het gebruik van deze techniek is dat onderzoekers zeer dunne secties kunnen verwerken die nodig zijn voor eiwitcolocalisatiestudies en weinig oplossing gebruiken om de secties per dia te kleuren. Antistoffen zijn vaak duur; daarom kan deze aanpak een economische optie zijn als er weinig secties moeten worden verwerkt. Dit is ook de voorkeursmethode voor onderzoekers die vers ingevroren monsters gebruiken, omdat de behandeling van het weefsel minimaal is, waardoor de structurele integriteit van het weefsel wordt beschermd. Het gebruik van de op dia's gemonteerde benadering zou ook geschikt zijn als slechts enkele secties moeten worden verzameld en onmiddellijk gekleurd, zoals het geval is in de klinische pathologie. Aan de andere kant zijn er enkele nadelen, zoals alleen de blootgestelde kant van het weefsel wordt benaderd tijdens het kleuren, waardoor de sectiedikte wordt beperkt als gevolg van slechte antilichaampenetratie en effectief wassen. Een ander nadeel is dat zodra het weefsel is gesneden en verzameld op dia's, IHC normaal gesproken vrij snel moet worden voltooid met opslag van onbewerkte dia's die veel vriesruimte innemen. Bovendien kan deze aanpak bij het verwerken van grotere experimenten (bijvoorbeeld verschillende hersengebieden met meerdere, representatieve niveaus die moeten worden gekleurd), eigenlijk meer reagentia gebruiken, nogal tijdrovend zijn en vaak het aantal dia's beperken dat per experiment moet worden verwerkt.

Sommige beperkingen in verband met de op dia's gemonteerde methode kunnen worden overwonnen door de vrij zwevende kleuringstechniek die een steeds populairder alternatief is geworden bij het werken met dikkere secties. Hoewel deze methode geen nieuwe benadering is, is het in onze ervaring een betrouwbare, reproduceerbare en flexibele aanpak geweest, vooral voor het in bulk kleuren van weefselmonsters, waardoor de verwerking van grootschalige studies op een efficiënte manier mogelijk is. Onderzoekers kunnen met deze methode ook effectief meerdere, grote IHC-experimenten tegelijkertijd uitvoeren. Bovendien worden monsters gekleurd in suspensie, waardoor de oplossingen vanuit alle hoeken de secties kunnen binnendringen, vooral belangrijk voor dikkere secties, wat vaak leidt tot een vlek van hogere kwaliteit (figuur 2, figuur 3 en figuur 5). Vrij zwevende secties kunnen overal van 20-50 μm in dikte37 worden gesneden, met dikkere secties die nuttig zijn voor onderzoekers om structuren of cellen in verschillende gezichtsvlakten te zien. In hersenweefsel stellen dikkere secties onderzoekers bijvoorbeeld in staat om de structuur van dendrieten en axonen in hun monsters te zien. De mogelijkheid om dunnere plakjes (20 μm) te verzamelen, verbreedt het spectrum van toepassingen nog meer; dunnere plakjes kunnen echter moeilijk te hanteren zijn en vereisen vaak meer tijd en moeite om schade te minimaliseren, dus secties mogen niet dunner zijn dan 40 μm voor bulkkleuring. Een belangrijk voordeel van de vrij zwevende methode is dat onderzoekers snel hele hersenen (of ander weefsel) kunnen doorsnijden en alle secties in kleine buisjes kunnen verzamelen, waarbij elke aliquot een representatief plakje heeft voor alle verschillende hersengebieden, waardoor onderzoekers snel de hele hersenen kunnen kleuren. Buizen met plakjes kunnen gedurende meerdere jaren in cryoprotectant bij -80 °C worden bewaard33, waarbij aliquots niet veel vriesruimte innemen, waardoor onderzoekers effectief een "weefselbibliotheek" kunnen genereren. Deze methode vermindert ook de hoeveelheid verspilde materialen, waaronder dia's, coverslips en vooral antilichamen, die gemakkelijk kunnen worden teruggewonnen en bewaard voor hergebruik, evenals kostbare dierlijke weefsels, omdat secties kunnen worden opgeslagen en bewaard zolang gebruikers dat willen.

De free-floating benadering en het hier gepresenteerde protocol geven onderzoekers ook de mogelijkheid om het protocol eenvoudig aan te passen of middelen opnieuw te gebruiken. De verzamelde secties kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt voor veel verschillende histochemische vlekken naast immunofluorescentie met eenvoudige protocolaanpassingen, zoals chromogene IHC, hematoxyline en eosine (H &E), cresylviolet (figuur 4) en RNAscope38. Chromogene IHC maakt de visualisatie van antigeenexpressie mogelijk wanneer een oplosbaar substraat wordt omgezet door een enzym dat is geconjugeerd tot een secundair antilichaam tegen een onoplosbaar chromogeen product. De twee meest gebruikte enzymen zijn de mierikswortelperoxidase (HRP), die de 3,3' diaminobenzidine (DAB) omzet in een donkerbruin eindproduct, en de alkalische fosfatase (AP), die het 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC) substraat omzet in een rood product39. We voeren routinematig cresylvioletkleuring uit en gebruiken vrij zwevende secties om de grove hersenorganisatie en morfologie te onderzoeken40. We hebben dit protocol ook met succes toegepast op veel verschillende weefsels, waaronder hersenen, lever, hart, nieren en milt (figuur 5). Andere onderzoekers hebben deze techniek ook met succes gebruikt voor perifere weefsels, waaronder lever, nieren en eierstok 22,23,24.

Een grote zorg bij het gebruik van vrij zwevende techniek is het potentieel voor structurele schade aan de weefselsecties, vooral aan hersenplakken, omdat gedurende het hele protocol monsters tijdens bijna elke stap op shakers en rotators worden geplaatst om ervoor te zorgen dat ze gelijkmatig worden gewassen, geblokkeerd en gekleurd. Af en toe kunnen specifieke hersengebieden losraken, vooral op cerebellaire niveaus; het gebruik van een hersenatlas en een vorm van vergroting, zoals een juwelierslamp, tijdens het montageproces kan echter nuttig zijn voor het samenvoegen van secties. Deze uitdaging kan meestal worden voorkomen door voorzichtig met de monsters om te gaan en door roterende machines op de juiste, lage stand te houden.

Tot slot presenteren we een gevestigde vrij zwevende IHC-techniek die heeft bewezen een onmisbare, betrouwbare, flexibele en efficiënte modaliteit te zijn die we regelmatig gebruiken om eiwitexpressie en -lokalisatie te visualiseren, evenals weefselstructuur in een verscheidenheid aan weefsels. Het protocol hierin kan eenvoudig worden aangepast aan individuele onderzoeksbehoeften, waardoor het waardevol is voor de wetenschappelijke gemeenschap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Niets bekend te maken

Acknowledgments

We willen graag het National Institute on Aging (K99/R00 AG055683 tot JMR), het George and Anne Ryan Institute for Neuroscience (EP, GC, JMR), het College of Pharmacy aan de Universiteit van Rhode Island (EP, GC, JMR) en Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR) erkennen. We bedanken promovenda Rebecca Senft, die traint bij professor Susan Dymecki, Department of Genetics, Harvard Medical School, voor het introduceren van de free-floating methode. Sommige afbeeldingen die in figuur 1 worden gebruikt, zijn verkregen uit "gratis te gebruiken, te delen of te wijzigen, zelfs commercieel": muis- en microcentrifugebuis (Pixabay), muizenhersenen (Jonas Töle, Wikimedia Commons), cryostat- en muizenhersensectie (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), glazen container (OpenClipart, FreeSvg.org) en microscoop (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 3513
6-well plates Corning 3516
Clear nail polish User preference N/A
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Embedding molds Thermo Scientific 1841
Ethylene glycol User preference N/A
Formalin solution Fisher Scientific SF98-4
Horse serum, heat inactivated Gibco 26050088
Microscope slide boxes Electron Microscopy Services 71370
PBS User preference N/A
Primary antibody User preference N/A
Rectangular Coverslips VWR 48393-081 24 x 50 mm
Rectangular staining dish Electron Microscopy Services 70312
Round artist paintbrush #2 Princeton Select Series 3750R Brand not important
Secondary antibody User preference N/A
Specimen matrix for embedding OCT Tissue-Tek, Sakura 4583
Stain tray – slide staining system Electron Microscopy Services 71396-B Use dark lid
Sucrose User preference N/A
Superfrost Plus Micro Slides VWR 48311-703
TBS User preference N/A
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vectashield antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000 Non-hardening
Well inserts for 12-well plates Corning Netwells 3477
Well inserts for 6-well plates Corning Netwells 3479
Whatman filter paper Millapore-Sigma WHA1440042

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
  2. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  3. Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
  4. Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374 (1999).
  5. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  6. Hermersdörfer, H. Immunocytochemistry. A Practical Approach. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).
  7. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of Immunohistochemistry. Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  8. Coons, A. H. International Review of Cytology. International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).
  9. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
  10. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).
  11. Li, A., Yang, D. H. Methods in Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. 2108, Clifton, N.J. 43-55 (2020).
  12. Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
  13. Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
  15. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, Clifton, N.J. 55-61 (2010).
  16. van der Loos, C. A focus on fixation. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  19. Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
  20. Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
  21. Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
  22. Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
  23. Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
  24. Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
  25. Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
  26. Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
  27. Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
  28. Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
  29. Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
  30. Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
  31. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
  32. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
  33. Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
  34. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  35. Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
  36. Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
  37. Burry, R. W. Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
  38. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
  39. Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , Springer. 207-262 (1981).
  40. Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).

Tags

Biologie Nummer 162 histochemie immunofluorescentie immunohistochemie vrij zweven hersenen veroudering neurodegeneratie eiwitexpressie eiwitvisualisatie antilichaametikettering
Histologische kleuringen met behulp van vrij zwevende weefselsecties
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross,… More

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (162), e61622, doi:10.3791/61622 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter