Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Histologisk baserede farvninger ved hjælp af fritflydende vævssektioner

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61622
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1George & Anne Ryan Institute for Neuroscience, College of Pharmacy, Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, University of Rhode Island, 2Department of Neuroscience, Biomedicum, Karolinska Institutet

Summary

Den fritflydende teknik giver forskere mulighed for at udføre histologisk baserede farvninger, herunder immunhistokemi på faste vævssektioner for at visualisere biologiske strukturer, celletype og proteinekspression og lokalisering. Dette er en effektiv og pålidelig histokemisk teknik, der kan være nyttig til undersøgelse af en lang række væv, såsom hjerne, hjerte og lever.

Abstract

Immunhistokemi er en meget anvendt teknik til at visualisere specifikke vævsstrukturer samt proteinekspression og lokalisering. To alternative tilgange anvendes i vid udstrækning til at håndtere vævssektionerne under farvningsproceduren, den ene tilgang består i at montere sektionerne direkte på glasglas, mens en anden tilgang, den fritflydende, gør det muligt at opretholde og farves faste sektioner, mens de er suspenderet i opløsning. Selvom glidemonterede og fritflydende tilgange kan give lignende resultater, giver den fritsvævende teknik mulighed for bedre antistofpenetration og bør derfor være den foretrukne metode, når tykkere sektioner skal bruges til 3D-rekonstruktion af vævene, for eksempel når eksperimentets fokus er at få information om dendritiske og aksonale projektioner i hjerneområder. Da sektionerne desuden holdes i opløsning, kan en enkelt prøve let rumme 30 til 40 sektioner, hvis håndtering er mindre besværlig, især i store biomedicinske undersøgelser. Her illustrerer vi, hvordan man kan anvende den fritsvævende metode til fluorescerende immunhistokemisk farvning med stort fokus på hjernesektioner. Vi vil også diskutere, hvordan den fritsvævende teknik let kan modificeres til at passe til forskernes individuelle behov og tilpasses andre væv samt andre histokemisk baserede farvninger, såsom hæmatoxylin og eosin og cresylviolet, så længe vævsprøver er korrekt fikseret, typisk med paraformaldehyd eller formalin.

Introduction

Immunfarvning er en populær forskningspraksis, der begyndte for 130 år siden med opdagelsen af serumantistoffer i 1890 af Von Behring1. I begyndelsen af det 20. århundrede blev farvestoffer bundet til antigener og senere til antistoffer som en måde at kvantificere og visualisere reaktioner1, og i 1941 udviklede Albert Coons de første fluorescerende antistofetiketter, en opdagelse, der revolutionerede lysmikroskopi 2,3. Udtrykket "immunfarvning" omfatter mange teknikker, der er udviklet ved hjælp af dette princip, herunder Western blot, flowcytometri, ELISA, immunocytokemi og immunhistokemi 3,4. Western blot detekterer tilstedeværelsen af specifikke proteiner fra vævs- eller celleekstrakter5. Proteiner adskilles efter størrelse ved anvendelse af gelelektroforese, overføres til en membran og undersøges ved anvendelse af antistoffer. Denne teknik angiver tilstedeværelsen af protein og hvor meget protein der er til stede; Det afslører imidlertid ingen oplysninger om lokalisering af proteinet i celler eller væv. En anden metode, immuncytokemi (ICC), mærker proteiner i celler, typisk celler dyrket in vitro. ICC viser både proteinekspression og lokalisering inden for cellulære rum6. For at detektere og visualisere et specifikt protein på vævsniveau anvendes immunhistokemi (IHC).

IHC er en metode, som forskere bruger til at målrette specifikke antigener i væv og udnytte immunsystemets kemiske egenskaber 7,8. Ved at generere specifikke primære og sekundære antistoffer bundet til enten et enzym eller et fluorescerende farvestof kan antigener af interesse mærkes og afsløres i de fleste væv (som gennemgået i Mepham og Britten)9. Udtrykket "immunohistokemi" i sig selv specificerer ikke den mærkningsmetode, der bruges til at afsløre antigenet af interesse; således kombineres denne terminologi ofte med detektionsteknikken for klart at afgrænse mærkningsmetoden: kromogen immunhistokemi (CIH) for at indikere, hvornår det sekundære antistof konjugeres til et enzym, såsom peroxidase; eller fluorescerende IHC for at angive, hvornår det sekundære antistof er konjugeret med en fluorofor, såsom fluoresceinisothiocyanat (FITC) eller tetramethylrhodamin (TRITC). Selektiviteten af IHC gør det muligt for klinikere og forskere at visualisere proteinekspression og distribution gennem væv på tværs af forskellige sundheds- og sygdomstilstande10. På det kliniske område er IHC almindeligt anvendt til at diagnosticere kræft samt til at bestemme forskelle i forskellige typer kræft. IHC er også blevet brugt til at bekræfte forskellige typer mikrobielle infektioner i kroppen, såsom hepatitis B eller C11. I biomedicinsk forskning bruges IHC ofte til at kortlægge proteinekspression i væv og er vigtig for at identificere unormale proteiner, der ses i sygdomstilstande. For eksempel ledsages neurodegeneration ofte af akkumulering af unormale proteiner i hjernen, såsom Αβ-plaques og neurofibrillære tangles i Alzheimers sygdom. Dyremodeller udvikles ofte til at efterligne disse patologiske tilstande, og IHC er en metode, som forskere bruger til at lokalisere og kvantificere proteinerne af interesse10,12,13. Til gengæld kan vi lære mere om årsagerne til disse sygdomme og de komplikationer, der opstår med dem.

Der er mange trin involveret i udførelsen af IHC. For det første opsamles vævet af interesse og forberedes til farvning. De fleste forskere forbereder uden tvivl faste vævsprøver, hvor perfusion af fikseringsmidlet via kredsløbssystemet er optimalt, da det bevarer morfologi14,15. Efterfiksering af vævsprøver kan også anvendes, men kan give mindre end ideelle resultater16. Tværbindende fikseringsmidler, såsom formaldehyd, virker ved at skabe kemiske bindinger mellem proteiner i vævet17. Fast væv skæres derefter i meget tynde lag eller sektioner ved hjælp af et mikrotom, hvor mange forskere foretrækker at indsamle frosne sektioner ved hjælp af en kryostat. Derfra opsamles vævet og monteres enten direkte på et mikroskopglas (diasmonteret metode) eller suspenderes i en opløsning (fritflydende metode), såsom fosfatbufret saltvand (PBS)18. Den anvendte indsamlingsmetode er forudbestemt ud fra forskerens behov, hvor hver af disse to metoder præsenterer sine egne fordele og ulemper.

Den glidemonterede metode er langt den mest anvendte, og en vigtig fordel er, at der kan fremstilles meget tynde sektioner (10-14 μm), hvilket f.eks. er vigtigt for at undersøge protein-protein-interaktioner. Der er også minimal håndtering af prøven, hvilket reducerer potentiel skade på vævets strukturelle integritet19. Forskere bruger ofte denne teknik med frisk frosset væv (væv, der straks fryses ved hjælp af tøris, isopentan, etc.), som er meget delikat sammenlignet med fast væv, og der skal tages meget omhu for at forhindre optøning af prøven. En anden fordel ved at bruge glidemonterede sektioner er, at store mængder løsninger til farvning normalt ikke kræves4. Således kan forskere bruge en mindre mængde dyre antistoffer eller andre kemikalier til at fuldføre pletten. Derudover er det muligt at montere sektioner fra flere forskellige eksperimentelle grupper på samme dias, hvilket kan være en fordel, især under billedoptagelse. På den anden side er der nogle ulemper ved at bruge diasmonterede sektioner, især at vævssektionen klæbes til diaset og dermed begrænser antistofpenetration til den ene side af sektionen, hvilket begrænser sektionstykkelsen og 3D-repræsentationen af vævet. Det kan også ske, at kanterne af vævet og hele sektioner under vask kan løsne sig fra diaset, hvilket gør hele eksperimentet ubrugeligt. Desuden skal IHC normalt udføres relativt hurtigt, når der anvendes glidemonteret tilgang for at undgå nedbrydning af antigenepitopen 20,21 med uforarbejdede dias, der typisk opbevares ved -20 eller -80 °C, ofte tildækket og opbevaret vandret eller i diaskasser, hvilket resulterer i et relativt stort lagerfodaftryk. Endelig kan den diasmonterede teknik også være tidskrævende, hvis forskere skal håndtere et stort antal dias for at behandle et stort antal vævssektioner.

På grund af nogle af disse udfordringer ved hjælp af den diasmonterede metode er en ændring kaldet den fritflydende metode blevet et populært alternativ. Denne teknik kom ind i litteraturen i 1960-70'erne 22,23,24 og vandt popularitet i 1980'erne 25,26,27,28,29 og er nu en veletableret metode, der involverer at udføre pletten på de indsamlede sektioner i suspension snarere end klæbet til et dias 12,30,31 . Den fritflydende metode anbefales ikke, når vævssektioner er mindre end 20 μm; Det er dog vores erfaring, at det er den foretrukne tilgang, når tykkere (40-50 μm) sektioner skal farves. En klar fordel er, at antistoffer kan trænge igennem fritsvævende sektioner fra alle vinkler og generere mindre baggrundsfarvning på grund af mere effektiv vask, hvilket alt sammen resulterer i bedre signalering ved billeddannelse. Derudover monteres sektionerne på diasene efter behandling, hvilket eliminerer muligheden for vævsfrigørelse samt reducerer den tid, der optager kryostaten. Den fritflydende metode kan også være meget mindre arbejdskrævende, især til store biomedicinske undersøgelser. For eksempel er det muligt at plette mange (18-40) sektioner fra den samme prøve sammen i den samme brønd, hvilket sparer tid ved udførelse af både vaske- og antistofinkubationstrinnene. Da et større antal (12-16) sektioner kan monteres pr. dias ved hjælp af denne tilgang, er det ofte mere bekvemt og hurtigere for forskeren at se og billedsektioner. Især under montering af vævsskiver på diasene kan sektioner fastgøres og løsnes, indtil den ønskede orientering opnås. Forskere bruger også ofte lidt lavere koncentrationer af antistoffer ved hjælp af den fritflydende metode, og da inkubationerne udføres i mikrocentrifugerør, kan antistofferne let opsamles og konserveres med natriumazid til genbrug (se trin 5.1). En anden fordel er, at sektionerne kan opbevares direkte ved -80 °C i små mikrocentrifugerør med kryoprotektiv opløsning32, hvorved opbevaringspladsen minimeres og prøvernes levetidmaksimeres 33. En ulempe ved at bruge denne teknik er, at sektionerne håndteres meget og dermed er tilbøjelige til at blive beskadiget. Dette kan dog afhjælpes ved at bruge lave ryste- og rotationshastigheder samt korrekt træne forskere i, hvordan man overfører prøverne og monterer sektionerne på diasene.

Samlet set er IHC et etableret, essentielt værktøj til visualisering og lokalisering af proteinekspression inden for både det kliniske og biomedicinske forskningsfelt. Fritflydende IHC er en effektiv, fleksibel såvel som økonomisk metode, især når der udføres store histologiske undersøgelser. Her præsenterer vi en pålidelig fritflydende fluorescerende IHC-protokol for det videnskabelige samfund, der kan tilpasses i overensstemmelse hermed til kromogen IHC og andre farvninger såsom hæmatoxylin og eosin eller cresylvioletfarvning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vævsforberedelse til kryosektion

  1. Indlejr fast væv i en passende indlejringsform (se materialetabel) for at skabe en prøveblok ved hjælp af en passende prøvematrix (se materialetabel) og frys på tøris. Opbevar prøveblokke ved -80 °C, indtil de er klar til sektion.
    BEMÆRK: Fikseret væv fremstilles typisk ved perfusering af voksne (ca. 2,5 – 30 måneder gamle) han- eller hungnavere (mus eller rotter)34 i overensstemmelse med den foreliggende etiske tilladelse med et passende fikseringsmiddel (f.eks. 10 % formalin) efterfulgt af postfikserende væv i samme fikseringsmiddel i 12 timer ved 4 °C, vask af væv tre gange med 1x PBS. og anbringelse af væv i 15% og derefter 30% saccharose i 1x PBS natten over, eller indtil vævet synker35. Forskere kan forsøge at tilpasse denne generelle protokol til forskellige udviklingsstadier.

2. Kryosektionering

  1. Når de er klar til sektion, akklimatiseres prøver i kryostaten i mindst 1-2 timer før sektionering for at forhindre knusning af væv.
  2. Brug en kryostat til at skære væv i sektioner (20-50 μm) og opsaml i 6 eller 12-brøndindsatser (se materialetabel) fyldt med 1x PBS-opløsning.
    BEMÆRK: Afhængigt af sektionstykkelsen, hvor meget væv der skal opsamles, og antallet af anvendte brøndindsatser, vil hver brønd indeholde et variabelt antal sektioner, der spænder fra ca. 10 til 40 skiver til brønd. For eksempel, hvis en hel hjerne er sektioneret ved 40 μm, vil ca. 18-24 sektioner blive samlet i hver brønd ved hjælp af 12-brøndindsatser. 20 μm sektioner kan også være noget udfordrende at håndtere, så 40 μm anbefales til bulkfarvning (se diskussion).

3. Opbevaring af sektioner

  1. Når de er opsamlet, vaskes sektionerne med frisklavet 1x PBS i 5 min. Gentag 3 gange.
  2. Overfør sektionerne til 2 ml mikrocentrifugerør fyldt med 1-1,5 ml opbevaringsopløsning (til 250 ml blandes 70 g saccharose, 75 ml ethylenglycol og bringes til volumen med 0,1 M fosfatbuffer).
  3. Opbevares ved -80 °C, indtil den er klar til farvning.

4. Farvning dag I

  1. Tag prøverne ud af fryseren og ekvilibrer ved stuetemperatur (RT) i 10 - 20 min.
  2. Hæld sektioner i en brøndindsats i en 6-brønds plade for at adskille opbevaringsopløsning fra sektioner.
  3. Flyt brøndindsatsen til et andet hul, der indeholder ca. 6 ml 1x TBS. Vask 3 gange med 1x TBS i 5 minutter hver på en orbitalryster ved lav hastighed ved RT.
  4. Mens sektionerne vaskes, fremstilles 7 ml (pr. prøve) af en blokerende permeabiliserende opløsning bestående af 1x TBS med 0,3% Triton X-100 og 3% normalt serum (f.eks. Normalt hesteserum). Bloker sektioner i 30 minutter ved RT på orbital shaker ved hjælp af lav hastighed.
    BEMÆRK: Blokering med sera forhindrer ikke-specifik binding af antistoffer til væv eller ikke-specifikke Fc-receptorer – et serum, der matcher arten af det sekundære antistof, anbefales, men hvis det ikke er tilgængeligt, kan ethvert normalt serum fra en art, der adskiller sig fra det primære antistofværtsdyr, anvendes. Vaskemidlet Triton X-100 giver mulighed for bedre antistofindtrængning ved at permeabilisere vævet.
  5. Forbered 1 ml pr. prøve af primær antistofopløsning bestående af udvalgt primært antistof (fortyndet passende) i 1x TBS med 0,3% Triton X-100 og 1% normalt serum (se trin 4.4 Bemærk). Overfør sektioner fra brønden ind i et 2 ml mikrocentrifugeglas indeholdende primær antistofopløsning for at binde til det eller de pågældende antigener.
    BEMÆRK: Flere primære antistoffer kan anvendes (genereret i forskellige værtsarter).
  6. 2 ml mikrocentrifugerør med sektioner anbringes på en roterende mixer ved lav hastighed (f.eks. hastighed 7 omdr./min.) og inkuberes natten over i 12-16 timer ved 4 °C.

5. Farvning dag II

  1. Den følgende dag hældes sektioner i en brøndindsats i en 6-brøndplade for at adskille sektioner fra primær antistofopløsning.
    BEMÆRK: Antistofopløsning kan indsamles og genbruges; Tilsæt 0,02% (w/v) natriumazid for at hæmme mikrobiel vækst.
  2. Vask sektionerne 3 gange med 1x TBS ved RT (30 s for de første 2 vaske og 10 minutter for slutvask).
  3. Forbered 1 ml pr. prøve af sekundær antistofopløsning bestående af passende sekundært antistof (fortyndet i overensstemmelse hermed) i 1x TBS med 0,3% Triton X-100 og 1% normalt serum (skjoldopløsning fra lys).
    BEMÆRK: Indirekte mærkning med et konjugeret sekundært antistof forstærker signalet og giver mulighed for kolorimetrisk eller fluorescerende visualisering af proteinmålet.
  4. Sektionerne overføres til et 2 ml mikrocentrifugeglas indeholdende sekundær antistofopløsning. Der inkuberes i 2 timer ved RT på orbitalryster ved hjælp af lav hastighed (afskærmningsopløsning fra lys).
  5. Hæld sektioner i en brøndindsats i en 6-brønds plade for at adskille sektioner fra sekundær antistofopløsning.
  6. Fortsæt med at beskytte prøver mod lys, vask 2 gange med 1x TBS i 30 s ved RT. Vask derefter i 15 min i 1x TBS, tilsæt DAPI (1-0,1 μg/ml), hvis det ønskes.

6. Montering

  1. Hæld sektioner i et glas, rektangulært histologisk kammer fyldt tre fjerdedele med 1x TBS.
  2. Nedsænk et glasglas i 1x TBS, og brug en fin pensel til at lokke sektionerne mod diaset.
  3. Bank forsigtigt sektionerne på diaset, og sørg for, at der ikke er rynker eller folder.
  4. Gentag, indtil alle sektioner er monteret på diaset/diasene.
    BEMÆRK: Når en hel hjerne for eksempel er snittet ved 40 μm, samlet i 12-brøndindsatser med en delprøve indeholdende 18-24 sektioner; Udsnit monteres typisk på 1-2 dias, men der kan også monteres færre sektioner pr. dias afhængigt af forskerens præference.

7. Dæksel

  1. Når sektionerne er tørret på objektglasset/diasene, ca. 10-15 minutter ved RT, eller indtil sektionerne ser uigennemsigtige ud (husk at beskytte dias mod lys), påføres et passende vandigt monteringsmedium (hærdning eller ikke-hærdning). Antifading foretrækkes, hvis der anvendes et fluorescerende konjugeret sekundært antistof.
    BEMÆRK: Fluorescenskvaliteten kan være mindre, når du bruger et hærdende monteringsmedium, men dias skal vare længere.
  2. Brug pincet til at placere et dæksel oven på mediet. Dæk med filterpapir, og tryk det godt ned for at fjerne overskydende monteringsmedium.
    BEMÆRK: Hvis du bruger et ikke-hærdende beslag, skal du male kanterne på det dæksledede dias med klar neglelak for at forsegle.
  3. Billedsektioner ved hjælp af et passende mikroskop. Opbevares i en mørk diasæske ved 4 °C.
    BEMÆRK: Sektioner kan afbildes ved hjælp af en række mikroskoper, såsom laserscanning konfokal og omvendt eller opretstående widefield fluorescens, ved forstørrelser (f.eks. 10x, 20x, 40x) baseret på forskerens behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det overordnede skema for anvendelse af den fritflydende metode til udførelse af et fluorescerende immunohistokemisk assay er illustreret i figur 1. Repræsentativt eksempel på fluorescerende IHC ved anvendelse af den fritflydende metode i musehjerne, der undersøger GFAP-ekspression (glial fibrillær sur protein), er vist i figur 2 ved både lavere og højere forstørrelse for at illustrere farvningens overordnede kvalitet. Denne fremgangsmåde er også velegnet til at afsløre proteiner med lav ekspression, med et eksempel fra en GFP transgen musehjerne med lav ekspression vist i figur 3. Den fritflydende metode kan også anvendes i andre histokemiske farvningsprotokoller, såsom cresylviolet, som vist i figur 4, ved at følge trin 1 til 4.3 i protokollen og derefter montere sektionerne som angivet i trin 6. Derefter kan sektioner behandles ved hjælp af enhver farvning, der kræver glidemonterede sektioner. Når du bruger denne protokol til kromogen IHC, skal du følge protokollen fra trin 1 til 5.6 (tilføj ikke DAPI til den sidste vask), og juster i overensstemmelse hermed, hvis du bruger et forstærkningstrin (f.eks. avidin-biotinkompleks). Udskift bufferen med kromagen/substratreagens, inkuber 5-20 minutter, indtil vævet får den ønskede farve. Reaktionen kan overvåges ved periodisk at kontrollere vævet med et laveffektmikroskop. Afslut reaktionen ved at flytte brøndindsatsen med sektionerne til frisk buffer, vask dem tre gange, mindst 5 minutter hver. Fortsæt med trin 6 for at montere sektionerne på glasskinner, så sektionerne tørrer på et dias varmere i mindst 3-4 timer. Dehydrer diasene med stigende ethanolkoncentrationer (dvs. 70%, 90%, 95%, 99,5%, 2-5 minutter hver) efterfulgt af xylen (5-10 min) og dækslip derefter med et hårdt monteret medium (f.eks. Entellan), så gliderne tørrer mindst 1-2 timer i et ventileret område. Hvis baggrunden er for høj, slukkes den endogene peroxidaseaktivitet i 15 minutter ved RT med 3% H 2 O2i 1x TBS efterfulgt af tre buffervaske, 15-20 min hver, før blokering (trin 4.4). Flere perifere væv er også modtagelige for at anvende denne teknik uden ændringer af protokollen, der kræves, med et eksempel på leversektioner fra en GFP-ekspressionsmus vist i figur 5.

Figure 1
Figur 1: Rutediagram over det fritflydende fluorescerende immunhistokemiske assay. Dissekere det pågældende organ (helst fast væv) og indlejr væv i indlejrede forme (se materialetabel) ved hjælp af en prøvematrix (se materialetabel), og frys derefter på tøris og opbevar ved -80 °C. Snitvæv ved hjælp af en kryostat ved 20-50 μm og saml skiver i brøndindsatser (se materialetabel) fyldt med 1x PBS. Brug en orbitalryster ved lav hastighed til at vaske sektioner 3x i 5 minutter hver i 1x PBS. På dette tidspunkt opbevares ekstra sektioner i opbevaringsbufferen ved -80 °C, indtil der er brug for dem. Vask de resterende sektioner 3x i 5 min med 1x TBS. Bloker sektioner i 30 minutter ved RT ryster ved lav hastighed. Der fremstilles primær antistofopløsning, og sektionerne inkuberes natten over i mikrocentrifugeglas ved 4 °C (12-14 timer). Den følgende dag vaskes sektioner med 1x TBS 3x, de første to vaskes i 30 s, med den tredje vask i 10 min. Inkuber sektioner i sekundær antistofopløsning i mikrocentrifugerør i 2 timer ved RT, og sørg for at beskytte sektioner mod lys, når det er muligt, fra dette trin fremad. Vask derefter 3x med 1x TBS, første to vaske i 30 s og tredje vask i 15 min. Tilsæt DAPI til sidste vask, hvis det ønskes, og hvis det ikke findes i monteringsmediet. Hæld sektioner i en kammerkasse, tre fjerdedele fuld af 1x TBS, og brug en pensel til at klæbe sektioner på diaset (e). Lad lysbillederne tørre (~10-15 min), før du dækker med det valgte monteringsmedium. Billedsektioner ved hjælp af et passende mikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Fluorescerende immunhistokemi ved hjælp af fritsvævende hjernesektioner. Hippocampus hjerneområder, der undersøger GFAP-ekspression hos voksne mus, vises og blev mærket ved hjælp af et primært anti-GFAP-antistof opdrættet hos kanin og et sekundært antistof mod kanin Alexa568 opdrættet i æsel. DAPI blev brugt i den sidste vask til at mærke kerner. Vævet blev snittet ved 40 μm ved hjælp af en kryostat. Billeder blev taget ved 10x (øvre) og 40x (nedre) forstørrelse ved hjælp af et laserpunktscanningskonfokalmikroskop. 10x billedskalalinje = 400 μm. 40x billedskalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Fluorescerende immunhistokemi på proteiner med lavere udtrykt ved hjælp af fritflydende metode. Hippocampus hjerneområder fra en lav ekspression GFP transgen voksen mus er vist. Neuroner, der udtrykker GFP, blev mærket ved hjælp af et primært anti-GFP-antistof rejst i ged og et sekundært anti-gede-antistof hævet i æsel. DAPI blev brugt i den sidste vask til at mærke kerner. Vævet blev snittet ved 40 μm ved hjælp af en kryostat. Billeder blev taget ved 40x forstørrelse ved hjælp af et laserpunktscanningskonfokalmikroskop. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Cresylviolet farvning ved hjælp af fritflydende hjernesektioner. Ved hjælp af en kryostat blev 40 μm sektioner fra voksen museolfaktorisk pære til lillehjerne opsamlet, vasket, monteret på dias, farvet med cresylviolet og coverslipped. Billeder blev taget ved 10x forstørrelse ved hjælp af et omvendt widefield mikroskop. Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Fluorescerende immunhistokemi ved hjælp af fritflydende leversektioner. Leversektioner taget ved 40 μm ved hjælp af en kryostat fra en transgen voksen mus, der udtrykker lave niveauer af GFP, vises. Et primært antistof mod GFP opdrættet hos geder med et sekundært anti-gede-gede-antistof opdrættet i æsel blev brugt til at mærke celler, der udtrykte GFP. DAPI blev tilsat til den sidste vask for at mærke kerner. Billeder blev indsamlet ved hjælp af et laserpunktscanningskonfokalmikroskop ved 40x forstørrelse. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immunhistokemi (IHC) er en alsidig teknik, der er blevet afgørende for at identificere proteinekspression og lokalisering inden for vævssektioner. Dette assay bruges i hele det videnskabelige samfund til yderligere at forstå vævets egenskaber på tværs af stadier af normal funktion til sygdomstilstande. IHC anvendes på tværs af en række områder fra klinisk diagnose af sygdomme som kræft til indledende opdagelser i præklinisk forskning10,36.

Den teknik, der oftest anvendes til at udføre IHC, er den diasmonterede metode, hvor sektionerne straks klæbes til diaset efter at være skåret i skiver. Nogle fordele ved at bruge denne teknik er, at forskere kan håndtere meget tynde sektioner, der er nødvendige for proteincolokaliseringsundersøgelser, og bruge lidt løsning til at plette sektionerne pr. Dias. Antistoffer er ofte dyre; Derfor kan denne tilgang være en økonomisk mulighed, hvis få sektioner skal behandles. Dette er også den foretrukne metode for forskere, der bruger friskfrosne prøver, fordi håndteringen af vævet er minimal, og dermed vil vævets strukturelle integritet blive beskyttet. Brug af glidemonteret tilgang ville også være passende, hvis kun få sektioner skal indsamles og straks farves, som det er tilfældet i klinisk patologi. På den anden side er der nogle ulemper, såsom kun den udsatte side af vævet er tilgængelig under farvning, hvilket begrænser sektionstykkelsen på grund af dårlig antistofindtrængning og effektiv vask. En anden ulempe er, at når vævet er sektioneret og opsamlet på dias, skal IHC normalt afsluttes ret hurtigt med opbevaring af uforarbejdede dias, der optager meget fryseplads. Desuden kan denne tilgang ved behandling af større eksperimenter (f.eks. Flere hjerneområder med flere repræsentative niveauer, der skal farves) faktisk bruge flere reagenser, være ret tidskrævende og kan ofte begrænse antallet af dias, der skal behandles pr. Eksperiment.

Nogle begrænsninger forbundet med den glidemonterede metode kan overvindes af den fritflydende farvningsteknik, der er blevet et stadig mere populært alternativ, når man arbejder med tykkere sektioner. Selv om denne metode ikke er en ny tilgang, har det efter vores erfaring været en pålidelig, reproducerbar og fleksibel tilgang, især til farvning af vævsprøver i bulk, hvilket har gjort det muligt at behandle større undersøgelser på en effektiv måde. Forskere kan også effektivt køre flere, store IHC-eksperimenter på samme tid med denne metode. Desuden farves prøverne i suspension, således at opløsningerne kan trænge ind i sektionerne fra alle vinkler, især vigtigt for tykkere sektioner, hvilket ofte fører til en plet af højere kvalitet (figur 2, figur 3 og figur 5). Fritsvævende sektioner kan skæres overalt fra 20-50 μm i tykkelse37, med tykkere sektioner, der er nyttige for forskere at se strukturer eller celler i forskellige synssletter. For eksempel i hjernevæv giver tykkere sektioner forskere mulighed for at se strukturen af dendritter og axoner gennem deres prøver. Evnen til at samle tyndere skiver (20 μm) udvider endnu mere anvendelsesspektret; Tyndere skiver kan dog være vanskelige at håndtere og kræver ofte mere tid og kræfter for at minimere skader, så sektioner bør ikke være tyndere end 40 μm til bulkfarvning. En vigtig fordel ved den fritsvævende metode er, at forskere hurtigt kan sektionere hele hjerner (eller andet væv) og samle alle sektioner i små rør, hvor hver delprøve har en repræsentativ skive for alle forskellige hjerneområder, hvilket giver forskerne mulighed for hurtigt at plette hele hjernen. Rør, der indeholder skiver, kan opbevares i kryoprotektive midler ved -80 °C i flere år33, idet alikvoter ikke optager meget fryseplads, hvilket effektivt giver forskerne mulighed for at generere et "vævsbibliotek". Denne metode reducerer også mængden af spildte materialer, herunder dias, dæksedler og især antistoffer, som let kan genvindes og bevares til genbrug, samt dyrebart animalsk væv, da sektioner kan opbevares og gemmes, så længe brugerne vælger.

Den fritflydende tilgang og protokollen, der præsenteres her, giver også forskere mulighed for nemt at ændre protokollen eller genbruge ressourcer. For eksempel kan de indsamlede sektioner anvendes til mange forskellige histokemiske pletter ud over immunofluorescens med enkle protokolmodifikationer, såsom kromogen IHC, hæmatoxylin og eosin (H&E), cresylviolet (figur 4) og RNAscope38. Kromogen IHC tillader visualisering af antigenekspression, når et opløseligt substrat omdannes af et enzym konjugeret til et sekundært antistof mod et uopløseligt kromogent produkt. De to mest almindeligt anvendte enzymer er peberrodsperoxidase (HRP), som omdanner 3,3' diaminobenzidin (DAB) til et mørkebrunt slutprodukt, og alkalisk fosfatase (AP), som omdanner 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC) substratet til et rødt produkt39. Vi udfører rutinemæssigt cresylvioletfarvning og bruger fritflydende sektioner for at undersøge grov hjerneorganisation og morfologi40. Vi har også med succes anvendt denne protokol på mange forskellige væv, herunder hjerne, lever, hjerte, nyre og milt (figur 5). Andre forskere har også med succes brugt denne teknik til perifere væv, herunder lever, nyre og æggestok22,23,24.

En stor bekymring ved brug af fritflydende teknik er potentialet for strukturel skade på vævssektionerne, især på hjerneskiver, fordi prøver i hele protokollen er på rystere og rotatorer under næsten hvert trin for at sikre, at de vaskes jævnt, blokeres og farves. Lejlighedsvis kan specifikke hjerneområder løsrive sig, især på cerebellære niveauer; Brug af et hjerneatlas og en form for forstørrelse, såsom en juvelerlampe, under monteringsprocessen kan dog være nyttigt til sammenlægning af sektioner. Denne udfordring kan normalt forhindres ved skånsom håndtering af prøverne og ved at holde roterende maskiner på den korrekte, lave indstilling.

Afslutningsvis præsenterer vi en etableret fritflydende IHC-teknik, der har vist sig at være en uundværlig, pålidelig, fleksibel og effektiv modalitet, som vi regelmæssigt bruger til at visualisere proteinekspression og lokalisering samt vævsstruktur i en række væv. Protokollen heri kan let ændres, så den passer til individuelle forskningsbehov, hvilket gør den værdifuld for det videnskabelige samfund.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Intet at afsløre

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende National Institute on Aging (K99/R00 AG055683 til JMR), George og Anne Ryan Institute for Neuroscience (EP, GC, JMR), College of Pharmacy ved University of Rhode Island (EP, GC, JMR) og Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Vi takker ph.d.-studerende Rebecca Senft, der træner med professor Susan Dymecki, Institut for Genetik, Harvard Medical School, for at introducere os til den fritflydende metode. Nogle billeder, der blev brugt i figur 1, blev hentet fra "gratis at bruge, dele eller ændre, selv kommercielt" kilder: mus og mikrocentrifugerør (Pixabay), musehjerne (Jonas Töle, Wikimedia Commons), kryostat- og musehjernesektion (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), glasbeholder (OpenClipart, FreeSvg.org) og mikroskop (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 3513
6-well plates Corning 3516
Clear nail polish User preference N/A
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Embedding molds Thermo Scientific 1841
Ethylene glycol User preference N/A
Formalin solution Fisher Scientific SF98-4
Horse serum, heat inactivated Gibco 26050088
Microscope slide boxes Electron Microscopy Services 71370
PBS User preference N/A
Primary antibody User preference N/A
Rectangular Coverslips VWR 48393-081 24 x 50 mm
Rectangular staining dish Electron Microscopy Services 70312
Round artist paintbrush #2 Princeton Select Series 3750R Brand not important
Secondary antibody User preference N/A
Specimen matrix for embedding OCT Tissue-Tek, Sakura 4583
Stain tray – slide staining system Electron Microscopy Services 71396-B Use dark lid
Sucrose User preference N/A
Superfrost Plus Micro Slides VWR 48311-703
TBS User preference N/A
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vectashield antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000 Non-hardening
Well inserts for 12-well plates Corning Netwells 3477
Well inserts for 6-well plates Corning Netwells 3479
Whatman filter paper Millapore-Sigma WHA1440042

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
  2. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  3. Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
  4. Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374 (1999).
  5. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  6. Hermersdörfer, H. Immunocytochemistry. A Practical Approach. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).
  7. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of Immunohistochemistry. Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  8. Coons, A. H. International Review of Cytology. International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).
  9. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
  10. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).
  11. Li, A., Yang, D. H. Methods in Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. 2108, Clifton, N.J. 43-55 (2020).
  12. Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
  13. Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
  15. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, Clifton, N.J. 55-61 (2010).
  16. van der Loos, C. A focus on fixation. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  19. Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
  20. Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
  21. Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
  22. Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
  23. Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
  24. Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
  25. Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
  26. Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
  27. Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
  28. Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
  29. Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
  30. Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
  31. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
  32. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
  33. Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
  34. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  35. Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
  36. Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
  37. Burry, R. W. Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
  38. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
  39. Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , Springer. 207-262 (1981).
  40. Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).

Tags

Biologi udgave 162 histokemi immunofluorescens immunhistokemi frit flydende hjerne aldring neurodegeneration proteinekspression proteinvisualisering antistofmærkning
Histologisk baserede farvninger ved hjælp af fritflydende vævssektioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross,… More

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (162), e61622, doi:10.3791/61622 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter