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Summary
Fornecemos um protocolo passo-a-passo para a coloração por imunofluorescência de montagem completa do nó sinoatrial (SAN) e do nó atrioventricular (AVN) em corações murinos.
Abstract
O sinal elétrico fisiologicamente gerado pelas células do marcapasso no nó sinoatrial (SAN) é conduzido através do sistema de condução, que inclui o nó atrioventricular (AVN), para permitir a excitação e contração de todo o coração. Qualquer disfunção de SAN ou AVN resulta em arritmias, indicando seu papel fundamental na eletrofisiologia e arritmogênese. Modelos de camundongos são amplamente utilizados na pesquisa de arritmia, mas a investigação específica de SAN e AVN permanece desafiadora.
A SAN está localizada na junção da crista terminal com a veia cava superior e a AVN está localizada no ápice do triângulo de Koch, formado pelo orifício do seio coronariano, do anel tricúspide e do tendão de Todaro. No entanto, devido ao pequeno tamanho, a visualização pela histologia convencional continua sendo desafiadora e não permite o estudo de SAN e AVN dentro de seu ambiente 3D.
Aqui descrevemos uma abordagem de imunofluorescência de montagem inteira que permite a visualização local de SAN e AVN de camundongos marcados. A coloração de imunofluorescência de montagem inteira destina-se a seções menores de tecido sem a necessidade de seccionamento manual. Para este fim, o coração do rato é dissecado, com tecido indesejado removido, seguido de fixação, permeabilização e bloqueio. As células do sistema de condução dentro da SAN e da AVN são então coradas com um anticorpo anti-HCN4. A microscopia confocal de varredura a laser e o processamento de imagem permitem a diferenciação entre células nodais e cardiomiócitos em funcionamento e localizam claramente a SAN e a AVN. Além disso, anticorpos adicionais podem ser combinados para rotular outros tipos de células também, como fibras nervosas.
Em comparação com a imuno-histologia convencional, a coloração por imunofluorescência de montagem completa preserva a integridade anatômica do sistema de condução cardíaca, permitindo assim a investigação da AVN; especialmente em sua anatomia e interações com o miocárdio de trabalho circundante e células não-miócitos.
Introduction
As arritmias são doenças comuns que afetam milhões de pessoas e são a causa de morbidade e mortalidade significativas em todo o mundo. Apesar dos enormes avanços no tratamento e na prevenção, como o desenvolvimento de marcapassos cardíacos, o tratamento das arritmias permanece desafiador, principalmente devido ao conhecimento muito limitado sobre os mecanismos da doença de base 1,2,3. Uma melhor compreensão da eletrofisiologia normal e da fisiopatologia das arritmias pode ajudar a desenvolver estratégias de tratamento novas, inovadoras e causais no futuro. Além disso, para estudar de forma abrangente a arritmogênese, é importante localizar e visualizar o sistema de condução cardíaca específico em modelos animais, como o camundongo, pois os camundongos são amplamente utilizados em pesquisas de eletrofisiologia.
As principais partes do sistema de condução cardíaca são o nó sinoatrial (SAN), onde o impulso elétrico é gerado em células de marcapasso especializadas, e o nó atrioventricular (AVN), que é a única conexão elétrica entre os átrios e os ventrículos4. Sempre que as propriedades eletrofisiológicas da SAN e da AVN são alteradas, podem ocorrer arritmias como síndrome do seio doente ou bloqueio atrioventricular, o que pode levar à deterioração hemodinâmica, síncope e até mesmo à morte, ressaltando assim o papel essencial da SAN e da AVN na eletrofisiologia e arritmogênese5.
Estudos abrangentes sobre SAN ou AVN exigem uma localização e visualização precisas de ambas as estruturas, idealmente dentro de seu ambiente fisiológico. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho e localização dentro do miocárdio de trabalho, sem estabelecer uma estrutura macroscopicamente visível clara, estudar a anatomia e a eletrofisiologia da SAN e da AVN é um desafio. Pontos de referência anatômicos podem ser usados para identificar aproximadamente a região que contém SAN e AVN 6,7,8. Em resumo, a SAN está localizada na região inter-caval do átrio direito adjacente à crista terminal muscular (TC), a AVN está localizada dentro do triângulo de Koch estabelecido pela valva tricúspide, o óstio do seio coronariano e o tendão de Todaro. Até agora, esses marcos anatômicos foram usados principalmente para localizar, remover e, em seguida, estudar SAN e AVN como estruturas individuais (por exemplo, pela histologia convencional). Para entender melhor a complexa eletrofisiologia da SAN e da AVN (por exemplo, efeitos regulatórios de células adjacentes do miocárdio em funcionamento), no entanto, é necessário estudar os sistemas de condução dentro do ambiente fisiológico 3D.
A coloração por imunofluorescência de montagem completa é um método utilizado para estudar estruturas anatômicas in situ , preservando a integridade do tecido circundante9. Aproveitando o software de microscopia confocal e análise de imagens, o SAN e o AVN podem ser visualizados com anticorpos marcados fluorescentemente visando canais iônicos especificamente expressos nessas regiões.
Este protocolo a seguir explica as etapas necessárias para executar um método de coloração de montagem completa bem estabelecido para localização e visualização de microscópio SAN e AVN. Especificamente, este protocolo descreve como (1) localizar SAN e AVN por marcos anatômicos para preparar essas amostras para coloração e análise microscópica (2) para realizar coloração de imunofluorescência de montagem completa dos marcadores de referência HCN4 e Cx43 (3) para preparar amostras de SAN e AVN para microscopia confocal (4) para realizar imagens confocais de SAN e AVN. Também descrevemos como este protocolo pode ser modificado para incluir coloração adicional do miocárdio circundante ou células não-miócitos, como fibras nervosas autônomas, o que permite uma investigação completa do sistema de condução cardíaca dentro do coração.
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Protocol
O cuidado com os animais e todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidados com os Animais da Universidade de Munique, e todos os procedimentos realizados em camundongos foram aprovados pelo Governo da Baviera, Munique, Alemanha (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Camundongos C57BL6/J foram comprados do Jackson Laboratory.
NOTA: A Figura 1 mostra os instrumentos necessários para o experimento. A Figura 2 mostra uma ilustração da anatomia cardíaca macroscópica. A Figura 3 mostra a localização da SAN e da AVN em um coração de rato adulto. A Figura 4 mostra a amostra preparada carregada na microscopia confocal.
1. Preparações
- Preparar uma solução de formaldeído a 4% (PFA a 4%) diluindo 10 mL de solução de formaldeído a 16% em 30 mL de PBS.
- Preparar uma solução de sacarose a 15% e uma solução de sacarose a 30%, dissolvendo 15 g e 30 g de sacarose em pó em 100 mL de PBS, respectivamente. Após a dissolução completa do pó de sacarose, filtrar a solução utilizando um filtro de seringa de 0,2 μm antes de armazenar a 4 °C.
- Prepare um gel de agarose a 3% a 4%, adicione 3 g ou 4 g de pó de agarose e 100 mL de 1x TAE (diluído a partir de 50x solução de estoque de TAE) em um béquer. Coloque o copo sobre um agitador magnético e ferva-o até que a agarose esteja completamente dissolvida.
- Prepare a placa de dissecação derramando suavemente 30 mL de gel de agarose (3%-4%) em uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro. Deixe a placa de Petri no banco à temperatura ambiente para arrefecer e endurecer.
- Preparar a solução de bloqueio e a solução de lavagem de acordo com as receitas fornecidas na Tabela 1. Prepare todas as soluções preparadas no dia de uso. O armazenamento a longo prazo não é recomendado.
- Prepare as soluções de anticorpos diluindo-as em PBS frio (4 °C) 1x, proteja a diluição da luz (por exemplo, envolvendo papel alumínio) e mantenha as diluições no gelo até que sejam usadas. Diluir os anticorpos pouco antes da incubação. Evite deixar os anticorpos diluídos à temperatura ambiente.
NOTA: A diluição apropriada de anticorpos deve ser testada com amostras de tecido comparáveis, realizando uma coloração imunofluorescente convencional. Aqui, testamos os anticorpos por coloração de cortes congelados cortados a uma espessura de 10 μm.
2. Colheita de órgãos e preparação de tecidos
- Anestesiar o rato, colocando-o numa câmara de incubação ligada a um vaporizador de isoflurano. Ajuste o vaporizador para fornecer 4-5% de isoflurano (96-95% de oxigênio, respectivamente).
NOTA: A anestesia completa é confirmada pela perda da reação postural e do reflexo de endireitamento rolando suavemente a câmara até que o rato seja colocado de costas. - Coloque o rato em decúbito dorsal sobre a mesa cirúrgica. Coloque o nariz do rato em uma máscara de anestesia conectada a um circuito Bain modificado com seu tubo interno conectado ao vaporizador de isoflurano. Para manter a anestesia, use isoflurano a 1-2% em oxigênio a uma taxa de fluxo de 1 L / min. Elimine o excesso de vapor anestésico do rato através do tubo exterior da máscara e retire através de um recipiente de carvão ativado, que absorve o excesso de gás anestésico.
- Quando a anestesia completa for alcançada, injete fentanil para analgesia (0,1 μg/25 g de peso corporal, i.p.).
- Quando o reflexo da pinça do dedo do pé for indetectável, faça um corte claro do jugúnculo para a sínfise usando uma tesoura da íris para remover a pele e a pele. Faça outro corte da esquerda para a direita sob as costelas usando uma tesoura de íris para abrir cuidadosamente o abdômen.
- Vida o xifoide um pouco usando pinça curva para permitir cortar o diafragma da esquerda para a direita sem ferir nenhum órgão. Corte a caixa torácica em uma linha axilar medial em ambos os lados usando uma tesoura de íris para virá-la cranialmente e permitir o acesso ao coração.
- Corte a veia cava inferior e a aorta torácica descendente ao nível do diafragma usando uma tesoura de íris. Puncione o coração com uma agulha de 27 G na área do ápice e, em seguida, empurre cuidadosamente a agulha para o ventrículo esquerdo (VE). Injete suavemente 5-10 mL de PBS gelado no VE para perfundir o coração.
NOTA: A cor do coração deve passar de vermelho para cinza, indicando perfusão bem-sucedida com PBS. - Levante cuidadosamente o ápice do coração usando uma pinça que permite cortar os grandes vasos e remover o coração.
- Excise o coração, cortando as grandes artérias e veias o mais longe possível do coração para evitar qualquer dano à veia cava superior (SVC). Conserve o SVC, pois ele servirá como um marco importante durante o processamento posterior.
- Após a remoção do coração, desligue o vaporizador de isoflurano.
- Coloque o coração em um prato de dissecação cheio de PBS gelado sob o microscópio de dissecação. Após a determinação da esquerda / direita e frente / trás do coração, gire o coração com a frente do coração na parte inferior do prato (para expor os grandes vasos que estão localizados posteriormente).
- Imobilizar o coração colocando pequenos pinos através do ápice e do apêndice atrial esquerdo (AAE) na agarose na parte inferior do prato de dissecção (Figura 2A). Usando pinças finas e tesouras, remova cuidadosamente o tecido não cardíaco ao redor da VCS e da veia cava inferior (VCI) (por exemplo, pulmões, gordura, pericárdio) para expor a região intercaval (Figura 3A).
- Remova a maioria dos ventrículos cortando paralelamente o sulco entre os ventrículos e os átrios com a microtesoura. Preserve uma pequena parte do tecido ventricular para a carga posterior no anel de plexiglas.
- Para fixação e desidratação, colocar a amostra (contendo os átrios, VCS e IVC) em PFA a 4% durante a noite a 4 °C.
- No dia seguinte, transfira o coração para a solução de sacarose a 15% durante 24 horas a 4 °C.
- No dia seguinte, transfira o coração para a solução de sacarose a 30% durante 24 horas a 4 °C.
NOTA: Para a fixação e desidratação nas etapas 2.13, 2.14 e 2.15, as amostras são deixadas a 4°C sem agitação ou balanço.
3. Coloração por imunofluorescência de montagem inteira
- Lavar o coração em Triton X-100 a 1% diluído em PBS e bloquear e permeabilizar em solução bloqueadora (Tabela 1) durante a noite a 4 °C.
- Colocar o coração num tubo de 1,5 ml e incubar com anticorpos anti-rato conexina-43 de coelho (diluição de 1:200) e HCN4 anti-rato de rato (diluição de 1:200) diluídos com solução bloqueadora durante 7 dias a 4 °C.
NOTA: A concentração ideal de anticorpos primários deve ser testada antes de utilizar as fichas técnicas como orientação. Outros antígenos de interesse também poderiam ser corados nesta etapa, desde que a espécie hospedeira do antígeno primário seja diferente das demais. Uma concentração mais alta de Triton X-100 pode ajudar a obter uma coloração de anticorpos mais eficiente, conforme demonstrado antes de10, mas a concentração pode ser determinada individualmente. - Após 7 dias, remover a solução que contém anticorpos primários utilizando uma pipeta e lavar o coração com 1% de solução de Triton X-100 3 vezes (cada vez durante 1 h à temperatura ambiente no agitador orbital).
- Após a lavagem, incubar o coração = com Alexa Fluor 488 cabra anti-rato IgG (diluição de 1:200) e Alexa Fluor 647 cabra anti-coelho IgG (diluição de 1:200) por 7 dias a 4 °C.
- Após 7 dias, retire toda a solução que contém os anticorpos secundários utilizando uma pipeta. Em seguida, lave o coração com solução de lavagem (Tabela 1) 3 vezes (cada vez por 1 h à temperatura ambiente no agitador orbital).
- Para corar os núcleos, incubar o coração em solução de DAPI (10 μg/mL) durante a noite a 4 °C.
- No dia seguinte, lave o coração com solução de lavagem 3 vezes (cada vez por 1 h à temperatura ambiente no agitador orbital).
NOTA: Para o bloqueio, permeabilização, incubação de anticorpos e coloração DAPI nas etapas 3.1, 3.2, 3.4 e 3.6, deixar as amostras no estado estacionário a 4 °C, sem necessidade de agitação. O tecido corado pôde ser preservado totalmente coberto com solução de lavagem a 4 °C e protegido da luz por alguns dias até a obtenção de imagens ao microscópio confocal.
4. Microscopia confocal
- Preparar anéis de plexiglas e encher com plasticina (Figura 1). No centro da plasticina, um pequeno sulco é formado no centro para carregar o coração. Faça um sulco raso, pois seria mais fácil adquirir um plano de imagem plano, ajustar o espaço e evitar bolhas de ar entre a amostra e as tampas na etapa 4.4.
- Use a mesma amostra de coração para a geração de imagens de SAN e AVN sequencialmente. Para imagens SAN, carregue diretamente o coração, enquanto para imagens AVN, execute a microdissecção antes.
- Geração de imagens de SAN
- Identificar a SAN por marcos anatômicos: ela está localizada no lado dorsal do coração dentro da região inter-caval (a região entre a veia cava superior e inferior). A crista terminal (TC) é a faixa muscular entre a SAN e a ARA.
- Coloque o coração no sulco de plasticina com a parte de trás do coração voltada para cima. Adicione PBS no coração para deslocar todo o ar dentro da cavidade até que o coração esteja totalmente coberto com PBS (geralmente algumas gotas de PBS são suficientes).
- Sob o microscópio de dissecção, pressione suavemente o RAA, o LAA e as partes restantes do ventrículo esquerdo na plasticina para fixar o coração. Certifique-se de que toda a região inter-caval e a crista terminalis possam ser claramente vistas (não cobertas por plasticina). A área que será visualizada é mostrada na Figura 3A.
- Imagem AVN
- Depois de concluir a imagem da SAN, recolete a mesma amostra e, posteriormente, use para a imagem AVN. Para microdissecção AVN, coloque o coração = em uma placa de dissecção sob o microscópio de dissecção.
- Oriente o coração com o lado direito voltado para cima (incluindo as partes restantes do ventrículo direito). Coloque pinos através da parte restante da parede livre do VE (que agora está na parte inferior) para imobilizar o tecido (Figura 2B).
- Corte a parede livre do VD restante para cima através da valva tricúspide e da veia cava superior. Em seguida, vire o VD e a AR para expor o septo interventricular e interatrial. (Figura 3B)
NOTA: Preste atenção para não danificar o seio coronário (CS), pois é um marco anatômico importante encontrar o triângulo de Koch que permite localizar a AVN. O CS corre transversalmente no sulco atrioventricular esquerdo no lado posterior do coração, e a abertura do orifício CS está localizada entre a VCI e a valva tricúspide na parte inferior do septo interatrial (Figura 3A e B). - Identificar o triângulo de Koch que pode ser encontrado na superfície endocárdica do átrio direito, delimitado anteriormente pela linha articular do folheto septal da valva tricúspide (VC) e posteriormente pelo tendão de Todaro. A base é formada pelo orifício do seio coronariano (Figura 3B). Como essa é a região alvo para imagens AVN, ela precisa ser claramente visível.
- Transfira o coração para o sulco de plasticina dentro do anel de Plexiglas com o triângulo de Koch claramente exposto (ou seja, não coberto por plasticina). Pressione suavemente o tecido ao redor do triângulo de Koch na plasticina para fixar a amostra. Adicione PBS no coração para deslocar todo o ar dentro da cavidade até que o coração esteja totalmente coberto com PBS (geralmente algumas gotas de PBS são suficientes).
- Geração de imagens de SAN
- Aplique silicone nas bordas dos anéis de plexiglas para permitir cobrir os corações carregados dentro dos anéis de plexiglas cheios de plasticina com deslizamentos de cobertura.
- Pressione suavemente a parte de trás da plasticina para espremer partes do PBS e para anexar o coração à tampa, evitando bolhas de ar dentro da área de imagem.
NOTA: Certifique-se de que as regiões de interesse não estão dobradas e cobertas durante a pressão na parte de trás da plasticina. Um plano de imagem plano sem supercompressão da amostra é necessário para conservar a anatomia e para a imagem confocal adequada das amostras. Para SAN, é importante certificar-se de que a região entre cavalas esteja claramente exposta. Para AVN, o triângulo de Koch deve ser totalmente exposto. - Coloque as amostras de coloração de montagem inteira de cabeça para baixo na plataforma do microscópio confocal. O SAN/AVN exposto anexado à folha da tampa está agora na parte inferior da plataforma do microscópio (Figura 4).
NOTA: Para tirar imagens, usamos o Carl Zeiss LSM800 com Airyscan Unit e o software ZEN 2.3 SP1 preto. - Escolha a placa "BP420-480 + LP605" para a excitação do anti-HCN4 conjugado Alexa Fluor 647. Varie o ganho mestre de 650-750.
- Obtenha uma imagem geral de toda a região SAN e AVN usando a função Verificação de blocos . Em seguida, selecione a região positiva para HCN4 clicando e adicionando um quadrado na imagem de visão geral em torno da área de interesse que será digitalizada.
- Verifique os parâmetros, incluindo placas e ganho mestre para os canais restantes (Alexa Fluor 488 e DAPI) do microscópio confocal e do conjunto, conforme descrito na etapa 4.6.
- Ajuste lentamente o foco de cima para baixo da amostra para visualizar toda a amostra e definir o Primeiro e o Último para o intervalo de pilha Z. Defina um intervalo ideal para a pilha Z com base na espessura da amostra óptica. Usamos um objetivo de 20x e 0,8-1 μm como intervalo para Z-stack.
- Depois que todos os parâmetros estiverem definidos corretamente, verifique toda a área da SAN e do AVN.
- Realizar a reconstrução 3D das imagens usando software (por exemplo, Imaris versão 8.4.2).
- Selecione Processamento de Imagens | Subtração da linha de base para remover a coloração de fundo.
- Selecione a criação de superfície na configuração do canal e da região de interesse selecionados para processamento.
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Representative Results
Usando o protocolo descrito acima, a imagem de microscopia confocal de SAN e AVN pode ser realizada de forma confiável. A coloração específica do sistema de condução usando anticorpos fluorescentes direcionados à HCN4 e a coloração do miocárdio de trabalho usando anticorpos fluorescentes direcionados à Cx43 permitem a identificação clara de SAN (Figura 5, Vídeo 1) e AVN (Figura 6, Vídeo 2) dentro da anatomia intacta.
Figura 1: Instrumentos para dissecção e suporte para anel de plexiglas. A. Anel de plexiglas preenchido com plasticina (seta vermelha mostra o sulco formado no centro para carregar o coração). B. Dissecção de placa de Petri com gel de agarose. C. Tesoura de mola. D. Tesoura de íris. E. Pinça curva. F. Fórceps finos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ilustração da anatomia cardíaca macroscópica. Ilustração esquemática da microdissecção de SAN. Os pinos são aplicados através do ápice e do apêndice atrial esquerdo (AAE). A SAN é indicada por um círculo tracejado vermelho. Não. Ilustração esquemática da microdissecção AVN. Os pinos são colocados através da parte restante da parede livre de LV (que agora está na parte inferior). AVN é indicado por um círculo tracejado vermelho. VCS da veia cava superior; VCI, veia cava inferior; CS, seio coronariano; AAE, apêndice atrial esquerdo; ARA, apêndice atrial direito; AP, artéria pulmonar; PV, veia pulmonar; VE, ventrículo esquerdo; SVI de septo interventricular; SIA interatrial; OF, fossa oval. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Localização de SAN e AVN em um coração de rato adulto. Localização do nó sinoatrial (SAN) em um coração de rato adulto. Vista do fundo do coração. A localização da SAN é indicada por uma linha tracejada vermelha dentro da região entre cavals (linhas tracejadas pretas). VCS da veia cava superior; VCI, veia cava inferior; CS, seio coronariano; AAE, apêndice atrial esquerdo; ARA, apêndice atrial direito; PV, veia pulmonar; TC, Crista terminalis; VE, ventrículo esquerdo; VD, ventrículo direito. Não. Localização do nó atrioventricular (AVN) em um coração de rato adulto. Vista da direita. O AVN (círculo tracejado vermelho) está localizado no ápice do triângulo de Koch (triângulo tracejado branco) perto da parte inferior do septo membranoso. O triângulo de Koch é formado pelo tendão de Todaro (TT, linha tracejada verde), válvula tricúspide (TV, linha tracejada azul) e orifício do seio coronário (CS, linha tracejada amarela). VCS, veia cava superior; VCI, veia cava inferior; SVI de septo interventricular; OF, fossa oval. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Amostra preparada carregada na microscopia confocal. A amostra preparada (seta vermelha) para microscopia confocal montada no anel de plexiglas com plasticina (seta preta). Vista de baixo. Não. Anel de plexiglas com amostra montada carregada de cabeça para baixo na plataforma do microscópio confocal (microscópio inverso). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Reconstrução de imagens de microscopia confocal de SAN em camundongo C57BL6/J corado com anticorpos anti-HCN4 (vermelho) e Cx43 (branco). Um. A área tracejada delineia a SAN, que é orientada ao longo da região inter-caval entre a veia cava superior e inferior. Não. Ampliação do inlayfrom painel A. C. Reconstrução 3D do painel B. RAA, apêndice atrial direito; AR, átrio direito; SAN, nó sinoatrial. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Reconstrução da microscopia confocal de AVN em camundongo C57BL6/J corado com anticorpos anti-HCN4 (vermelho) e Cx43 (branco). Um. A área tracejada indica o AVN . Ampliação da incrustação do painel A. C. Reconstrução 3D do painel B. IVS, septo interventricular; SIA interatrial; NVA, linfonodo atrioventricular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Imagem de controle negativo. Um. coloração de montagem inteira de controle negativo para SAN. O círculo tracejado mostrava a região SAN confirmada pelos marcos de anatomia. Não. coloração de controle negativo para SAN apenas com segundos anticorpos. Não. Coloração DAPI para SAN. D . Coloração de montagem completa de controle negativo para AVN. O círculo tracejado mostrou a região AVN confirmada pelos marcos de anatomia. E . coloração de controle negativo para AVN somente com segundos anticorpos. Não. coloração DAPI para AVN. RAA, apêndice atrial direito; AR, átrio direito; VCS, veia cava superior; SVI de septo interventricular; SIA interatrial; Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Reconstrução 3D da SAN Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Reconstrução 3D do AVN Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
| Composto | Concentração final | g ou mL/100 mL necessários | |
| Solução de fixação | |||
| Formaldeído (16%) | 4% | 25 mL | |
| PBS (1x) | 75 mL | ||
| Solução Triton a 1% | |||
| Tritão X100 | 1% | 1 mL | |
| PBS | 99 mL | ||
| Solução de bloqueio | |||
| Tritão X-100 | 1% | 1 mL | |
| BSA | 0.50% | 0,5 g | |
| Soro de cabra normal | 20% | 20 mL | |
| PBS (1x) | 89 mL | ||
| Solução de lavagem | |||
| Interpolação 20 | 0.10% | 0,1 ml | |
| BSA | 0.50% | 0,5 g | |
| PBS (1x) | 99,9 mL | ||
| TAE (50x) | |||
| Tris-base | 24.20% | 24,2 gr | |
| 100% ácido acético | 5.71% | 5,71 mL | |
| 0,5 M EDTA | 0.05 milh | 10 mL | |
| dH2O | Adicione até 100 mL | ||
Tabela 1.
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Discussion
A anatomia cardíaca tem sido tradicionalmente estudada por meio de cortes histológicos finos11. No entanto, esses métodos não preservam a estrutura tridimensional do sistema de condução e, portanto, fornecem apenas informações 2D. O protocolo de coloração por imunofluorescência de montagem completa descrito aqui permite superar essas limitações e pode ser usado rotineiramente para imagens SAN e AVN.
Em comparação com métodos padrão, como a imuno-histoquímica convencional, que requer incorporação de parafina, seccionamento e recuperação de antígenos, a metodologia de montagem completa é vantajosa para abordar a localização 3D exata e a morfologia da SAN e da AVN, e para examinar a relação com o tecido circundante, uma vez que a morfologia do tecido é consideravelmente preservada com apenas o mínimo de desidratação tecidual e ruptura física. Além disso, a imunorreatividade (ou seja, a ligação de anticorpos a antígenos teciduais) também é altamente mantida.
Estabelecemos um método prático de procissão de amostras para microscopia confocal utilizando um suporte de anel de plástico montado com plasticina12,13. A plasticina é ideal, uma vez que pode ser ajustada individualmente ao tamanho do tecido, é difícil o suficiente para segurar de forma confiável o tecido sem pressão excessiva do tecido. Mais importante ainda, não é fluorescente, evitando o fundo autofluorescente e, portanto, não interferindo no sinal fluorescente dos anticorpos utilizados.
Utilizou-se o microscópio confocal de varredura a laser (LSM-Zeiss) com o detector Airyscan, que pode oferecer uma vantagem distinta na obtenção de imagens com alta qualidade. O uso de um microscópio de imagem de campo largo só pode oferecer informações em nível de tecido, mas não possui resolução celular. Além disso, o microscópio de campo largo acarreta um risco de fundo elevado14. Usando um detector Airyscan para LSM confocal, a resolução melhorada e a relação sinal-ruído (SNR) podem ser adquiridas, em comparação com o tradicional sistema de imagem confocal de um orifício e detector15.
As formas e a posição da SAN e da AVN são apresentadas como reconstrução 3D e planos de seção virtual adicionais derivados da reconstrução 3D podem melhorar a interpretação de cortes histológicos, enquanto a histologia convencional permite apenas uma avaliação 2D da anatomia com o risco inerente de não detecção de estruturas pequenas, mas relevantes. Além disso, a reconstrução 3D oferece a oportunidade de examinar estruturas anatômicas de interesse transmural e dentro do microambiente intacto, por exemplo, plexo nervoso autônomo intrínseco que inerva o coração16. A coloração in situ de montagem inteira e a reconstrução 3D permitem a investigação do ambiente celular, bem como dos tipos específicos de células e sua orientação. Além disso, a expressão de proteínas específicas regionais e do tipo celular pode ser visualizada e pode apoiar ainda mais as análises de western blot e proteômica17.
SAN e AVN são estruturas especializadas dentro do coração com um padrão de expressão diferente de canais iônicos e conexinas que podem ser utilizadas para identificação confiável10,18. Os canais catiônicos ciclicos (HCN) ativados por hiperpolarização estabelecem a despolarização diastólica nas células do marcapasso e, portanto, são especificamente expressos dentro do sistema de condução, sendo a HCN4 a isoforma predominante no camundongo19. Estudos têm demonstrado que a HCN4 é uma das isoformas de HCN detectáveis e expressas de forma estável em toda a SAN e AVN11,20. As conexinas conectam diretamente as células vizinhas e permitem a passagem de íons de célula para célula; são, portanto, essenciais para a condução do impulso elétrico através do coração21. Os padrões de expressão da conexina variam entre diferentes regiões do coração, sendo a Cx43 a isoforma mais abundante que foi encontrada em quase todas as partes do coração, exceto na SAN e na AVN22. A combinação de microdissecção para permitir a exposição de regiões específicas de interesse com anticorpos anti-HCN4 e anti-CX43, bem como abordagens in silico para reconstrução tridimensional de imagens confocais, permite a identificação confiável de SAN e AVN e a investigação abrangente da morfologia SAN/AVN, bem como sua interação com o tecido circundante.
A SAN e a AVN podem ser fáceis de distinguir após a coloração com um anticorpo específico. Para localizar a SAN e a AVN por seus marcos anatômicos, no entanto, é necessária alguma prática antes que a microdissecção correta possa ser realizada.
Usando o protocolo acima, uma série de outros antígenos também podem ser aplicados. O protocolo também funciona bem em tecido fixo de perfusão e de imersão. No entanto, o tempo de incubação pode ser ajustado para a fixação ideal, uma vez que certos anticorpos mostram imunorreatividade reduzida quando o antígeno é superfixado. Como a abordagem de coloração de montagem completa precisa de 7 dias para incubação de anticorpos primários e secundários, é importante submergir completamente as amostras em volumes adequados de soluções contendo anticorpos. A razão de diluição de cada anticorpo deve ser testada antes da experiência. Para uma coloração ideal, qualquer tecido irrelevante deve ser removido. Para o protocolo, preservamos apenas pequenas partes dos ventrículos para melhor orientação e remoção de todo o tecido adiposo circundante e veias pulmonares, pois o tecido circundante (irrelevante) também pode se ligar a anticorpos, especialmente quando os antígenos alvo são expressos globalmente.
A coloração in situ de montagem completa, a imagem confocal e a reconstrução 3D são uma técnica inestimável e poderosa para pesquisadores de vários campos. No entanto, o método também tem algumas limitações. (i) Requer equipamento especializado, como um microscópio confocal, que não está comumente disponível em todas as instituições. (ii) Como mencionado acima, a microdissecção de estruturas anatômicas especializadas, como a SAN ou a AVN, mas também de imagens confocais e processamento pós-imagem, requer uma prática intensiva e pessoal experiente. (iii) O sucesso do método depende muito da qualidade dos anticorpos utilizados, podendo, portanto, ser muito desafiador em alguns casos. Além disso, (iv) a reconstrução 3D pode ser difícil de alcançar e pode exigir uma solução intensiva de problemas para otimizar o procedimento. Por exemplo, intervalos ótimos devem ser definidos durante a aquisição da imagem, uma vez que seções espaçadas muito distantes deixarão lacunas e podem não permitir uma reconstrução 3D adequada da anatomia. Seções que estão muito próximas podem causar sobreamostragem e branqueamento devido à iluminação excessiva e levarão muito tempo para concluir uma imagem. Finalmente, (v) a principal limitação da microscopia confocal é a profundidade de imagem, o que significa que, se a espessura da amostra estiver além da profundidade máxima de operação do microscópio confocal, o fluoróforo adicional não poderá ser detectado.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Bolsas de Estudo da China (CSC, para R. Xia), o Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 para S. Clauss, 81Z0600206 para S. Kääb), a Fundação Corona (S199/10079/2019 para S. Clauss), o SFB 914 (projeto Z01 para H. Ishikawa-Ankerhold e S. Massberg e projeto A10 para C. Schulz), o ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 para S. Clauss) e o Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (para S. Clauss). Os financiadores não tiveram nenhum papel na preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglass ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |
References
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al.
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L.
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
- Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
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Medicina Edição 166 Nó sinoatrial Nó atrioventricular Cardiologia eletrofisiologia sistema de condução cardíaca Microdissecção Imunofluorescência Microscopia confocalErratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
