Summary
Den frittflytende teknikken tillater forskere å utføre histologisk-baserte farginger, inkludert immunhistokjemi på faste vevsseksjoner for å visualisere biologiske strukturer, celletype og proteinuttrykk og lokalisering. Dette er en effektiv og pålitelig histokjemisk teknikk som kan være nyttig for å undersøke en rekke vev, som hjerne, hjerte og lever.
Abstract
Immunhistokjemi er en mye brukt teknikk for å visualisere spesifikke vevstrukturer, samt proteinuttrykk og lokalisering. To alternative tilnærminger er mye brukt til å håndtere vevsseksjonene under fargeprosedyren, en tilnærming består av å montere seksjonene direkte på glassglass, mens en annen tilnærming, den frittflytende, gjør det mulig å opprettholde faste seksjoner og beise mens de er suspendert i løsning. Selv om glidemonterte og frittflytende tilnærminger kan gi lignende resultater, tillater den frittflytende teknikken bedre antistoffpenetrasjon og bør derfor være den valgte metoden når tykkere seksjoner skal brukes til 3D-rekonstruksjon av vevene, for eksempel når eksperimentets fokus er å få informasjon om dendrittiske og aksonale projeksjoner i hjernegrupper. I tillegg, siden seksjonene holdes i løsning, kan en enkelt aliquot lett romme 30 til 40 seksjoner, hvorav håndtering er mindre arbeidskrevende, spesielt i store biomedisinske studier. Her illustrerer vi hvordan man kan anvende den frittflytende metoden på fluorescerende immunhistokjemifarging, med stort fokus på hjernesnitt. Vi vil også diskutere hvordan den frittflytende teknikken enkelt kan modifiseres for å passe til forskernes individuelle behov og tilpasses andre vev samt andre histokjemisk-baserte farginger, som hematoksylin og eosin og cresylfiolett, så lenge vevsprøver er riktig festet, typisk med paraformaldehyd eller formalin.
Introduction
Immunfarging er en populær forskningspraksis som begynte for 130 år siden med oppdagelsen av serumantistoffer i 1890 av Von Behring1. I begynnelsen av det 20. århundre ble fargestoffer festet til antigener og senere til antistoffer som en måte å kvantifisere og visualisere reaksjoner1, og i 1941 utviklet Albert Coons de første fluorescerende antistoffetikettene, en oppdagelse som revolusjonerte lysmikroskopi 2,3. Begrepet "immunfarging" omfatter mange teknikker som er utviklet ved hjelp av dette prinsippet, inkludert Western blot, flowcytometri, ELISA, immunocytokjemi og immunhistokjemi 3,4. Western blot oppdager tilstedeværelsen av spesifikke proteiner fra vev eller celleekstrakter5. Proteiner separeres etter størrelse ved hjelp av gelelektroforese, overføres til en membran og undersøkes ved bruk av antistoffer. Denne teknikken indikerer tilstedeværelsen av protein og hvor mye protein som er tilstede; Det avslører imidlertid ingen informasjon om lokalisering av proteinet i celler eller vev. En annen metode, immunocytokjemi (ICC), merker proteiner i celler, vanligvis celler dyrket in vitro. ICC viser både proteinuttrykk og lokalisering i cellulære rom6. For å oppdage og visualisere et spesifikt protein på vevsnivå, benyttes immunhistokjemi (IHC).
IHC er en metode som forskere bruker for å målrette spesifikke antigener i vev, og utnytter kjemiske egenskaper til immunsystemet 7,8. Ved å generere spesifikke primære og sekundære antistoffer knyttet til enten et enzym eller et fluorescerende fargestoff, kan antigener av interesse merkes og avsløres i de fleste vev (som gjennomgått i Mepham og Britten)9. Begrepet "immunhistokjemi" i seg selv spesifiserer ikke merkingsmetoden som brukes til å avsløre antigenet av interesse; Dermed kombineres denne terminologien ofte med deteksjonsteknikken for å tydelig avgrense merkingsmetoden: kromogen immunhistokjemi (CIH) for å indikere når det sekundære antistoffet er konjugert til et enzym, slik som peroksidase; eller fluorescerende IHC for å indikere når det sekundære antistoffet er konjugert til en fluorofor, slik som fluoresceinisotiocyanat (FITC) eller tetrametylrhodamin (TRITC). Selektiviteten til IHC gjør det mulig for klinikere og forskere å visualisere proteinuttrykk og distribusjon gjennom vev, på tvers av ulike tilstander av helse og sykdom10. I det kliniske riket brukes IHC ofte til å diagnostisere kreft, samt å bestemme forskjeller i ulike typer kreft. IHC har også blitt brukt til å bekrefte forskjellige typer mikrobielle infeksjoner i kroppen, for eksempel hepatitt B eller C11. I biomedisinsk forskning brukes IHC ofte til å kartlegge proteinuttrykk i vev og er viktig for å identifisere unormale proteiner sett i sykdomstilstander. For eksempel er nevrodegenerasjon ofte ledsaget av akkumulering av unormale proteiner i hjernen, som Aαβ-plakk og nevrofibrillære floker i Alzheimers sykdom. Dyremodeller blir ofte utviklet for å etterligne disse patologiske tilstandene, og IHC er en metode som forskere bruker for å lokalisere og kvantifisere proteinene av interesse10,12,13. I sin tur kan vi lære mer om årsakene til disse sykdommene, og komplikasjonene som oppstår med dem.
Det er mange trinn involvert i å utføre IHC. Først samles vevet av interesse og klargjøres for farging. Det kan hevdes at de fleste forskere forbereder faste vevsprøver, med perfusjon av fiksativet via sirkulasjonssystemet som optimalt da det bevarer morfologi14,15. Postfiksering av vevsprøver kan også brukes, men kan gi mindre enn ideelle resultater16. Kryssbindende fikseringsmidler, som formaldehyd, virker ved å skape kjemiske bindinger mellom proteiner i vevet17. Fast vev blir deretter skåret i svært tynne lag eller seksjoner ved hjelp av en mikrotom, med mange forskere som foretrekker å samle frosne seksjoner ved hjelp av en kryostat. Derfra samles vevet og monteres enten direkte på et mikroskopglass (glidemontert metode), eller suspenderes i en løsning (frittflytende metode), slik som fosfatbufret saltvann (PBS)18. Metoden for innsamling som brukes er forhåndsbestemt basert på forskerens behov, med hver av disse to metodene som presenterer sine egne fordeler og ulemper.
Den glidemonterte metoden er den klart mest brukte, med en viktig fordel at svært tynne seksjoner (10-14 μm) kan fremstilles, noe som for eksempel er viktig for å undersøke protein-protein-interaksjoner. Det er også minimal håndtering av prøven, noe som reduserer potensiell skade på vevets strukturelle integritet19. Forskere bruker ofte denne teknikken med ferskt frossent vev (vev som umiddelbart fryses ved hjelp av tørris, isopentan, etc.), noe som er veldig delikat sammenlignet med fast vev og mye forsiktighet for å forhindre tining av prøven må tas. En annen fordel ved å bruke glidemonterte seksjoner er at store mengder løsninger for farging vanligvis ikke er nødvendig4. Dermed kan forskere bruke en mindre mengde dyre antistoffer eller andre kjemikalier for å fullføre flekken. I tillegg er det mulig å montere seksjoner fra flere forskjellige eksperimentelle grupper på samme lysbilde, noe som kan være fordelaktig, spesielt under bildeopptak. På den annen side er det noen ulemper ved å bruke glidemonterte seksjoner, spesielt at vevsseksjonen er festet til lysbildet og dermed begrenser antistoffpenetrasjon til den ene siden av seksjonen, noe som begrenser seksjonstykkelsen og 3D-representasjonen av vevet. Det kan også skje at under vask kan kantene på vevet og hele seksjoner løsne fra lysbildet, noe som gjør ubrukelig hele eksperimentet. Videre må IHC vanligvis utføres relativt raskt ved bruk av glidemontert tilnærming for å unngå nedbrytning av antigenepitopen 20,21 med ubehandlede lysbilder som vanligvis lagres ved -20 eller -80 °C, ofte dekket og lagret horisontalt eller i lysbildebokser, noe som resulterer i et relativt stort lagringsavtrykk. Til slutt kan den glidemonterte teknikken også være tidkrevende hvis forskere må håndtere et stort antall lysbilder for å behandle et stort antall vevsseksjoner.
På grunn av noen av disse utfordringene ved bruk av glidemontert metode, har en modifikasjon kalt frittflytende metode blitt et populært alternativ. Denne teknikken kom inn i litteraturen på 1960-70-tallet 22,23,24, og ble populær på 1980-tallet 25,26,27,28,29, og er nå en veletablert metode som innebærer å utføre flekken på de innsamlede seksjonene i suspensjon i stedet for festet til et lysbilde 12,30,31 . Den frittflytende metoden anbefales ikke når vevsseksjoner er mindre enn 20 μm; Vår erfaring er imidlertid at det er den foretrukne tilnærmingen når tykkere (40-50 μm) seksjoner skal beises. En klar fordel er at antistoffer kan trenge gjennom frittflytende seksjoner fra alle vinkler og generere mindre bakgrunnsfarging på grunn av mer effektiv vask, noe som resulterer i bedre signalering ved avbildning. I tillegg er seksjonene montert på lysbildene etter behandling, og eliminerer dermed muligheten for vevsløsing, samt reduserer tiden som opptar kryostaten. Den frittflytende metoden kan også være mye mindre arbeidsintensiv, spesielt for store biomedisinske studier. For eksempel er det mulig å flekke mange (18-40) seksjoner fra samme prøve sammen i samme brønn, noe som sparer tid ved å utføre både vaske- og antistoffinkubasjonstrinnene. Dessuten, siden et større antall (12-16) seksjoner kan monteres per lysbilde ved hjelp av denne tilnærmingen, er det ofte mer praktisk og raskere for forskeren å se og avbilde seksjoner. Spesielt under montering av vevskiver på lysbildene, kan seksjoner festes og løsnes til ønsket orientering er oppnådd. Forskere bruker også ofte litt lavere konsentrasjoner av antistoffer ved hjelp av den frittflytende metoden, og siden inkubasjonene utføres i mikrosentrifugerør, kan antistoffene enkelt samles og konserveres med natriumazid for gjenbruk (se trinn 5.1). En annen fordel er at seksjonene kan lagres direkte ved -80 °C i små mikrosentrifugerør med kryobeskyttelsesmiddelløsning32, og dermed minimere lagringsplass og maksimere levetiden til prøvene33. En ulempe med å bruke denne teknikken er at seksjonene håndteres mye, og dermed er utsatt for skade. Dette kan imidlertid reduseres ved å bruke lave riste- og rotasjonshastigheter, samt riktig opplæring av forskere hvordan man overfører prøvene og monterer seksjonene på lysbildene.
Samlet sett er IHC et etablert, essensielt verktøy for å visualisere og lokalisere proteinuttrykk i både kliniske og biomedisinske forskningsfelt. Frittflytende IHC er en effektiv, fleksibel og økonomisk metode, spesielt når man utfører storskala histologiske studier. Her presenterer vi en pålitelig frittflytende fluorescerende IHC-protokoll for det vitenskapelige samfunn som kan tilpasses tilsvarende for kromogen IHC og andre farginger som hematoksylin og eosin eller cresylfiolett farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vevsforberedelse for kryoseksjonering
- Bygg inn faste vev i en passende innebyggingsform (se materialfortegnelse) for å lage en prøveblokk ved hjelp av en passende prøvematrise (se materialtabell) og frys på tørris. Oppbevar prøveblokker ved -80 °C til de er klare til seksjon.
MERK: Fast vev fremstilles vanligvis ved å perfusere voksne (ca. 2,5 – 30 måneder gamle) hann- eller hunngnagere (mus eller rotte)34, i samsvar med tilgjengelig etisk tillatelse, med et passende fikseringsmiddel (f.eks. 10 % formalin), etterfulgt av postfikserende vev i samme fiksativ i 12 timer ved 4 °C, vasking av vev tre ganger med 1x PBS, og plassere vev i 15% og deretter 30% sukrose i 1x PBS for over natten eller til vev synker35. Forskere kan prøve å tilpasse denne generelle protokollen til ulike utviklingsstadier.
2. Kryoseksjonering
- Når du er klar til seksjon, akklimatiserer du prøver i kryostaten i minst 1-2 timer før seksjonering for å forhindre knusing av vev.
- Bruk en kryostat, kutt vev i seksjoner (20-50 μm) og samle inn 6 eller 12-brønns innlegg (se materialtabell) fylt med 1x PBS-løsning.
MERK: Avhengig av seksjonstykkelsen, hvor mye vev som skal samles opp, og antall brønninnlegg som brukes, vil hver brønn inneholde et variabelt antall seksjoner som spenner fra ca. 10 til 40 skiver for brønn. For eksempel, hvis en hel hjerne er seksjonert ved 40 μm, vil omtrent 18-24 seksjoner samles i hver brønn ved hjelp av 12-brønninnsatser. Dessuten kan 20 μm seksjoner være noe utfordrende å håndtere, derfor anbefales 40 μm for bulkfarging (se diskusjon).
3. Lagring av seksjoner
- Når de er samlet, vask seksjonene med nylaget 1x PBS i 5 minutter. Gjenta 3 ganger.
- Overfør seksjonene til 2 ml mikrosentrifugerør fylt med 1-1,5 ml lagringsløsning (for 250 ml, bland 70 g sukrose, 75 ml etylenglykol og bring til volum med 0,1 M fosfatbuffer).
- Oppbevares ved -80 °C til det er klart for flekker.
4. Farge Dag I
- Fjern prøver fra fryseren og sett i romtemperatur (RT) i 10 - 20 min.
- Hell seksjoner i en brønninnsats i en 6-brønnsplate for å skille lagringsløsning fra seksjoner.
- Flytt brønninnsatsen til en annen brønn som inneholder ca. 6 ml 1x TBS. Vask 3 ganger med 1x TBS i 5 min hver på en orbital shaker med lav hastighet ved RT.
- Mens seksjoner vaskes, tilbered 7 ml (per prøve) av en blokkerende permeabiliserende løsning bestående av 1x TBS med 0,3% Triton X-100 og 3% normalt serum (f.eks. normalt hesteserum). Blokkseksjoner i 30 min ved RT på orbital shaker, ved bruk av lav hastighet.
MERK: Blokkering med sera forhindrer uspesifikk binding av antistoffer mot vev eller ikke-spesifikke Fc-reseptorer - et serum som samsvarer med arten av det sekundære antistoffet anbefales, men hvis det ikke er tilgjengelig, kan ethvert normalt serum fra en art som er forskjellig fra det primære antistoffvertsdyret brukes. Vaskemiddelet Triton X-100 muliggjør bedre antistoffpenetrasjon ved å permeabilisere vevet. - Klargjør 1 ml per prøve av primær antistoffoppløsning bestående av utvalgte primære antistoff (fortynnet på riktig måte) i 1x TBS med 0,3 % Triton X-100 og 1 % normalt serum (se trinn 4.4 Merk). Overfør seksjoner fra brønninnsetting i et 2 ml mikrosentrifugerør inneholdende primær antistoffoppløsning for å binde seg til antigenet/antigenene av interesse.
MERK: Flere primære antistoffer kan brukes (generert i forskjellige vertsarter). - Plasser 2 ml mikrosentrifugerør med seksjoner på en roterende mikser ved hjelp av lav hastighet (f.eks. hastighet 7 o / min) og inkuber over natten i 12-16 timer ved 4 ° C.
5. Farging Dag II
- Neste dag, hell seksjoner i en brønninnsats i en 6-brønnplate for å skille seksjoner fra primær antistoffløsning.
MERK: Antistoffoppløsning kan samles opp og gjenbrukes; Tilsett 0,02 % (w/v) natriumazid for å hemme mikrobiell vekst. - Vask seksjonene 3 ganger med 1x TBS ved RT (30 s for de første 2 vaskene og 10 min for sluttvask).
- Klargjør 1 ml per prøve av sekundær antistoffoppløsning bestående av passende sekundært antistoff (fortynnet tilsvarende) i 1x TBS med 0,3% Triton X-100 og 1% normalt serum (skjermoppløsning fra lys).
MERK: Indirekte merking med et konjugert sekundært antistoff forsterker signalet og muliggjør kolorimetrisk eller fluorescerende visualisering av proteinmålet. - Overfør seksjoner til et 2 ml mikrosentrifugerør inneholdende sekundær antistoffoppløsning. Inkuber i 2 timer ved RT på orbital shaker ved hjelp av lav hastighet (skjoldløsning fra lys).
- Hell seksjoner i en brønninnsats i en 6-brønnsplate for å skille seksjoner fra sekundær antistoffløsning.
- Fortsett å skjerme prøver fra lys, vask 2 ganger med 1x TBS i 30 s ved RT. Vask deretter i 15 min i 1x TBS, tilsett DAPI (1-0,1 μg/ml) om ønskelig.
6. Montering
- Hell seksjoner i et glass, rektangulært histologisk kammer fylt tre fjerdedeler med 1x TBS.
- Senk et glassglass ned i 1x TBS og bruk en fin pensel til å lokke seksjonene mot lysbildet.
- Trykk forsiktig på delene på lysbildet, og pass på at det ikke er rynker eller bretter.
- Gjenta til alle seksjonene er montert på lysbildet.
MERK: Når en hel hjerne, for eksempel, er seksjonert ved 40 μm, samlet i 12-brønninnsatser med en alikot som inneholder 18-24 seksjoner; Skiver er vanligvis montert på 1-2 lysbilder, men færre seksjoner kan også monteres per lysbilde avhengig av forskerens preferanse.
7. Dekkslipp
- Etter at seksjonene er tørket på lysbildet, ca. 10-15 minutter ved RT eller til seksjonene ser ugjennomsiktige ut (husk å skjerme lysbilder fra lys), påfør et passende vandig monteringsmedium (herding eller ikke-herding). Antifading foretrekkes ved bruk av fluorescerende konjugert sekundært antistoff.
MERK: Fluorescenskvaliteten kan være lavere når du bruker et herdemonteringsmedium, men lysbildene skal vare lenger. - Bruk pinsett, plasser en dekselslip på toppen av mediet. Dekk til med filterpapir og trykk godt ned for å fjerne overflødig monteringsmedium.
NOTAT: Hvis du bruker et ikke-herdende feste, må du male kantene på det glidede lysbildet med klar neglelakk for å forsegle. - Bildesnitt ved hjelp av et passende mikroskop. Oppbevares i en mørk lysbildeboks ved 4 °C.
MERK: Seksjoner kan avbildes ved hjelp av en rekke mikroskoper, for eksempel laserskanning konfokal og invertert eller oppreist bredfeltfluorescens, ved forstørrelser (f.eks. 10x, 20x, 40x) basert på forskerens behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det overordnede skjemaet for bruk av frittflytende metode for å utføre en fluorescerende immunhistokjemisk analyse er illustrert i figur 1. Representativt eksempel på fluorescerende IHC ved bruk av frittflytende metode i musehjerne som undersøker GFAP-uttrykk (glial fibrillary acidic protein) er vist i figur 2 ved både lavere og høyere forstørrelse for å illustrere den generelle kvaliteten på fargingen. Denne tilnærmingen er også egnet for å avsløre lavuttrykkende proteiner, med et eksempel fra en GFP lavuttrykkende transgen musehjerne vist i figur 3. Den frittflytende metoden kan også brukes i andre histokjemiske fargeprotokoller, for eksempel cresylfiolett, som vist i figur 4, ved å følge trinn 1 til 4.3 i protokollen og deretter montere seksjonene som angitt i trinn 6. Deretter kan seksjoner behandles ved hjelp av hvilken som helst farging som krever glidemonterte seksjoner. Når du bruker denne protokollen for kromogen IHC, følg protokollen fra trinn 1 til 5.6 (ikke legg DAPI til siste vask), juster deretter hvis du bruker et forsterkningstrinn (f.eks. avidin-biotinkompleks). Bytt ut bufferen med chromagen/substratreagens, inkuber 5-20 min til vevet blir ønsket farge. Reaksjonen kan overvåkes ved å kontrollere vevet med jevne mellomrom med et mikroskop med lav effekt. Avslutt reaksjonen ved å flytte brønninnsatsen med seksjonene til fersk buffer, vask dem tre ganger, minst 5 minutter hver. Fortsett med trinn 6 for å montere seksjonene på glasslysbilder, slik at seksjonene tørker på en lysbildevarmer i minst 3-4 timer. Dehydrer lysbildene med økende etanolkonsentrasjoner (dvs. 70%, 90%, 95%, 99,5%, 2-5 min hver) etterfulgt av xylen (5-10 min) og dekkslipp deretter med et hardt monteringsmedium (f.eks. Entellan), slik at lysbildene tørker minst 1-2 timer i et ventilert område. Hvis bakgrunnen er for høy, slukk den endogene peroksidaseaktiviteten i 15 minutter ved RT med 3% H 2 O2 i1x TBS etterfulgt av tre buffervask, 15-20 min hver, før du blokkerer (trinn 4.4). Flere perifere vev er også mottagelige for å bruke denne teknikken uten modifikasjoner av protokollen som kreves, med et eksempel på leverseksjoner fra en GFP-uttrykkende mus vist i figur 5.
Figur 1 Flytdiagram over den frittflytende fluorescerende immunhistokjemiske analysen. Dissekere organet av interesse (helst fast vev) og legge vev i embedding former (se tabell over materialer) ved hjelp av en prøvematrise (se tabell over materialer), og deretter fryse på tørris og lagre ved -80 ° C. Seksjonsvev ved hjelp av en kryostat ved 20-50 μm og samle skiver i brønninnsatser (se materialtabell) fylt med 1x PBS. Bruk en orbital shaker på lav hastighet, vask seksjoner 3x i 5 min hver i 1x PBS. På dette tidspunktet lagrer du ekstra seksjoner i lagringsbuffer ved -80 °C til det trengs. Vask resterende seksjoner 3x i 5 min med 1x TBS. Blokkseksjoner i 30 min ved RT risting ved lav hastighet. Klargjør primær antistoffoppløsning og inkuber seksjoner over natten i mikrosentrifugerør(er) ved 4 °C (12-14 timer). Dagen etter, vask seksjoner med 1x TBS 3x, først to vasker i 30 s, med den tredje vask i 10 min. Inkuber seksjoner i sekundær antistoffløsning i mikrosentrifugerør (er) i 2 timer ved RT, og sørg for å skjerme seksjoner fra lys når det er mulig fra dette trinnet fremover. Vask deretter 3x med 1x TBS, først to vask i 30 s, og tredje vask i 15 min. Legg DAPI til siste vask om ønskelig og hvis ikke til stede i monteringsmedium. Hell seksjoner i en kammerboks, tre fjerdedeler full av 1x TBS, og bruk en pensel til å feste seksjoner på lysbildet (e). La lysbildene tørke (~10-15 min) før du dekker til med valgfritt monteringsmedium. Bildesnitt ved hjelp av et passende mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Fluorescerende immunhistokjemi med frittflytende hjernesnitt. Hippocampus hjerneområder som undersøker GFAP-uttrykk hos voksen mus er vist og ble merket ved hjelp av et anti-GFAP primært antistoff hevet hos kanin og et antikanin Alexa568 sekundært antistoff hevet i esel. DAPI ble brukt i den siste vasken for å merke kjerner. Vevet ble snittet ved 40 μm ved hjelp av en kryostat. Bildene ble tatt ved 10x (øvre) og 40x (nedre) forstørrelse ved hjelp av et laserpunktskanning konfokalmikroskop. 10x bildeskala bar = 400 μm. 40x bildeskala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Fluorescerende immunhistokjemi på lavere uttrykte proteiner med frittflytende metode. Hippocampus hjernegrupper fra en lavuttrykkende GFP transgen voksen mus er vist. Nevroner som uttrykker GFP ble merket ved hjelp av et anti-GFP primært antistoff hevet i geit og et anti-geit Alexa488 sekundært antistoff hevet i esel. DAPI ble brukt i den siste vasken for å merke kjerner. Vevet ble snittet ved 40 μm ved hjelp av en kryostat. Bildene ble tatt med 40x forstørrelse ved hjelp av et laserpunktskanning konfokalmikroskop. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Cresylfiolett farging med frittflytende hjernesnitt. Ved hjelp av en kryostat ble 40 μm seksjoner fra voksen mus olfaktorisk pære til cerebellum samlet, vasket, montert på lysbilder, farget med cresylfiolett og dekket. Bildene ble tatt med 10x forstørrelse ved hjelp av et invertert bredfeltsmikroskop. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Fluorescerende immunhistokjemi med frittflytende leversnitt. Deler av leveren tatt ved 40 μm ved bruk av en kryostat fra en transgen voksen mus som uttrykker lave nivåer av GFP er vist. Et anti-GFP primært antistoff hevet i geit med et anti-geit Alexa488 sekundært antistoff hevet i esel ble brukt til å merke celler som uttrykker GFP. DAPI ble lagt til den siste vasken for å merke kjerner. Bildene ble samlet inn ved hjelp av et laserpunktskanning konfokalmikroskop ved 40x forstørrelse. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunhistokjemi (IHC) er en allsidig teknikk som har blitt avgjørende for å identifisere proteinuttrykk og lokalisering i vevssnitt. Denne analysen brukes i hele det vitenskapelige samfunn for ytterligere å forstå egenskaper av vev på tvers av stadier av normal funksjon til sykdomstilstander. IHC er ansatt på tvers av en rekke felt fra klinisk diagnose av sykdommer som kreft til første funn i preklinisk forskning10,36.
Teknikken som oftest brukes til å utføre IHC er den glidemonterte metoden der seksjonene umiddelbart festes til lysbildet etter å ha blitt skåret. Noen fordeler ved å bruke denne teknikken er at forskere kan håndtere svært tynne seksjoner som trengs for proteinkolokaliseringsstudier og bruke liten løsning for å flekke seksjonene per lysbilde. Antistoffer er ofte dyre; Derfor kan denne tilnærmingen være et økonomisk alternativ hvis få seksjoner skal behandles. Dette er også den valgte metoden for forskere som bruker ferskfrosne prøver fordi håndteringen av vevet er minimal, og dermed vil vevets strukturelle integritet bli beskyttet. Bruk av glidemontert tilnærming vil også være hensiktsmessig hvis bare noen få seksjoner skal samles inn og umiddelbart farges, slik tilfellet er i klinisk patologi. På den annen side er det noen ulemper, for eksempel at bare den eksponerte siden av vevet nås under farging, og dermed begrenser seksjonstykkelsen på grunn av dårlig antistoffpenetrasjon og effektiv vask. En annen ulempe er at når vevet er snittet og samlet på lysbilder, må IHC normalt fullføres ganske raskt med lagring av ubehandlede lysbilder som tar opp mye fryseplass. Videre, når du behandler større eksperimenter (f.eks. Flere hjernegrupper med flere, representative nivåer som skal farges), kan denne tilnærmingen faktisk bruke flere reagenser, være ganske tidkrevende, og kan ofte begrense antall lysbilder som skal behandles per eksperiment.
Noen begrensninger knyttet til den glidemonterte metoden kan overvinnes av den frittflytende fargeteknikken som har blitt et stadig mer populært alternativ når du arbeider med tykkere seksjoner. Selv om denne metoden ikke er en ny tilnærming, har den etter vår erfaring vært en pålitelig, reproduserbar og fleksibel tilnærming, spesielt for farging av vevsprøver i bulk, og dermed tillatt behandling av større studier på en effektiv måte. Forskere kan også effektivt kjøre flere, store IHC-eksperimenter samtidig med denne metoden. Dessuten er prøvene farget i oppheng, slik at løsningene kan trenge gjennom seksjonene fra alle vinkler, spesielt viktig for tykkere seksjoner, noe som ofte fører til en flekk av høyere kvalitet (figur 2, figur 3 og figur 5). Frittflytende seksjoner kan skives hvor som helst fra 20-50 μm i tykkelse37, med tykkere seksjoner som er nyttige for forskere å se strukturer eller celler i forskjellige synssletter. For eksempel, i hjernevev, tillater tykkere seksjoner forskere å se strukturen av dendritter og axoner gjennom sine prøver. Evnen til å samle tynnere skiver (20 μm) utvider enda mer spekteret av applikasjoner; Imidlertid kan tynnere skiver være vanskelige å håndtere og krever ofte mer tid og krefter for å minimere skade, og derfor bør seksjoner ikke være tynnere enn 40 μm for bulkfarging. En viktig fordel med den frittflytende metoden er at forskere raskt kan seksjonere hele hjerner (eller annet vev), samle alle seksjoner i små rør med hver aliquot som har et representativt stykke for alle forskjellige hjernegrupper, slik at forskere raskt kan flekke hele hjernen. Rør som inneholder skiver kan lagres i kryobeskyttelsesmiddel ved -80 ° C i flere år33, med alikoter som ikke tar opp mye fryseplass, noe som effektivt tillater forskere å generere et "vevsbibliotek". Denne metoden reduserer også mengden bortkastede materialer, inkludert lysbilder, dekksedler og spesielt antistoffer, som lett kan gjenvinnes og bevares for gjenbruk, samt dyrebare dyrevev siden seksjoner kan lagres og lagres så lenge brukerne velger.
Den frittflytende tilnærmingen og protokollen som presenteres her gir også forskere muligheten til enkelt å endre protokollen eller gjenbruke ressurser. For eksempel kan de innsamlede seksjonene brukes til mange forskjellige histokjemiske flekker i tillegg til immunfluorescens med enkle protokollmodifikasjoner, som kromogen IHC, hematoksylin og eosin (H&E), kresylfiolett (figur 4) og RNAscope38. Kromogen IHC tillater visualisering av antigenuttrykk når et løselig substrat omdannes av et enzym konjugert til et sekundært antistoff mot et uoppløselig kromogent produkt. De to enzymene som oftest brukes er pepperrotperoksidase (HRP), som omdanner 3,3' diaminobenzidin (DAB) til et mørkebrunt sluttprodukt, og alkalisk fosfatase (AP), som omdanner 3-amino-9-etylkarbazol (AEC) substratet til et rødt produkt39. Vi utfører rutinemessig cresylfiolett farging og bruker frittflytende seksjoner for å undersøke brutto hjerneorganisasjon og morfologi40. Vi har også brukt denne protokollen på mange forskjellige vev, inkludert hjerne, lever, hjerte, nyre og milt (figur 5). Andre forskere har også med hell brukt denne teknikken for perifert vev, inkludert lever, nyre og eggstokk22,23,24.
En stor bekymring ved bruk av frittflytende teknikk er potensialet for strukturell skade på vevsseksjonene, spesielt på hjerneskiver, fordi gjennom hele protokollen er prøver på ristere og rotatorer under nesten hvert trinn for å sikre at de blir jevnt vasket, blokkert og farget. Av og til kan bestemte hjernegrupper løsrives, spesielt på cerebellarnivåene; Imidlertid kan bruk av et hjerneatlas og en form for forstørrelse, for eksempel en gullsmedlampe, under monteringsprosessen være nyttig for å sette sammen seksjoner. Denne utfordringen kan vanligvis forebygges gjennom skånsom håndtering av prøvene og ved å holde roterende maskiner på riktig, lav innstilling.
Avslutningsvis presenterer vi en etablert frittflytende IHC-teknikk som har vist seg å være en uunnværlig, pålitelig, fleksibel og effektiv modalitet som vi regelmessig bruker til å visualisere proteinuttrykk og lokalisering samt vevstruktur i en rekke vev. Protokollen her kan enkelt endres for å passe individuelle forskningsbehov, noe som gjør den verdifull for det vitenskapelige samfunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingenting å avsløre
Acknowledgments
Vi ønsker å anerkjenne National Institute on Aging (K99/R00 AG055683 til JMR), George og Anne Ryan Institute for Neuroscience (EP, GC, JMR), College of Pharmacy ved University of Rhode Island (EP, GC, JMR), og Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Vi takker doktorgradsstudent Rebecca Senft, opplæring med professor Susan Dymecki, Institutt for genetikk, Harvard Medical School, for å introdusere oss til den frittflytende metoden. Noen bilder brukt i figur 1 ble hentet fra "gratis å bruke, dele eller endre, selv kommersielt" kilder: mus og mikrosentrifugerør (Pixabay), musehjerne (Jonas Töle, Wikimedia Commons), kryostat og musehjerneseksjon (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), glassbeholder (OpenClipart, FreeSvg.org) og mikroskop (Theresa Knott, Open Clip Art Library).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3513 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Clear nail polish | User preference | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Embedding molds | Thermo Scientific | 1841 | |
| Ethylene glycol | User preference | N/A | |
| Formalin solution | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco | 26050088 | |
| Microscope slide boxes | Electron Microscopy Services | 71370 | |
| PBS | User preference | N/A | |
| Primary antibody | User preference | N/A | |
| Rectangular Coverslips | VWR | 48393-081 | 24 x 50 mm |
| Rectangular staining dish | Electron Microscopy Services | 70312 | |
| Round artist paintbrush #2 | Princeton Select Series | 3750R | Brand not important |
| Secondary antibody | User preference | N/A | |
| Specimen matrix for embedding | OCT Tissue-Tek, Sakura | 4583 | |
| Stain tray – slide staining system | Electron Microscopy Services | 71396-B | Use dark lid |
| Sucrose | User preference | N/A | |
| Superfrost Plus Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| TBS | User preference | N/A | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Non-hardening |
| Well inserts for 12-well plates | Corning Netwells | 3477 | |
| Well inserts for 6-well plates | Corning Netwells | 3479 | |
| Whatman filter paper | Millapore-Sigma | WHA1440042 |
References
- Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
- Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374 (1999).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Hermersdörfer, H. Immunocytochemistry. A Practical Approach. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).
- Schacht, V., Kern, J. S.
- Coons, A. H.
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Li, A., Yang, D. H.
- Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
- Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
- Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- van der Loos, C.
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
- Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
- Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
- Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
- Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
- Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
- Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
- Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
- Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
- Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
- Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
- Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
- Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
- Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
- Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
- Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
- Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
- Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , Springer. 207-262 (1981).
- Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).
