Summary
Die Free-Floating-Technik ermöglicht es Forschern, histologisch basierte Färbungen einschließlich Immunhistochemie an festen Gewebeschnitten durchzuführen, um biologische Strukturen, Zelltypen sowie Proteinexpression und -lokalisation sichtbar zu machen. Dies ist eine effiziente und zuverlässige histochemische Technik, die für die Untersuchung einer Vielzahl von Geweben wie Gehirn, Herz und Leber nützlich sein kann.
Abstract
Die Immunhistochemie ist eine weit verbreitete Technik zur Visualisierung spezifischer Gewebestrukturen sowie der Proteinexpression und -lokalisation. Zwei alternative Ansätze werden häufig verwendet, um die Gewebeschnitte während des Färbeverfahrens zu handhaben, ein Ansatz besteht darin, die Abschnitte direkt auf Glasobjektträgern zu montieren, während ein zweiter Ansatz, der freischwebende Ansatz, es ermöglicht, feste Abschnitte zu erhalten und zu färben, während sie in Lösung suspendiert sind. Obwohl Slide-Mounted- und Free-Floating-Ansätze zu ähnlichen Ergebnissen führen können, ermöglicht die Free-Floating-Technik eine bessere Penetration von Antikörpern und sollte daher die Methode der Wahl sein, wenn dickere Schnitte für die 3D-Rekonstruktion des Gewebes verwendet werden sollen, zum Beispiel wenn der Fokus des Experiments darauf liegt, Informationen über dendritische und axonale Projektionen in Hirnregionen zu gewinnen. Da die Schnitte in Lösung gehalten werden, können in einem einzigen Aliquot problemlos 30 bis 40 Schnitte aufgenommen werden, deren Handhabung insbesondere bei groß angelegten biomedizinischen Studien weniger aufwendig ist. Hier zeigen wir, wie die Free-Floating-Methode auf die fluoreszierende immunhistochemische Färbung angewendet werden kann, wobei der Schwerpunkt auf Hirnschnitten liegt. Wir werden auch diskutieren, wie die Free-Floating-Technik leicht modifiziert werden kann, um den individuellen Bedürfnissen der Forscher gerecht zu werden und an andere Gewebe sowie andere histochemische Färbungen wie Hämatoxylin, Eosin und Kresylviolett anzupassen, solange die Gewebeproben richtig fixiert werden, typischerweise mit Paraformaldehyd oder Formalin.
Introduction
Die Immunfärbung ist eine populäre Forschungspraxis, die vor 130 Jahren mit der Entdeckung von Serumantikörpern im Jahr 1890 durch von Behring1 begann. Während des frühen 20. Jahrhunderts wurden Farbstoffe an Antigene und später an Antikörper gebunden, um Reaktionen zu quantifizieren und zu visualisieren1, und 1941 entwickelte Albert Coons die ersten fluoreszierenden Antikörpermarkierungen, eine Entdeckung, die die Lichtmikroskopie revolutionierte 2,3. Der Begriff "Immunfärbung" umfasst viele Techniken, die nach diesem Prinzip entwickelt wurden, einschließlich Western Blot, Durchflusszytometrie, ELISA, Immunzytochemie und Immunhistochemie 3,4. Western Blot weist das Vorhandensein bestimmter Proteine aus Gewebe- oder Zellextraktennach 5. Proteine werden mittels Gelelektrophorese nach Größe getrennt, auf eine Membran übertragen und mit Antikörpern untersucht. Diese Technik zeigt das Vorhandensein von Protein an und wie viel Protein vorhanden ist. Es gibt jedoch keine Informationen über die Lokalisation des Proteins in Zellen oder Geweben. Eine andere Methode, die Immunzytochemie (ICC), markiert Proteine in Zellen, typischerweise Zellen, die in vitro kultiviert werden. ICC zeigt sowohl die Proteinexpression als auch die Lokalisation innerhalb zellulärer Kompartimente6. Um ein spezifisches Protein auf Gewebeebene zu erkennen und sichtbar zu machen, wird die Immunhistochemie (IHC) eingesetzt.
IHC ist eine Methode, die Forscher verwenden, um spezifische Antigene im Gewebe zu bekämpfen und dabei die chemischen Eigenschaften des Immunsystems zu nutzen 7,8. Durch die Erzeugung spezifischer primärer und sekundärer Antikörper, die entweder an ein Enzym oder einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden sind, können interessante Antigene in den meisten Geweben markiert und nachgewiesen werden (wie in Mepham und Britten beschrieben)9. Der Begriff "Immunhistochemie" an sich spezifiziert nicht die Markierungsmethode, die verwendet wird, um das interessierende Antigen zu enthüllen; Daher wird diese Terminologie oft mit der Detektionstechnik kombiniert, um die Markierungsmethode klar abzugrenzen: chromogene Immunhistochemie (CIH), um anzuzeigen, wann der sekundäre Antikörper an ein Enzym wie Peroxidase konjugiert ist; oder fluoreszierende IHC, um anzuzeigen, wann der sekundäre Antikörper an ein Fluorophor wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Tetramethylrhodamin (TRITC) konjugiert ist. Die Selektivität der IHC ermöglicht es Klinikern und Forschern, die Proteinexpression und -verteilung in verschiedenen Geweben über verschiedene Gesundheits- und Krankheitszustände hinweg zu visualisieren10. Im klinischen Bereich wird IHC häufig zur Diagnose von Krebs sowie zur Bestimmung von Unterschieden bei verschiedenen Krebsarten eingesetzt. IHC wurde auch verwendet, um verschiedene Arten von mikrobiellen Infektionen im Körper zu bestätigen, wie Hepatitis B oder C11. In der biomedizinischen Forschung wird IHC häufig verwendet, um die Proteinexpression in Geweben abzubilden und ist wichtig für die Identifizierung abnormaler Proteine, die in Krankheitszuständen beobachtet werden. Zum Beispiel geht die Neurodegeneration oft mit einer Anhäufung abnormaler Proteine im Gehirn einher, wie z. B. Αβ-Plaques und neurofibrilläre Verwicklungen bei der Alzheimer-Krankheit. Tiermodelle werden dann oft entwickelt, um diese pathologischen Zustände nachzuahmen, und IHC ist eine Methode, die Forscher verwenden, um die interessierenden Proteine zu lokalisieren und zu quantifizieren10,12,13. Im Gegenzug können wir mehr über die Ursachen dieser Krankheiten und die Komplikationen, die mit ihnen auftreten, erfahren.
Es gibt viele Schritte, die bei der Durchführung von IHC erforderlich sind. Zuerst wird das interessierende Gewebe gesammelt und für die Färbung vorbereitet. Die meisten Forscher präparieren wohl fixierte Gewebeproben, wobei die Perfusion des Fixiermittels über das Kreislaufsystem optimal ist, da es die Morphologie bewahrt14,15. Eine nachträgliche Fixierung von Gewebeproben kann ebenfalls verwendet werden, kann jedoch zu weniger als idealen Ergebnissen führen16. Vernetzende Fixiermittel wie Formaldehyd wirken, indem sie chemische Bindungen zwischen Proteinen im Gewebeherstellen 17. Fixiertes Gewebe wird dann mit einem Mikrotom in sehr dünne Schichten oder Abschnitte geschnitten, wobei viele Forscher es vorziehen, gefrorene Abschnitte mit einem Kryostaten zu sammeln. Von dort wird das Gewebe gesammelt und entweder direkt auf einen Objektträger montiert (Slide-Mounted-Methode) oder in einer Lösung suspendiert (Free-Floating-Methode), wie z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)18. Die verwendete Erfassungsmethode wird auf der Grundlage der Bedürfnisse des Forschers festgelegt, wobei jede dieser beiden Methoden ihre eigenen Vor- und Nachteile aufweist.
Die Slide-Mounted-Methode ist mit Abstand die am weitesten verbreitete, mit einem wichtigen Vorteil, dass sehr dünne Schnitte (10-14 μm) hergestellt werden können, was z.B. wichtig ist, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Es gibt auch eine minimale Handhabung der Probe, was eine mögliche Schädigung der strukturellen Integrität des Gewebesverringert 19. Forscher verwenden diese Technik häufig mit frischem gefrorenem Gewebe (Gewebe, das sofort mit Trockeneis, Isopentan usw. eingefroren wird), das im Vergleich zu festem Gewebe sehr empfindlich ist und viel Sorgfalt walten lässt, um ein Auftauen der Probe zu verhindern. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von auf Objektträgern montierten Abschnitten besteht darin, dass in der Regel keine großen Mengen an Lösungen für die Färbung benötigt werden4. So können Forscher eine kleinere Menge teurer Antikörper oder anderer Chemikalien verwenden, um die Färbung zu vervollständigen. Darüber hinaus ist es möglich, Schnitte aus mehreren verschiedenen Versuchsgruppen auf demselben Dia zu montieren, was insbesondere bei der Bildaufnahme von Vorteil sein kann. Auf der anderen Seite gibt es einige Nachteile bei der Verwendung von Objektträgerschnitten, vor allem, dass der Gewebeschnitt auf dem Objektträger haftet, wodurch das Eindringen von Antikörpern auf eine Seite des Abschnitts beschränkt wird, was die Schnittdicke und die 3D-Darstellung des Gewebes begrenzt. Es kann auch vorkommen, dass sich beim Waschen die Ränder des Gewebes und ganze Abschnitte vom Objektträger lösen und das gesamte Experiment unbrauchbar machen. Darüber hinaus muss die IHC in der Regel relativ schnell durchgeführt werden, wenn der Objektträgeransatz verwendet wird, um einen Abbau des Antigenepitops 20,21 zu vermeiden, wobei unverarbeitete Objektträger typischerweise bei -20 oder -80 °C gelagert werden, oft abgedeckt und horizontal oder in Objektträgerkästen gelagert werden, was zu einem relativ großen Speicherbedarf führt. Schließlich kann die Slide-Mounted-Technik auch zeitaufwendig sein, wenn Forscher eine große Anzahl von Objektträgern handhaben müssen, um eine große Anzahl von Gewebeschnitten zu verarbeiten.
Aufgrund einiger dieser Herausforderungen bei der Verwendung der Slide-Mounted-Methode ist eine Modifikation, die als Free-Floating-Methode bezeichnet wird, zu einer beliebten Alternative geworden. Diese Technik kam in den 1960-70er Jahren in die Literatur 22,23,24 und gewann in den 1980er Jahren an Popularität 25,26,27,28,29 und ist heute eine etablierte Methode, bei der die Färbung auf den gesammelten Abschnitten in Suspension durchgeführt wird, anstatt an einem Objektträger zu haften 12,30,31 . Die Free-Floating-Methode wird nicht empfohlen, wenn die Gewebeschnitte kleiner als 20 μm sind. Unserer Erfahrung nach ist es jedoch der Ansatz der Wahl, wenn dickere (40-50 μm) Abschnitte gefärbt werden sollen. Ein deutlicher Vorteil besteht darin, dass Antikörper frei schwebende Abschnitte aus allen Winkeln durchdringen können und aufgrund eines effektiveren Waschens weniger Hintergrundfärbung erzeugen, was zu einer besseren Signalübertragung bei der Bildgebung führt. Darüber hinaus werden die Schnitte nach der Verarbeitung auf die Objektträger montiert, wodurch die Möglichkeit einer Gewebeablösung ausgeschlossen wird und die Verweildauer des Kryostaten verringert wird. Die Free-Floating-Methode kann auch viel weniger arbeitsintensiv sein, insbesondere für groß angelegte biomedizinische Studien. Zum Beispiel ist es möglich, viele (18-40) Schnitte aus derselben Probe zusammen in derselben Vertiefung zu färben, was Zeit bei der Durchführung der Wasch- und Antikörperinkubationsschritte spart. Da mit diesem Ansatz eine größere Anzahl (12-16) von Schnitten pro Folie montiert werden kann, ist es für den Forscher oft bequemer und schneller, Schnitte anzuzeigen und abzubilden. Insbesondere bei der Montage von Gewebeschnitten auf den Objektträgern können Abschnitte befestigt und abgenommen werden, bis die gewünschte Orientierung erreicht ist. Die Forscher verwenden auch oft etwas niedrigere Konzentrationen von Antikörpern mit der Free-Floating-Methode, und da die Inkubationen in Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt werden, können die Antikörper leicht gesammelt und mit Natriumazid für die Wiederverwendung konserviert werden (siehe Schritt 5.1). Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Schnitte direkt bei -80 °C in kleinen Mikrozentrifugenröhrchen mit kryoprotektiver Lösung32 gelagert werden können, wodurch der Lagerraum minimiert und die Langlebigkeit der Proben33 maximiert wird. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass die Abschnitte viel gehandhabt werden und daher anfällig für Beschädigungen sind. Dies kann jedoch durch niedrige Schüttel- und Drehgeschwindigkeiten sowie durch eine angemessene Schulung der Forscher für den Transfer der Proben und die Montage der Abschnitte auf den Objektträgern gemildert werden.
Zusammengenommen ist IHC ein etabliertes, essentielles Werkzeug für die Visualisierung und Lokalisierung der Proteinexpression sowohl in der klinischen als auch in der biomedizinischen Forschung. Free-floating-IHC ist eine effiziente, flexible und wirtschaftliche Methode, insbesondere bei der Durchführung umfangreicher histologischer Studien. Hier stellen wir ein zuverlässiges, frei schwebendes fluoreszierendes IHC-Protokoll für die wissenschaftliche Gemeinschaft vor, das entsprechend für chromogene IHC- und andere Färbungen wie Hämatoxylin- und Eosin- oder Kresylviolettfärbung angepasst werden kann.
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Protocol
1. Gewebevorbereitung für die Kryosektion
- Fixiertes Gewebe in eine geeignete Einbettform einbetten (siehe Materialtabelle), um einen Probenblock mit einer geeigneten Probenmatrix zu erzeugen (siehe Materialtabelle) und auf Trockeneis einfrieren. Lagern Sie Probenblöcke bei -80 °C, bis sie zum Schneiden bereit sind.
ANMERKUNG: Festsitzende Gewebe werden in der Regel durch Perfusionierung von erwachsenen (ca. 2,5 – 30 Monate alten) männlichen oder weiblichen Nagetieren (Maus oder Ratte)34 in Übereinstimmung mit der verfügbaren ethischen Erlaubnis mit einem geeigneten Fixiermittel (z. B. 10 % Formalin) hergestellt, gefolgt von nachfixierenden Geweben in demselben Fixiermittel für 12 h bei 4 °C, wobei das Gewebe dreimal mit 1x PBS gewaschen wird. und Gewebe in 15% und dann 30% Saccharose in 1x PBS über Nacht oder bis das Gewebe35 sinkt. Forscher können versuchen, dieses allgemeine Protokoll an verschiedene Entwicklungsstadien anzupassen.
2. Kryosektion
- Wenn Sie zum Schnitt bereit sind, akklimatisieren Sie die Proben vor dem Schneiden mindestens 1-2 h im Kryostaten, um ein Zerbrechen des Gewebes zu verhindern.
- Schneiden Sie das Gewebe mit einem Kryostaten in Abschnitte (20-50 μm) und sammeln Sie es in 6- oder 12-Well-Einsätzen (siehe Materialtabelle), die mit 1x PBS-Lösung gefüllt sind.
HINWEIS: Abhängig von der Dicke des Abschnitts, der Menge des zu sammelnden Gewebes und der Anzahl der verwendeten Vertiefungseinsätze enthält jede Vertiefung eine variable Anzahl von Abschnitten, die sich über etwa 10 bis 40 Schichten erstreckt. Wenn zum Beispiel ein ganzes Gehirn bei 40 μm geschnitten wird, werden in jeder Vertiefung etwa 18-24 Abschnitte mit 12-Well-Einsätzen gesammelt. Außerdem können 20-μm-Abschnitte etwas schwierig zu handhaben sein, daher werden 40 μm für die Bulk-Färbung empfohlen (siehe Diskussion).
3. Speichern von Abschnitten
- Nach dem Sammeln die Abschnitte mit frisch zubereitetem 1x PBS für 5 min waschen. Wiederholen Sie 3 mal.
- Die Schnitte werden in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, die mit 1-1,5 mL Aufbewahrungslösung gefüllt sind (für 250 ml 70 g Saccharose, 75 ml Ethylenglykol mischen und mit 0,1 M Phosphatpuffer zum Volumen bringen).
- Bei -80 °C bis zur Färbung lagern.
4. Färbung Tag I
- Proben aus dem Gefrierschrank nehmen und bei Raumtemperatur (RT) für 10 - 20 min äquilibrieren.
- Gießen Sie Abschnitte in einen Brunneneinsatz in einer 6-Well-Platte, um die Speicherlösung von den Abschnitten zu trennen.
- Schieben Sie den Well-Einsatz in eine andere Vertiefung, die ca. 6 ml 1x TBS enthält. Waschen Sie 3 mal mit 1x TBS für jeweils 5 min auf einem Orbitalschüttler mit niedriger Geschwindigkeit bei RT.
- Während der Schnitte gewaschen werden, bereiten Sie 7 ml (pro Probe) einer blockierenden permeabilisierenden Lösung vor, die aus 1x TBS mit 0,3% Triton X-100 und 3% normalem Serum (z. B. normalem Pferdeserum) besteht. Blockieren Sie Abschnitte für 30 Minuten bei RT auf Orbitalschüttler mit niedriger Geschwindigkeit.
HINWEIS: Die Blockierung mit Seren verhindert die unspezifische Bindung von Antikörpern an Gewebe oder unspezifische Fc-Rezeptoren – ein Serum, das der Spezies des sekundären Antikörpers entspricht, wird empfohlen, aber wenn nicht verfügbar, kann ein normales Serum von einer anderen Spezies als dem primären Antikörper-Wirtstier verwendet werden. Das Reinigungsmittel Triton X-100 ermöglicht eine bessere Penetration der Antikörper durch Permeabilisierung des Gewebes. - Bereiten Sie 1 ml pro Probe einer primären Antikörperlösung, bestehend aus ausgewählten Primärantikörpern (entsprechend verdünnt) in 1x TBS mit 0,3 % Triton X-100 und 1 % normalem Serum vor (siehe Hinweis zu Schritt 4.4). Transferschnitte aus dem Bohrloch in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das die primäre Antikörperlösung enthält, um an die interessierenden Antigene zu binden.
HINWEIS: Es können mehrere primäre Antikörper verwendet werden (die in verschiedenen Wirtsspezies erzeugt werden). - Das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnitten wird mit niedriger Drehzahl (z. B. Drehzahl 7 U/min) auf einen rotierenden Mischer gestellt und über Nacht für 12-16 h bei 4 °C inkubiert.
5. Färbetag II
- Gießen Sie am nächsten Tag Schnitte in eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte, um die Abschnitte von der primären Antikörperlösung zu trennen.
HINWEIS: Antikörperlösung kann gesammelt und wiederverwendet werden; Fügen Sie 0,02% (w/v) Natriumazid hinzu, um das mikrobielle Wachstum zu hemmen. - Sektionen 3 mal mit 1x TBS bei RT waschen (30 s für die ersten 2 Wäschen und 10 min für die Endwäsche).
- Bereiten Sie 1 ml pro Probe einer sekundären Antikörperlösung, bestehend aus geeigneten sekundären Antikörpern (entsprechend verdünnt) in 1x TBS mit 0,3% Triton X-100 und 1% normalem Serum (Lichtschutzlösung) vor.
HINWEIS: Die indirekte Markierung mit einem konjugierten sekundären Antikörper verstärkt das Signal und ermöglicht eine kolorimetrische oder fluoreszierende Visualisierung des Proteinziels. - Überführen Sie die Schnitte in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit sekundärer Antikörperlösung. Inkubieren Sie für 2 h bei RT auf einem Orbitalschüttler mit niedriger Geschwindigkeit (Abschirmlösung vor Licht).
- Gießen Sie Schnitte in eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte, um Abschnitte von der sekundären Antikörperlösung zu trennen.
- Um die Proben weiterhin vor Licht zu schützen, waschen Sie 2 mal mit 1x TBS für 30 s bei RT. Anschließend 15 min in 1x TB waschen, nach Belieben DAPI (1-0,1 μg/ml) hinzufügen.
6. Montage
- Gießen Sie Schnitte in eine rechteckige histologische Glaskammer, die zu drei Vierteln mit 1x TBS gefüllt ist.
- Tauchen Sie einen Glasträger in den 1x TBS und verwenden Sie einen feinen Pinsel, um die Abschnitte in Richtung der Folie zu locken.
- Klopfen Sie die Abschnitte vorsichtig auf die Schiene und achten Sie darauf, dass keine Falten oder Falten vorhanden sind.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Abschnitte auf den Schienen montiert sind.
ANMERKUNG: Wenn z.B. ein ganzes Gehirn bei 40 μm geschnitten wird, gesammelt in 12-Well-Inserts, wobei ein Aliquot 18-24 Abschnitte enthält; Slices werden in der Regel auf 1-2 Folien montiert, aber je nach Präferenz des Forschers können auch weniger Abschnitte pro Folie montiert werden.
7. Coverslipping
- Nachdem die Abschnitte auf den Objektträgern getrocknet sind, etwa 10-15 Minuten bei RT oder bis die Abschnitte undurchsichtig aussehen (denken Sie daran, die Objektträger vor Licht zu schützen), tragen Sie ein geeignetes wässriges Einbettmedium auf (aushärtend oder nicht aushärtend). Antifading wird bevorzugt, wenn ein fluoreszierender konjugierter sekundärer Antikörper verwendet wird.
HINWEIS: Die Fluoreszenzqualität kann bei Verwendung eines aushärtenden Einbettmediums geringer sein, aber die Objektträger sollten länger halten. - Legen Sie mit einer Pinzette ein Deckglas auf das Medium. Decken Sie das Gerät mit Filterpapier ab und drücken Sie es fest an, um überschüssiges Befestigungsmedium zu entfernen.
HINWEIS: Wenn Sie eine nicht aushärtende Halterung verwenden, streichen Sie die Kanten des Deckglas-Objektträgers mit klarem Nagellack zum Versiegeln. - Bildausschnitte mit einem geeigneten Mikroskop. In einem dunklen Schieberkasten bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Schnitte können mit einer Vielzahl von Mikroskopen abgebildet werden, z. B. mit konfokaler und inverser Laserscanning- oder aufrechter Weitfeldfluoreszenz, bei Vergrößerungen (z. B. 10x, 20x, 40x), je nach den Bedürfnissen des Forschers.
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Representative Results
Das Gesamtschema der Verwendung der Free-Floating-Methode zur Durchführung eines fluoreszierenden immunhistochemischen Assays ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein repräsentatives Beispiel für eine fluoreszierende IHC unter Verwendung der Free-Floating-Methode im Gehirn von Mäusen, bei der die Expression des sauren Gliafibrillenproteins (GFAP) untersucht wird, ist in Abbildung 2 sowohl bei niedrigerer als auch bei höherer Vergrößerung dargestellt, um die Gesamtqualität der Färbung zu veranschaulichen. Dieser Ansatz eignet sich auch, um niedrig exprimierende Proteine aufzudecken, wobei ein Beispiel aus einem GFP-schwach exprimierenden transgenen Mäusegehirn in Abbildung 3 gezeigt wird. Die Free-Floating-Methode kann auch in anderen histochemischen Färbeprotokollen, wie z. B. Kresylviolett, wie in Abbildung 4 gezeigt, verwendet werden, indem die Schritte 1 bis 4.3 des Protokolls ausgeführt werden und dann die Abschnitte wie in Schritt 6 beschrieben montiert werden. Danach können die Schnitte mit jeder Färbung bearbeitet werden, die schlittenmontierte Schnitte erfordert. Wenn Sie dieses Protokoll für chromogene IHC verwenden, befolgen Sie das Protokoll aus den Schritten 1 bis 5.6 (fügen Sie DAPI nicht zum letzten Waschgang hinzu) und passen Sie es entsprechend an, wenn Sie einen Amplifikationsschritt (z. B. Avidin-Biotin-Komplex) verwenden. Ersetzen Sie den Puffer durch ein Chromagen/Substrat-Reagenz und inkubieren Sie 5-20 Minuten, bis das Gewebe die gewünschte Farbe annimmt. Die Reaktion kann überwacht werden, indem das Gewebe regelmäßig mit einem Mikroskop mit geringer Leistung überprüft wird. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie den Vertiefungseinsatz mit den Abschnitten in einen frischen Puffer schieben und sie dreimal mindestens 5 Minuten lang waschen. Fahren Sie mit Schritt 6 fort, um die Abschnitte auf Objektträgern zu montieren, so dass die Abschnitte mindestens 3-4 Stunden auf einem Objektträgerwärmer trocknen können. Dehydrieren Sie die Objektträger mit steigenden Ethanolkonzentrationen (d. h. 70 %, 90 %, 95 %, 99,5 %, jeweils 2-5 Minuten), gefolgt von Xylol (5-10 Minuten) und decken Sie sie dann mit einem Hartschalenmedium (z. B. Entellan) ab, so dass die Objektträger mindestens 1-2 Stunden in einem belüfteten Bereich trocknen können. Wenn der Hintergrund zu hoch ist, wird die endogene Peroxidaseaktivität für 15 min bei RT mit 3%H2O2in 1x TBS gelöscht, gefolgt von drei Pufferwäschen zu je 15-20 min, bevor es blockiert wird (Schritt 4.4). Mehrere periphere Gewebe sind ebenfalls für die Verwendung dieser Technik geeignet, ohne dass Änderungen des Protokolls erforderlich sind, wobei ein Beispiel von Leberschnitten einer GFP-exprimierenden Maus in Abbildung 5 gezeigt wird.
Abbildung 1: Flussdiagramm des frei schwebenden fluoreszierenden immunhistochemischen Assays. Das interessierende Organ (vorzugsweise fixiertes Gewebe) wird seziert und das Gewebe mit einer Probenmatrix (siehe Materialtabelle) in Einbettungsformen eingebettet, anschließend auf Trockeneis eingefroren und bei -80 °C gelagert. Schneiden Sie Gewebe mit einem Kryostaten bei 20-50 μm und sammeln Sie Schnitte in Well-Inserts (siehe Materialtabelle), die mit 1x PBS gefüllt sind. Waschen Sie die Abschnitte mit einem Orbitalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit 3x für jeweils 5 Minuten in 1x PBS. Lagern Sie an dieser Stelle zusätzliche Abschnitte im Lagerpuffer bei -80 °C, bis sie benötigt werden. Die restlichen Abschnitte 3x für 5 min mit 1x TBS waschen. Blockieren Sie Abschnitte für 30 min bei RT-Schütteln bei niedriger Geschwindigkeit. Primäre Antikörperlösung vorbereiten und Schnitte über Nacht in Mikrozentrifugenröhrchen bei 4 °C (12-14 h) inkubieren. Am Folgetag Waschpartien mit 1x TBS 3x, die ersten beiden Wäschen für 30 s, mit der dritten Wäsche für 10 min. Inkubieren Sie Schnitte in sekundärer Antikörperlösung in Mikrozentrifugenröhrchen für 2 Stunden bei RT und achten Sie darauf, die Schnitte nach Möglichkeit vor Licht zu schützen. Dann 3x mit 1x EL waschen, die ersten zwei Wäschen für 30 s und die dritte Wäsche für 15 min. Fügen Sie DAPI zur letzten Wäsche hinzu, falls gewünscht und falls nicht im Montagemedium vorhanden. Gießen Sie Abschnitte in eine Kammerbox, die zu drei Vierteln mit 1x TBS gefüllt ist, und verwenden Sie einen Pinsel, um Abschnitte auf die Objektträger zu kleben. Lassen Sie die Objektträger trocknen (~10-15 min), bevor Sie mit dem Befestigungsmedium Ihrer Wahl abgedeckt werden. Bildausschnitte mit einem geeigneten Mikroskop. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Fluoreszierende Immunhistochemie unter Verwendung von frei schwebenden Hirnschnitten. Hippocampus-Hirnregionen, die die GFAP-Expression bei erwachsenen Mäusen untersuchen, werden gezeigt und mit einem Anti-GFAP-Primärantikörper, der bei Kaninchen gezüchtet wurde, und einem Anti-Kaninchen-Alexa568-Sekundärantikörper, der bei Eseln gezüchtet wurde, markiert. DAPI wurde in der letzten Wäsche verwendet, um Kerne zu markieren. Das Gewebe wurde bei 40 μm mit einem Kryostaten geschnitten. Die Bilder wurden mit 10-facher (oberer) und 40-facher (unterer) Vergrößerung mit einem konfokalen Laserpunkt-Scanning-Mikroskop aufgenommen. 10-facher Bildmaßstab = 400 μm. 40-facher Bildmaßstab = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Fluoreszierende Immunhistochemie an niedrig exprimierten Proteinen mit der Free-Floating-Methode. Hippocampus-Hirnregionen einer niedrig exprimierenden GFP-transgenen erwachsenen Maus sind gezeigt. Neuronen, die GFP exprimieren, wurden mit einem primären Anti-GFP-Antikörper, der in einer Ziege gezüchtet wurde, und einem Anti-Ziegen-Alexa488-Sekundärantikörper, der in einem Esel gezüchtet wurde, markiert. DAPI wurde in der letzten Wäsche verwendet, um Kerne zu markieren. Das Gewebe wurde bei 40 μm mit einem Kryostaten geschnitten. Die Bilder wurden mit 40-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Laserpunkt-Scanning-Mikroskop aufgenommen. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Kresylviolett-Färbung mit frei schwebenden Hirnschnitten. Mit einem Kryostaten wurden 40 μm-Schnitte vom Riechkolben der erwachsenen Maus bis zum Kleinhirn gesammelt, gewaschen, auf Objektträger montiert, mit Kresylviolett gefärbt und abgedeckt. Die Bilder wurden mit 10-facher Vergrößerung mit einem inversen Weitfeldmikroskop aufgenommen. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Fluoreszierende Immunhistochemie unter Verwendung von frei schwebenden Leberschnitten. Es werden Leberschnitte gezeigt, die bei 40 μm mit einem Kryostaten einer transgenen erwachsenen Maus entnommen wurden, die niedrige GFP-Konzentrationen exprimierten. Ein primärer Anti-GFP-Antikörper, der in einer Ziege gezüchtet wurde, und ein Anti-Ziegen-Alexa488-Sekundärantikörper, der in einem Esel gezüchtet wurde, wurden verwendet, um Zellen zu markieren, die GFP exprimieren. DAPI wurde der letzten Wäsche hinzugefügt, um Kerne zu markieren. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Laserpunkt-Scanning-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung aufgenommen. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Immunhistochemie (IHC) ist eine vielseitige Technik, die für die Identifizierung der Proteinexpression und -lokalisation in Gewebeschnitten von entscheidender Bedeutung ist. Dieser Assay wird in der gesamten wissenschaftlichen Gemeinschaft verwendet, um die Eigenschaften von Gewebe über Stadien der normalen Funktion bis hin zu Krankheitszuständen besser zu verstehen. IHC wird in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt, von der klinischen Diagnose von Krankheiten wie Krebs bis hin zu ersten Entdeckungen in der präklinischen Forschung10,36.
Die am häufigsten verwendete Technik zur Durchführung der IHC ist die Slide-Mounted-Methode, bei der die Abschnitte nach dem Schneiden sofort auf den Schlitten geklebt werden. Ein Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Forscher sehr dünne Abschnitte behandeln können, die für Proteinkolokalisationsstudien benötigt werden, und wenig Lösung verwenden, um die Abschnitte pro Objektträger zu färben. Antikörper sind oft teuer; Daher kann dieser Ansatz eine wirtschaftliche Option sein, wenn nur wenige Abschnitte bearbeitet werden sollen. Dies ist auch die Methode der Wahl für Forscher, die frisch gefrorene Proben verwenden, da die Handhabung des Gewebes minimal ist und somit die strukturelle Integrität des Gewebes geschützt wird. Die Verwendung des Slide-Mounted-Ansatzes wäre auch dann sinnvoll, wenn nur wenige Schnitte entnommen und sofort gefärbt werden sollen, wie dies in der klinischen Pathologie der Fall ist. Auf der anderen Seite gibt es einige Nachteile, wie z.B. dass während der Färbung nur die exponierte Seite des Gewebes erreicht wird, wodurch die Schnittdicke aufgrund der schlechten Antikörperpenetration und des effektiven Waschens begrenzt wird. Ein weiterer Nachteil ist, dass, sobald das Gewebe geschnitten und auf Objektträgern gesammelt wurde, IHC normalerweise ziemlich schnell abgeschlossen werden muss, wobei die Lagerung von unverarbeiteten Objektträgern viel Gefrierraum in Anspruch nimmt. Darüber hinaus kann dieser Ansatz bei der Verarbeitung größerer Experimente (z. B. mehrere Gehirnregionen mit mehreren, repräsentativen Ebenen, die gefärbt werden sollen) tatsächlich mehr Reagenzien verwenden, ziemlich zeitaufwendig sein und oft die Anzahl der pro Experiment zu verarbeitenden Objektträger begrenzen.
Einige Einschränkungen, die mit der Slide-Mounted-Methode verbunden sind, können durch die freischwebende Färbetechnik überwunden werden, die bei der Arbeit mit dickeren Abschnitten zu einer immer beliebteren Alternative geworden ist. Obwohl diese Methode kein neuartiger Ansatz ist, ist sie unserer Erfahrung nach ein zuverlässiger, reproduzierbarer und flexibler Ansatz, insbesondere für die Färbung von Gewebeproben in großen Mengen, wodurch die Verarbeitung größerer Studien auf effiziente Weise ermöglicht wird. Forscher können mit dieser Methode auch mehrere große IHC-Experimente gleichzeitig durchführen. Darüber hinaus werden die Proben in Suspension gefärbt, so dass die Lösungen die Abschnitte aus allen Winkeln durchdringen können, was besonders für dickere Abschnitte wichtig ist, was oft zu einer höheren Farbqualität führt (Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 5). Frei schwebende Abschnitte können zwischen 20 und 50 μm in Dicken37 geschnitten werden, wobei dickere Abschnitte für Forscher nützlich sind, um Strukturen oder Zellen in verschiedenen Sichtebenen zu sehen. Im Hirngewebe zum Beispiel ermöglichen dickere Abschnitte den Forschern, die Struktur von Dendriten und Axonen in ihren Proben zu sehen. Die Möglichkeit, dünnere Scheiben (20 μm) zu sammeln, erweitert das Anwendungsspektrum noch weiter. Dünnere Scheiben können jedoch schwierig zu handhaben sein und erfordern oft mehr Zeit und Mühe, um Schäden zu minimieren, daher sollten Abschnitte für die Bulk-Färbung nicht dünner als 40 μm sein. Ein Hauptvorteil der Free-Floating-Methode besteht darin, dass Forscher schnell ganze Gehirne (oder anderes Gewebe) schneiden können, indem sie alle Abschnitte in kleinen Röhrchen sammeln, wobei jedes Aliquot eine repräsentative Scheibe für alle verschiedenen Gehirnregionen aufweist, so dass die Forscher das gesamte Gehirn schnell färben können. Röhrchen, die Scheiben enthalten, können mehrere Jahre lang bei -80 °C in Kryoprotektionsmitteln gelagert werden33, wobei Aliquots nicht viel Platz im Gefrierschrank beanspruchen, was es den Forschern ermöglicht, eine "Gewebebibliothek" zu erstellen. Diese Methode reduziert auch die Menge an verschwendeten Materialien, einschließlich Objektträgern, Deckgläsern und insbesondere Antikörpern, die leicht zurückgewonnen und für die Wiederverwendung konserviert werden können, sowie wertvolles tierisches Gewebe, da Abschnitte so lange gelagert und aufbewahrt werden können, wie es der Benutzer wünscht.
Der Free-Floating-Ansatz und das hier vorgestellte Protokoll geben Forschern auch die Möglichkeit, das Protokoll einfach zu modifizieren oder Ressourcen wiederzuverwenden. Zum Beispiel können die gesammelten Schnitte für viele verschiedene histochemische Färbungen zusätzlich zur Immunfluoreszenz mit einfachen Protokollmodifikationen verwendet werden, wie chromogene IHC, Hämatoxylin und Eosin (H & E), Kresylviolett (Abbildung 4) und RNAscope38. Chromogene IHC ermöglicht die Visualisierung der Antigenexpression, wenn ein lösliches Substrat durch ein Enzym umgewandelt wird, das an einen sekundären Antikörper zu einem unlöslichen chromogenen Produkt konjugiert ist. Die beiden am häufigsten verwendeten Enzyme sind die Meerrettichperoxidase (HRP), die das 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) in ein dunkelbraunes Endprodukt umwandelt, und die alkalische Phosphatase (AP), die das 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC)-Substrat in ein rotes Produktumwandelt 39. Wir führen routinemäßig Kresylviolettfärbungen durch und verwenden frei schwebende Schnitte, um die grobe Gehirnorganisation und -morphologiezu untersuchen 40. Wir haben dieses Protokoll auch erfolgreich auf viele verschiedene Gewebe angewendet, darunter Gehirn, Leber, Herz, Niere und Milz (Abbildung 5). Andere Forscher haben diese Technik auch erfolgreich für periphere Gewebe wie Leber, Niere und Eierstockeingesetzt 22,23,24.
Ein großes Problem bei der Verwendung der Free-Floating-Technik ist das Potenzial für strukturelle Schäden an den Gewebeabschnitten, insbesondere an Gehirnschnitten, da sich die Proben während des gesamten Protokolls bei fast jedem Schritt auf Schüttlern und Rotatoren befinden, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig gewaschen, blockiert und gefärbt werden. Gelegentlich können sich bestimmte Hirnregionen ablösen, insbesondere auf der Ebene des Kleinhirns. Die Verwendung eines Gehirnatlas und einer Form der Vergrößerung, z. B. einer Juwelierlampe, während des Montageprozesses kann jedoch hilfreich sein, um Abschnitte zusammenzusetzen. Diese Herausforderung kann in der Regel durch einen schonenden Umgang mit den Proben und durch das Halten der rotierenden Maschinen auf der richtigen, niedrigen Einstellung vermieden werden.
Abschließend stellen wir eine etablierte, frei schwebende IHC-Technik vor, die sich als unverzichtbare, zuverlässige, flexible und effiziente Modalität erwiesen hat, die wir regelmäßig zur Visualisierung der Proteinexpression und -lokalisation sowie der Gewebestruktur in einer Vielzahl von Geweben verwenden. Das hierin enthaltene Protokoll kann leicht modifiziert werden, um den individuellen Forschungsbedürfnissen gerecht zu werden, was es für die wissenschaftliche Gemeinschaft wertvoll macht.
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Disclosures
Nichts zu verraten
Acknowledgments
Wir danken dem National Institute on Aging (K99/R00 AG055683 bis JMR), dem George and Anne Ryan Institute for Neuroscience (EP, GC, JMR), dem College of Pharmacy an der University of Rhode Island (EP, GC, JMR) und Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Wir danken der Doktorandin Rebecca Senft, die bei Professor Susan Dymecki, Department of Genetics, Harvard Medical School, trainiert hat, für die Einführung in die Free-Floating-Methode. Einige Bilder, die in Abbildung 1 verwendet werden, stammen aus Quellen, die "frei zu verwenden, zu teilen oder zu modifizieren, auch kommerziell" sind: Maus und Mikrozentrifugenröhrchen (Pixabay), Mausgehirn (Jonas Töle, Wikimedia Commons), Kryostat und Mausgehirn (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), Glasbehälter (OpenClipart, FreeSvg.org) und Mikroskop (Theresa Knott, Open Clip Art Library).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3513 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Clear nail polish | User preference | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Embedding molds | Thermo Scientific | 1841 | |
| Ethylene glycol | User preference | N/A | |
| Formalin solution | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco | 26050088 | |
| Microscope slide boxes | Electron Microscopy Services | 71370 | |
| PBS | User preference | N/A | |
| Primary antibody | User preference | N/A | |
| Rectangular Coverslips | VWR | 48393-081 | 24 x 50 mm |
| Rectangular staining dish | Electron Microscopy Services | 70312 | |
| Round artist paintbrush #2 | Princeton Select Series | 3750R | Brand not important |
| Secondary antibody | User preference | N/A | |
| Specimen matrix for embedding | OCT Tissue-Tek, Sakura | 4583 | |
| Stain tray – slide staining system | Electron Microscopy Services | 71396-B | Use dark lid |
| Sucrose | User preference | N/A | |
| Superfrost Plus Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| TBS | User preference | N/A | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Non-hardening |
| Well inserts for 12-well plates | Corning Netwells | 3477 | |
| Well inserts for 6-well plates | Corning Netwells | 3479 | |
| Whatman filter paper | Millapore-Sigma | WHA1440042 |
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