Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Гистологические окрашивания с использованием свободно плавающих участков тканей

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61622
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1George & Anne Ryan Institute for Neuroscience, College of Pharmacy, Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, University of Rhode Island, 2Department of Neuroscience, Biomedicum, Karolinska Institutet

Summary

Свободно плавающий метод позволяет исследователям выполнять гистологические окрашивания, включая иммуногистохимию на фиксированных участках ткани, для визуализации биологических структур, типа клеток, экспрессии и локализации белка. Это эффективный и надежный гистохимический метод, который может быть полезен для исследования множества тканей, таких как мозг, сердце и печень.

Abstract

Иммуногистохимия является широко используемым методом визуализации специфических тканевых структур, а также экспрессии и локализации белка. Два альтернативных подхода широко используются для обработки участков ткани во время процедуры окрашивания, один подход заключается в монтаже секций непосредственно на стеклянных слайдах, в то время как второй подход, свободно плавающий, позволяет поддерживать и окрашивать фиксированные участки во время подвешивания в растворе. Хотя скользящие и свободно плавающие подходы могут давать аналогичные результаты, свободно плавающий метод позволяет лучше проникать антителам и, следовательно, должен быть методом выбора, когда более толстые участки должны использоваться для 3D-реконструкции тканей, например, когда основное внимание в эксперименте уделяется получению информации о дендритных и аксональных проекциях в областях мозга. Кроме того, поскольку секции хранятся в растворе, одна аликвота может легко вместить от 30 до 40 секций, обработка которых менее трудоемка, особенно в крупномасштабных биомедицинских исследованиях. Здесь мы иллюстрируем, как применять свободно плавающий метод к флуоресцентному иммуногистохимическому окрашиванию, уделяя основное внимание участкам мозга. Мы также обсудим, как свободно плавающая техника может быть легко модифицирована в соответствии с индивидуальными потребностями исследователей и адаптирована к другим тканям, а также к другим гистохимическим окрашиваниям, таким как гематоксилин и эозин и крезил-фиолетовый, если образцы тканей правильно зафиксированы, как правило, с параформальдегидом или формалином.

Introduction

Иммуноокрашивание является популярной исследовательской практикой, которая началась 130 лет назад с открытия сывороточных антител в 1890 году фон Берингом1. В начале20-го века красители были прикреплены к антигенам, а затем к антителам как способ количественной оценки и визуализации реакций1, а в 1941 году Альберт Кунс разработал первые флуоресцентные метки антител, открытие, которое произвело революцию в световой микроскопии 2,3. Термин «иммуноокрашивание» охватывает многие методы, которые были разработаны с использованием этого принципа, включая вестерн-блоттинг, проточную цитометрию, ИФА, иммуноцитохимию и иммуногистохимию 3,4. Вестерн-блот обнаруживает присутствие специфических белков из тканевых или клеточных экстрактов5. Белки разделяются по размеру с помощью гелевого электрофореза, переносятся на мембрану и исследуются с использованием антител. Эта методика указывает на наличие белка и на то, сколько белка присутствует; однако он не раскрывает никакой информации о локализации белка внутри клеток или тканей. Другой метод, иммуноцитохимия (ICC), маркирует белки внутри клеток, обычно клеток, культивируемых in vitro. ICC показывает как экспрессию белка, так и локализацию в клеточных компартментах6. Для обнаружения и визуализации специфического белка на тканевом уровне используется иммуногистохимия (IHC).

IHC - это метод, который исследователи используют для нацеливания на специфические антигены в ткани, используя преимущества химических свойств иммунной системы 7,8. Генерируя специфические первичные и вторичные антитела, связанные либо с ферментом, либо с флуоресцентным красителем, представляющие интерес антигены могут быть помечены и выявлены в большинстве тканей (как рассмотрено в Mepham и Britten)9. Термин «иммуногистохимия» сам по себе не указывает на метод маркировки, который используется для выявления интересующего антигена; таким образом, эта терминология часто сочетается с методом обнаружения, чтобы четко очертить метод маркировки: хромогенная иммуногистохимия (CIH) для указания, когда вторичное антитело конъюгируется с ферментом, таким как пероксидаза; или флуоресцентный IHC, чтобы указать, когда вторичное антитело конъюгируется с флуорофором, таким как флуоресцеин изотиоцианат (FITC) или тетраметилродамин (TRITC). Селективность IHC позволяет клиницистам и исследователям визуализировать экспрессию и распределение белка по тканям, в различных состояниях здоровья и заболевания10. В клинической сфере IHC обычно используется для диагностики рака, а также для определения различий в различных типах рака. IHC также использовался для подтверждения различных типов микробных инфекций в организме, таких как гепатит B или C11. В биомедицинских исследованиях IHC часто используется для картирования экспрессии белка в тканях и важен для выявления аномальных белков, наблюдаемых в болезненных состояниях. Например, нейродегенерация часто сопровождается накоплением аномальных белков в головном мозге, таких как Αβ-бляшки и нейрофибриллярные клубки при болезни Альцгеймера. Затем животные модели часто разрабатываются для имитации этих патологических состояний, и IHC является одним из методов, которые исследователи используют для определения местоположения и количественной оценки интересующих белков 10,12,13. В свою очередь, мы можем узнать больше о причинах этих заболеваний, и осложнениях, которые возникают при них.

Есть много шагов, связанных с выполнением IHC. Сначала собирается интересующая ткань и подготавливается к окрашиванию. Возможно, большинство исследователей готовят фиксированные образцы тканей, при этом перфузия фиксатора через кровеносную систему является оптимальной, поскольку она сохраняет морфологию14,15. Постфиксация образцов тканей также может быть использована, но может дать менее идеальные результаты16. Сшивающие фиксаторы, такие как формальдегид, действуют путем создания химических связей между белками в ткани17. Фиксированная ткань затем нарезается на очень тонкие слои или участки с использованием микротома, причем многие исследователи предпочитают собирать замороженные участки с помощью криостата. Оттуда ткань собирают и либо монтируют непосредственно на предметное стекло микроскопа (скользящий метод), либо суспендируют в растворе (свободно плавающий метод), таком как фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS)18. Используемый метод сбора предопределен исходя из потребностей исследователя, причем каждый из этих двух методов представляет свои преимущества и недостатки.

Метод, установленный на слайдах, на сегодняшний день является наиболее часто используемым, с важным преимуществом, заключающимся в том, что могут быть приготовлены очень тонкие срезы (10-14 мкм), что важно, например, для исследования белково-белковых взаимодействий. Существует также минимальное обращение с образцом, что уменьшает потенциальное повреждение структурной целостности ткани19. Исследователи часто используют эту технику со свежезамороженной тканью (тканью, которая немедленно замораживается с использованием сухого льда, изопентана и т. Д.), Которая очень деликатна по сравнению с фиксированной тканью, и необходимо проявлять большую осторожность для предотвращения оттаивания образца. Еще одним преимуществом использования скользящих секций является то, что большие объемы растворов для окрашивания обычно не требуются4. Таким образом, исследователи могут использовать меньшее количество дорогих антител или других химических веществ для завершения окрашивания. Кроме того, можно монтировать секции из нескольких различных экспериментальных групп на одном слайде, что может быть выгодно, особенно во время получения изображения. С другой стороны, есть некоторые недостатки использования секций, установленных на слайдах, в первую очередь то, что участок ткани прилипает к слайду, что ограничивает проникновение антител в одну сторону секции, что ограничивает толщину сечения и 3D-представление ткани. Также может случиться так, что во время стирки края ткани и целые срезы могут отсоединиться от слайда, сделав бесполезным весь эксперимент. Кроме того, IHC обычно должен выполняться относительно быстро при использовании подхода, установленного на слайдах, чтобы избежать деградации эпитопа антигена20,21 с необработанными слайдами, обычно хранящимися при -20 или -80 ° C, часто покрытыми и хранящимися горизонтально или в слайд-боксах, что приводит к относительно большой площади хранения. Наконец, метод крепления слайдов также может занять много времени, если исследователи должны обрабатывать большое количество слайдов для обработки большого количества участков тканей.

Из-за некоторых из этих проблем с использованием метода slide-mounted модификация, называемая свободно плавающим методом, стала популярной альтернативой. Эта техника вошла в литературу в 1960-70-хгодах 22,23,24, набрав популярность в 1980-х 25,26,27,28,29, и в настоящее время является хорошо зарекомендовавшим себя методом, который включает в себя выполнение пятна на собранных участках в суспензии, а не приклеенное к слайду 12,30,31 . Свободно плавающий метод не рекомендуется, когда срезы тканей составляют менее 20 мкм; однако, по нашему опыту, это подход выбора, когда более толстые (40-50 мкм) участки должны быть окрашены. Одним из явных преимуществ является то, что антитела могут проникать в свободно плавающие участки со всех углов и генерировать меньше фонового окрашивания из-за более эффективной промывки, что приводит к лучшей передаче сигналов при визуализации. Кроме того, секции крепятся на слайды после обработки, что исключает возможность отслоения тканей, а также уменьшает время, занимаемое криостатом. Свободно плавающий метод также может быть гораздо менее трудоемким, особенно для крупномасштабных биомедицинских исследований. Например, можно окрасить многие (18-40) секции из одного и того же образца вместе в одном колодце, что экономит время при выполнении этапов промывки и инкубации антител. Более того, поскольку с помощью этого подхода можно смонтировать большее количество (12-16) секций на слайд, исследователю часто удобнее и быстрее просматривать и обрезать разделы. Примечательно, что во время монтажа срезов ткани на слайдах секции могут быть прикреплены и отсоединены до тех пор, пока не будет достигнута желаемая ориентация. Исследователи также часто используют несколько более низкие концентрации антител с использованием свободно плавающего метода, и поскольку инкубации выполняются в микроцентрифужных трубках, антитела могут быть легко собраны и сохранены с азидом натрия для повторного использования (см. Шаг 5.1). Другим преимуществом является то, что секции могут непосредственно храниться при -80 °C в небольших микроцентрифужных трубках с раствором криопротектора32, тем самым минимизируя пространство для хранения и максимизируя долговечность образцов33. Недостатком использования этой техники является то, что секции обрабатываются много и, следовательно, подвержены повреждениям. Это, однако, можно смягчить, используя низкие скорости встряхивания и вращения, а также правильно обучая исследователей тому, как переносить образцы и монтировать секции на слайды.

Взятый вместе, IHC является признанным, важным инструментом для визуализации и локализации экспрессии белка как в клинических, так и в биомедицинских исследованиях. Свободно плавающий IHC является эффективным, гибким, а также экономичным методом, особенно при выполнении крупномасштабных гистологических исследований. Здесь мы представляем надежный свободно плавающий флуоресцентный протокол IHC для научного сообщества, который может быть соответствующим образом адаптирован для хромогенного IHC и других окрашиваний, таких как гематоксилин и эозин или крезиловое окрашивание.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка тканей к криосечению

  1. Встраивайте неподвижные ткани в соответствующую форму для встраивания (см. Таблицу материалов) для создания блока образцов с использованием соответствующей матрицы образца (см. Таблицу материалов) и замораживайте на сухом льду. Храните блоки образцов при температуре -80 °C до готовности к разделению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные ткани обычно получают путем перфузии взрослых (около 2,5 – 30 месяцев) самцов или самок грызунов (мыши или крыс)34, в соответствии с имеющимся этическим разрешением, соответствующим фиксатором (например, 10% формалина), с последующим постфиксирующими тканями в том же фиксаторе в течение 12 ч при 4 °C, промывая ткани три раза с 1x PBS, и помещение тканей в 15%, а затем 30% сахарозы в 1x PBS на ночь или до тех пор, пока ткани не утонут35. Исследователи могут попытаться адаптировать этот общий протокол к различным стадиям развития.

2. Криосекционирование

  1. Когда они будут готовы к разделению, акклиматизируйте образцы в криостате в течение не менее 1-2 ч перед секционированием, чтобы предотвратить разрушение ткани.
  2. С помощью криостата разрезают ткань на срезы (20-50 мкм) и собирают в 6 или 12-луночные вставки (см. Таблицу материалов), заполненные 1x раствором PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от толщины сечения, количества ткани, подлежащей сбору, и количества используемых лунок, каждая скважина будет содержать переменное количество секций, охватывающих примерно от 10 до 40 ломтиков для скважины. Например, если весь мозг разделен на 40 мкм, примерно 18-24 секции будут собраны в каждой скважине с помощью 12-луночных вставок. Кроме того, 20-мкм секции могут быть несколько сложными в обращении, поэтому 40 мкм рекомендуется для объемного окрашивания (см. Обсуждение).

3. Хранение секций

  1. После сбора промыть секции свежеприготовленными 1x PBS в течение 5 минут. Повторите 3 раза.
  2. Переложить срезы в микроцентрифужные трубки по 2 мл, заполненные 1-1,5 мл раствора для хранения (на 250 мл смешать 70 г сахарозы, 75 мл этиленгликоля и довести до объема с 0,1 М фосфатного буфера).
  3. Хранить при температуре -80 °C до готовности к окрашиванию.

4. Окрашивание День I

  1. Извлеките образцы из морозильной камеры и уравновесьте при комнатной температуре (RT) в течение 10 - 20 мин.
  2. Вылейте секции в колодец, вставьте в 6-луночную пластину, чтобы отделить раствор для хранения от секций.
  3. Переместите вставку скважины в другую скважину, содержащую примерно 6 мл 1x TBS. Промыть 3 раза 1x TBS в течение 5 минут каждая на орбитальном шейкере, используя низкую скорость при RT.
  4. Во время промывки срезов приготовьте 7 мл (на образец) блокирующего-пермеабилизирующего раствора, состоящего из 1x TBS с 0,3% Triton X-100 и 3% нормальной сыворотки (например, обычной конской сыворотки). Блокируйте секции в течение 30 мин на RT на орбитальном шейкере, используя низкую скорость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирование сыворотками предотвращает неспецифическое связывание антител с тканями или неспецифическими Fc-рецепторами - рекомендуется сыворотка, соответствующая виду вторичного антитела, но если она недоступна, может быть использована любая нормальная сыворотка от вида, отличного от первичного антитела-хозяина животного. Моющее средство Triton X-100 обеспечивает лучшее проникновение антител путем проникновения в ткань.
  5. Приготовьте 1 мл на образец раствора первичного антитела, состоящего из выбранного первичного антитела (разведенного соответствующим образом) в 1x TBS с 0,3% Triton X-100 и 1% нормальной сывороткой (см. Шаг 4.4 Примечание). Переносные участки из скважины вставляют в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую раствор первичного антитела для связывания с интересующим антигеном (антигенами).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть использовано несколько первичных антител (генерируемых у разных видов хозяев).
  6. Поместите 2 мл микроцентрифужной трубки с секциями на вращающийся смеситель с использованием низкой скорости (например, скорость 7 об/мин) и инкубируйте в течение ночи в течение 12-16 ч при 4 °C.

5. Окрашивание День II

  1. На следующий день вылейте срезы в лунку, вставьте в 6-луночную пластину, чтобы отделить участки от раствора первичных антител.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор антител может быть собран и повторно использован; добавляют 0,02% (мас./об.) азида натрия для ингибирования роста микробов.
  2. Промыть секции 3 раза с 1x TBS на RT (30 с для первых 2 стирок и 10 мин для окончательной стирки).
  3. Готовят 1 мл на образец раствора вторичного антитела, состоящего из соответствующего вторичного антитела (разбавленного соответственно) в 1x TBS с 0,3% Triton X-100 и 1% нормальной сывороткой (защитный раствор от света).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Непрямая маркировка конъюгированным вторичным антителом усиливает сигнал и позволяет осуществлять колориметрическую или флуоресцентную визуализацию белковой мишени.
  4. Переведите срезы в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую раствор вторичных антител. Инкубировать в течение 2 ч на RT на орбитальном шейкере с использованием низкой скорости (защитный раствор от света).
  5. Перелить срезы в лунку вставить в 6-луночную пластину для отделения срезов от раствора вторичных антител.
  6. Продолжая защищать образцы от света, промыть 2 раза 1x TBS в течение 30 с на RT. Затем промыть в течение 15 мин в 1x TBS, при желании добавить DAPI (1-0,1 мкг/мл).

6. Монтаж

  1. Перелейте срезы в стеклянную, прямоугольную гистологическую камеру, заполненную на три четверти 1x TBS.
  2. Погрузите стеклянную горку в 1x TBS и используйте тонкую кисть, чтобы склонить секции к слайду.
  3. Осторожно постучите по секциям на слайде, убедившись, что нет морщин или складок.
  4. Повторяйте до тех пор, пока все секции не будут установлены на слайд(ы).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда весь мозг, например, разрезается на 40 мкм, собирают в 12-луночные вставки с одной аликвотой, содержащей 18-24 сечения; срезы обычно монтируются на 1-2 слайдах, но меньше секций также может быть установлено на слайд в зависимости от предпочтений исследователя.

7. Обшивка

  1. После того, как секции высушены на слайде (слайдах), примерно через 10-15 минут на RT или до тех пор, пока секции не станут непрозрачными (не забудьте защитить слайды от света), нанесите соответствующую водную монтажную среду (затвердевающую или нетвердеющую). Антифейдинг является предпочтительным при использовании флуоресцентного конъюгированного вторичного антитела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Качество флуоресценции может быть ниже при использовании упрочняющего монтажного носителя, но слайды должны служить дольше.
  2. Используя пинцет, поместите крышку поверх среды. Накройте крышкой фильтровальной бумагой и плотно прижмите, чтобы удалить лишнюю монтажную среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании незатвердевающего крепления покрасьте края обшивки прозрачным лаком для ногтей.
  3. Изображение участков с помощью соответствующего микроскопа. Хранить в темной коробке при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Участки могут быть визуализированы с помощью различных микроскопов, таких как лазерное сканирование конфокальной и инвертированной или вертикальной широкоугольной флуоресценции, при увеличении (например, 10x, 20x, 40x) на основе потребностей исследователя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Общая схема использования свободно плавающего метода для выполнения флуоресцентного иммуногистохимического анализа проиллюстрирована на фиг.1. Репрезентативный пример флуоресцентного IHC с использованием свободно плавающего метода в мозге мыши, исследующего экспрессию глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), показан на рисунке 2 как при меньшем, так и при более высоком увеличении, чтобы проиллюстрировать общее качество окрашивания. Этот подход также подходит для выявления низкоэкспрессирующих белков, на примере низкоэкспрессивного трансгенного мозга мыши с низким уровнем экспрессии GFP, показанного на рисунке 3. Свободно плавающий метод также может быть использован в других протоколах гистохимического окрашивания, таких как крезиловая фиалка, как показано на рисунке 4, путем выполнения шагов с 1 по 4.3 протокола и последующего монтажа секций, как указано на шаге 6. После этого секции могут быть обработаны с использованием любого окрашивания, которое требует скользящих секций. При использовании этого протокола для хромогенного IHC следуйте протоколу от Шагов 1 до 5.6 (не добавляйте DAPI к последней промывке), соответствующим образом корректируя при использовании стадии усиления (например, комплекс авидин-биотин). Замените буфер реагеном/субстратом, инкубируя 5-20 мин до тех пор, пока ткань не приобретет нужный цвет. Реакцию можно контролировать, периодически проверяя ткани с помощью маломощного микроскопа. Прекращают реакцию, перемещая вставку скважины с секциями в свежий буфер, промывая их три раза, не менее 5 мин каждая. Выполните шаг 6, чтобы установить секции на стеклянные горки, позволяя секциям высохнуть на слайд-грелке в течение не менее 3-4 часов. Обезвоживать горки с увеличением концентрации этанола (т.е. 70%, 90%, 95%, 99,5%, 2-5 мин каждая) с последующим ксилолом (5-10 мин), а затем обволакивающим стеклом с твердой монтажной средой (например, Entellan), позволяя слайдам высохнуть не менее 1-2 ч в проветриваемом помещении. Если фон слишком высок, погасите активность эндогенной пероксидазы в течение 15 мин при РТ с 3% H2O 2в 1x TBS с последующим тремя буферными промывками, по 15-20 мин каждая, перед блокировкой (Шаг 4.4). Несколько периферических тканей также поддаются использованию этого метода без каких-либо изменений протокола, с примером участков печени от GFP-экспрессирующей мыши, показанной на рисунке 5.

Figure 1
Рисунок 1: Блок-схема свободно плавающего флуоресцентного иммуногистохимического анализа. Рассекните интересующий орган (предпочтительно фиксированную ткань) и встройте ткань во встраиваемые формы (см. Таблицу материалов) с помощью матрицы образца (см. Таблицу материалов), а затем заморозьте на сухом льду и храните при -80 °C. Срезать ткань с помощью криостата на 20-50 мкм и собрать срезы в колодезные вставки (см. Таблицу материалов), заполненные 1x PBS. Используя орбитальный шейкер на низкой скорости, промывайте секции 3x в течение 5 минут каждая в 1x PBS. На этом этапе храните дополнительные секции в буфере хранения при -80 °C до тех пор, пока это не понадобится. Промывайте оставшиеся секции 3x в течение 5 мин с 1x TBS. Блокируйте секции в течение 30 мин при встряхивании RT на низкой скорости. Готовят первичный раствор антител и инкубируют срезы на ночь в микроцентрифужной трубке (трубках) при 4 °C (12-14 ч). На следующий день вымойте секции 1x TBS 3x, первые две стирки в течение 30 с, а третью стирку в течение 10 минут. Инкубируйте секции во вторичном растворе антител в микроцентрифужной трубке (трубках) в течение 2 часов на RT, обеспечивая защиту секций от света, когда это возможно, от этого шага вперед. Затем промыть 3x с 1x TBS, первые две стирки в течение 30 с, а третьи стирки в течение 15 минут. Добавьте DAPI к последней стирке, если это необходимо и если его нет в монтажной среде. Вылейте секции в камеруную коробку, на три четверти заполненную 1X TBS, и используйте кисть, чтобы приклеить секции к слайду (слайдам). Дайте слайдам высохнуть (~10-15 мин) перед обшивкой с помощью монтажной среды по выбору. Изображение участков с помощью соответствующего микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Флуоресцентная иммуногистохимия с использованием свободно плавающих участков мозга. Показаны области мозга гиппокампа, изучающие экспрессию GFAP у взрослых мышей, которые были помечены с использованием первичного антитела против GFAP, выращенного у кролика, и вторичного антитела Alexa568 против кролика, выращенного у осла. DAPI использовался в последней промывке для маркировки ядер. Ткань разрезали на 40 мкм с помощью криостата. Изображения были сделаны с 10-кратным (верхним) и 40-кратным (нижним) увеличением с использованием лазерного точечного сканирующего конфокального микроскопа. 10x шкала масштаба изображения = 400 мкм. 40x шкала масштаба изображения = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Флуоресцентная иммуногистохимия на низкоэкспрессированных белках с использованием свободно плавающего метода. Показаны области мозга гиппокампа у трансгенной взрослой мыши с низкой экспрессией GFP. Нейроны, экспрессирующие GFP, были помечены с использованием первичного антитела против GFP, выращенного у козы, и вторичного антитела Alexa488 против козы, выращенного у осла. DAPI использовался в последней промывке для маркировки ядер. Ткань разрезали на 40 мкм с помощью криостата. Изображения были сделаны с 40-кратным увеличением с помощью лазерного точечного сканирующего конфокального микроскопа. Шкала шкалы = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Окрашивание крезиловой фиалкой с использованием свободно плавающих участков мозга. С помощью криостата 40 мкм секций от обонятельной луковицы взрослой мыши до мозжечка были собраны, вымыты, установлены на слайдах, окрашены крезиловым фиолетовым и покрыты. Изображения были сделаны с 10-кратным увеличением с использованием перевернутого широкоугольного микроскопа. Шкала = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Флуоресцентная иммуногистохимия с использованием свободно плавающих участков печени. Показаны участки печени, взятые при 40 мкм с использованием криостата трансгенной взрослой мыши, экспрессирующей низкий уровень GFP. Первичное антитело против GFP, выращенное у козы с вторичным антителом Alexa488 против козы, выращенным у осла, использовалось для маркировки клеток, экспрессирующих GFP. DAPI добавлялся к последней промывке для маркировки ядер. Изображения были собраны с помощью лазерного точечного сканирующего конфокального микроскопа с 40-кратным увеличением. Шкала шкалы = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Иммуногистохимия (IHC) является универсальным методом, который стал решающим в выявлении экспрессии и локализации белка в срезах тканей. Этот анализ используется во всем научном сообществе для дальнейшего понимания характеристик тканей на разных стадиях нормальной функции до болезненных состояний. IHC используется в различных областях от клинической диагностики таких заболеваний, как рак, до первоначальных открытий в доклинических исследованиях10,36.

Метод, наиболее часто используемый для выполнения IHC, - это метод, установленный на слайде, при котором секции сразу же приклеиваются к слайду после нарезки. Некоторые преимущества использования этого метода заключаются в том, что исследователи могут обрабатывать очень тонкие участки, необходимые для исследований колокализации белка, и использовать мало раствора для окрашивания участков на слайде. Антитела часто стоят дорого; поэтому такой подход может быть экономичным вариантом, если необходимо обрабатывать несколько разделов. Это также метод выбора для исследователей, использующих свежезамороженные образцы, потому что обработка ткани минимальна, поэтому структурная целостность ткани будет защищена. Использование слайд-монтируемого подхода также было бы целесообразно, если бы только несколько участков были собраны и немедленно окрашены, как это имеет место в клинической патологии. С другой стороны, есть некоторые недостатки, такие как доступ только к открытой стороне ткани во время окрашивания, что ограничивает толщину участка из-за плохого проникновения антител и эффективной промывки. Другим недостатком является то, что после того, как ткань разделена и собрана на слайды, IHC обычно должен быть завершен довольно быстро, а хранение необработанных слайдов занимает много места в морозильной камере. Кроме того, при обработке более крупных экспериментов (например, нескольких областей мозга с несколькими репрезентативными уровнями, подлежащими окрашиванию), этот подход может фактически использовать больше реагентов, быть довольно трудоемким и часто может ограничивать количество слайдов, подлежащих обработке в эксперименте.

Некоторые ограничения, связанные с методом скользящего монтажа, могут быть преодолены методом свободно плавающего окрашивания, который становится все более популярной альтернативой при работе с более толстыми срезами. Хотя этот метод не является новым подходом, по нашему опыту, он является надежным, воспроизводимым и гибким подходом, особенно для окрашивания образцов тканей оптом, что позволяет эффективно обрабатывать крупномасштабные исследования. Исследователи также могут эффективно проводить несколько крупных экспериментов IHC одновременно с этим методом. Кроме того, образцы окрашиваются во суспензию, таким образом, растворы могут проникать в секции со всех углов, что особенно важно для более толстых участков, что часто приводит к более высокому качеству пятна (рисунок 2, рисунок 3 и рисунок 5). Свободно плавающие секции могут быть разрезаны в любом месте от 20 до 50 мкм толщиной37, с более толстыми секциями, полезными для исследователей, чтобы увидеть структуры или клетки на разных равнинах. Например, в ткани мозга более толстые участки позволяют исследователям видеть структуру дендритов и аксонов во всех своих образцах. Возможность собирать более тонкие срезы (20 мкм) еще больше расширяет спектр применений; однако более тонкие срезы могут быть трудными в обращении и часто требуют больше времени и усилий для минимизации повреждений, поэтому секции не должны быть тоньше 40 мкм для объемного окрашивания. Одним из ключевых преимуществ свободно плавающего метода является то, что исследователи могут быстро разделять весь мозг (или другую ткань), собирая все участки в небольшие трубки, причем каждая аликвота имеет репрезентативный срез для всех различных областей мозга, что позволяет исследователям быстро окрашивать весь мозг. Трубки, содержащие срезы, могут храниться в криопротекторе при -80 °C в течение нескольких лет33, при этом аликвоты не занимают много места в морозильной камере, что эффективно позволяет исследователям создавать «библиотеку тканей». Этот метод также уменьшает количество потраченных впустую материалов, включая слайды, крышки и особенно антитела, которые могут быть легко восстановлены и сохранены для повторного использования, а также драгоценные ткани животных, поскольку секции могут храниться и сохраняться столько, сколько захотят пользователи.

Свободно плавающий подход и протокол, представленный здесь, также дают исследователям возможность легко модифицировать протокол или перепрофилировать ресурсы. Например, собранные участки могут быть использованы для многих различных гистохимических пятен в дополнение к иммунофлуоресценции с простыми модификациями протокола, такими как хромогенный IHC, гематоксилин и эозин (H & E), крезиловый фиолетовый (рисунок 4) и RNAscope38. Хромогенный IHC позволяет визуализировать экспрессию антигена, когда растворимый субстрат превращается ферментом, конъюгированным во вторичное антитело в нерастворимый хромогенный продукт. Двумя наиболее часто используемыми ферментами являются пероксидаза хрена (HRP), которая превращает 3,3' диаминобензидин (DAB) в темно-коричневый конечный продукт, и щелочная фосфатаза (AP), которая превращает субстрат 3-амино-9-этилкарбазола (AEC) в красный продукт39. Мы регулярно выполняем окрашивание крезиловой фиалкой и используем свободно плавающие участки для изучения грубой организации мозга и морфологии40. Мы также успешно применили этот протокол ко многим различным тканям, включая мозг, печень, сердце, почки и селезенку (рисунок 5). Другие исследователи также успешно использовали этот метод для периферических тканей, включая печень, почки и яичники 22,23,24.

Основной проблемой при использовании свободно плавающей техники является возможность структурного повреждения участков тканей, особенно срезов мозга, потому что на протяжении всего протокола образцы находятся на шейкерах и ротаторах почти на каждом этапе, чтобы гарантировать, что они равномерно вымываются, блокируются и окрашиваются. Иногда определенные области мозга могут отделяться, особенно на мозжечковом уровне; однако использование атласа мозга и формы увеличения, такой как ювелирная лампа, во время процесса монтажа может быть полезно для объединения секций. Эту проблему обычно можно предотвратить путем бережного обращения с образцами и поддержания вращающихся машин на правильной, низкой настройке.

В заключение мы представляем установленную свободно плавающую технику IHC, которая оказалась незаменимой, надежной, гибкой и эффективной модальностью, которую мы регулярно используем для визуализации экспрессии и локализации белка, а также структуры тканей в различных тканях. Протокол в настоящем документе может быть легко изменен в соответствии с индивидуальными потребностями исследований, что делает его ценным для научного сообщества.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нечего раскрывать

Acknowledgments

Мы хотели бы отметить Национальный институт по проблемам старения (K99/R00 AG055683 для JMR), Институт неврологии Джорджа и Энн Райан (EP, GC, JMR), Фармацевтический колледж при Университете Род-Айленда (EP, GC, JMR) и Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Мы благодарим докторанта Ребекку Сенфт, обучающуюся у профессора Сьюзан Дымецки, кафедра генетики Гарвардской медицинской школы, за то, что она познакомила нас со свободно плавающим методом. Некоторые изображения, используемые на рисунке 1, были получены из «свободных для использования, совместного использования или изменения, даже коммерческих» источников: мыши и микроцентрифужная трубка (Pixabay), мозг мыши (Jonas Töle, Wikimedia Commons), секция криостата и мозга мыши (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), стеклянный контейнер (OpenClipart, FreeSvg.org) и микроскоп (Тереза Нотт, Open Clip Art Library).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 3513
6-well plates Corning 3516
Clear nail polish User preference N/A
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Embedding molds Thermo Scientific 1841
Ethylene glycol User preference N/A
Formalin solution Fisher Scientific SF98-4
Horse serum, heat inactivated Gibco 26050088
Microscope slide boxes Electron Microscopy Services 71370
PBS User preference N/A
Primary antibody User preference N/A
Rectangular Coverslips VWR 48393-081 24 x 50 mm
Rectangular staining dish Electron Microscopy Services 70312
Round artist paintbrush #2 Princeton Select Series 3750R Brand not important
Secondary antibody User preference N/A
Specimen matrix for embedding OCT Tissue-Tek, Sakura 4583
Stain tray – slide staining system Electron Microscopy Services 71396-B Use dark lid
Sucrose User preference N/A
Superfrost Plus Micro Slides VWR 48311-703
TBS User preference N/A
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vectashield antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000 Non-hardening
Well inserts for 12-well plates Corning Netwells 3477
Well inserts for 6-well plates Corning Netwells 3479
Whatman filter paper Millapore-Sigma WHA1440042

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
  2. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  3. Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
  4. Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374 (1999).
  5. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  6. Hermersdörfer, H. Immunocytochemistry. A Practical Approach. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).
  7. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of Immunohistochemistry. Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  8. Coons, A. H. International Review of Cytology. International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).
  9. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
  10. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).
  11. Li, A., Yang, D. H. Methods in Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. 2108, Clifton, N.J. 43-55 (2020).
  12. Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
  13. Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
  15. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, Clifton, N.J. 55-61 (2010).
  16. van der Loos, C. A focus on fixation. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  19. Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
  20. Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
  21. Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
  22. Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
  23. Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
  24. Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
  25. Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
  26. Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
  27. Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
  28. Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
  29. Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
  30. Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
  31. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
  32. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
  33. Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
  34. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  35. Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
  36. Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
  37. Burry, R. W. Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
  38. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
  39. Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , Springer. 207-262 (1981).
  40. Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).

Tags

Биология выпуск 162 гистохимия иммунофлуоресценция иммуногистохимия свободно плавающий мозг старение нейродегенерация экспрессия белка визуализация белка маркировка антител
Гистологические окрашивания с использованием свободно плавающих участков тканей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross,… More

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (162), e61622, doi:10.3791/61622 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter