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Summary
我们为鼠心脏窦房结（SAN）和房室结（AVN）的全安装免疫荧光染色提供了分步方案。
Abstract
窦房结（SAN）中起搏器细胞在生理上产生的电信号通过传导系统（包括房室结（AVN））传导，以允许整个心脏的兴奋和收缩。SAN 或 AVN 的任何功能障碍都会导致心律失常，表明它们在电生理学和心律失常发生中起根本作用。小鼠模型广泛用于心律失常研究，但SAN和AVN的具体研究仍然具有挑战性。
SAN位于终末嵴与上腔静脉的交界处，AVN位于科赫三角形的顶点，由冠状窦的孔，三尖瓣环和Todaro的肌腱形成。然而，由于体积小，传统组织学的可视化仍然具有挑战性，并且不允许在其3D环境中研究SAN和AVN。
在这里，我们描述了一种全接口免疫荧光方法，该方法允许标记的小鼠SAN和AVN的局部可视化。 全接口免疫荧光染色适用于较小的组织切片，无需手动切片。为此，解剖小鼠心脏，去除不需要的组织，然后固定，透化和阻塞。然后将SAN和AVN内传导系统的细胞用抗HCN4抗体染色。共聚焦激光扫描显微镜和图像处理可以区分淋巴结细胞和工作心肌细胞，并清楚地定位SAN和AVN。此外，还可以结合其他抗体来标记其他细胞类型，例如神经纤维。
与传统的免疫组织学相比，全卡口免疫荧光染色保留了心脏传导系统的解剖完整性，从而可以研究AVN;特别是它们的解剖结构以及与周围工作心肌和非肌细胞的相互作用。
Introduction
心律失常是影响数百万人的常见疾病，是全世界发病率和死亡率高的原因。尽管在治疗和预防方面取得了巨大进展，例如心脏起搏器的发展，但心律失常的治疗仍然具有挑战性，主要是由于对潜在疾病机制的了解非常有限1，2，3。更好地了解心律失常的正常电生理学和病理生理学可能有助于在未来开发新颖、创新和因果治疗策略。此外，为了全面研究心律失常发生，重要的是定位和可视化小鼠等动物模型中的特定心脏传导系统，因为小鼠广泛用于电生理学研究。
心脏传导系统的主要部分是窦房结（SAN），电脉冲在专门的起搏器细胞中产生，以及房室结（AVN），这是心房和心室之间唯一的电连接4。每当SAN和AVN的电生理特性改变时，就会发生病态窦房结综合征或房室传导阻滞等心律失常，这可能导致血流动力学恶化，晕厥甚至死亡，从而强调了SAN和AVN在电生理学和心律失常发生中的重要作用5。
对SAN或AVN的全面研究需要对这两种结构进行精确的定位和可视化，最好是在它们的生理环境中。然而，由于它们的体积小且在工作心肌中的位置很小，如果没有建立清晰的宏观可见结构，研究SAN和AVN的解剖学和电生理学具有挑战性。解剖标志可用于粗略识别包含 SAN 和 AVN6，7，8 的区域。简而言之，SAN位于右心房的腔间区域，毗邻肌肉末端嵴（CT），AVN位于由三尖瓣，冠状窦的开口和Todaro的肌腱建立的Koch三角形内。到目前为止，这些解剖标志主要用于定位，去除然后研究SAN和AVN作为单个结构（例如，通过常规组织学）。然而，为了更好地了解SAN和AVN的复杂电生理学（例如，工作心肌相邻细胞的调节作用），有必要研究生理3D环境中的传导系统。
全卡口免疫荧光染色是一种用于原 位 研究解剖结构同时保持周围组织完整性的方法9。利用共聚焦显微镜和图像分析软件，可以使用荧光标记的抗体可视化SAN和AVN，这些抗体靶向在这些区域中特异性表达的离子通道。
以下协议解释了为SAN和AVN显微镜定位和可视化执行成熟的全安装染色方法的必要步骤。具体来说，该协议描述了如何（1）通过解剖标志定位SAN和AVN，以制备这些样品以进行染色和显微镜分析（2）对参考标记物HCN4和Cx43进行全卡口免疫荧光染色（3）制备SAN和AVN样品用于共聚焦显微镜（4）以执行SAN和AVN的共聚焦成像。我们还描述了如何修改该协议以包括对周围工作心肌或非肌细胞（如自主神经纤维）进行额外染色，从而可以彻底研究心脏内的心脏传导系统。
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Protocol
动物护理和所有实验程序均按照慕尼黑大学动物护理和伦理委员会的指导方针进行，对小鼠进行的所有程序均获得德国慕尼黑巴伐利亚州政府的批准（ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106，ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86）。C57BL6 / J小鼠从杰克逊实验室购买。
注意： 图1 显示了实验所需的仪器。图2显示了大体心脏解剖结构的 图 示。 图 3 显示了 SAN 和 AVN 在成年小鼠心脏中的位置。 图4 显示了在共聚焦显微镜上加载的制备样品。
1. 准备工作
- 通过在 30 mL PBS 中稀释 10 mL 的 16% 甲醛溶液来制备 4% 甲醛溶液 （4% PFA）。
- 通过将 15 g 和 30 g 蔗糖粉分别溶解到 100 mL PBS 中来制备 15% 蔗糖溶液和 30% 蔗糖溶液。蔗糖粉完全溶解后，在4°C储存之前，使用0.2μm注射器过滤器过滤溶液。
- 准备3%-4%琼脂糖凝胶，将3 g或4 g琼脂糖粉和100 mL 1x TAE（从50x TAE储备溶液稀释）加入烧杯中。将烧杯放在磁力搅拌器上煮沸，直到琼脂糖完全溶解。
- 通过将30mL琼脂糖凝胶（3%-4%）轻轻倒入直径为100毫米的培养皿中来准备解剖盘。将培养皿放在室温下的工作台上冷却并变硬。
- 根据 表1中提供的配方制备封闭溶液和洗涤溶液。准备使用当天准备的所有溶液。不建议长期储存。
- 通过在冷（4°C）1x PBS中稀释抗体溶液来制备抗体溶液，保护稀释液免受光照（例如，通过包裹铝箔），并将稀释液保持在冰上直至使用。孵育前不久稀释抗体。避免将稀释的抗体留在室温下。
注意：应通过进行常规免疫荧光染色，用可比较的组织样品测试适当的抗体稀释度。在这里，我们通过染色厚度为10μm的冷冻切片来测试抗体。
2. 器官摘取和组织准备
- 通过将小鼠放入连接到异氟醚蒸发器的孵育室中来麻醉小鼠。将蒸发器设置为提供4-5%的异氟醚（分别为96-95%的氧气）。
注意：通过轻轻滚动腔室直到鼠标仰卧，通过失去姿势反应和矫正反射来确认完全麻醉。 - 将鼠标仰卧在手术台上。将鼠标鼻子放入连接到改良贝恩回路的麻醉面罩中，其内管连接到异氟烷蒸发器。为了维持麻醉，在氧气中使用1-2%异氟醚，流速为1L / min。通过面罩的外管清除小鼠身上多余的麻醉蒸气，并通过一罐活性炭吸入，活性炭吸收多余的麻醉气体。
- 达到完全麻醉后，注射芬太尼镇痛（0.1 μg / 25 g体重ip.p.）。
- 当无法检测到脚趾捏反射时，使用虹膜剪刀从颈静脉到联合进行清晰的切口，以去除皮毛和皮肤。用虹膜剪刀从左到右在肋骨下方再剪一次，小心地打开腹部。
- 使用弯曲的镊子稍微切割剑突，以便在不伤害任何器官的情况下从左到右切割横膈膜。用虹膜剪刀在两侧的内侧腋窝线上切割肋骨，使其颅骨翻转并允许进入心脏。
- 使用虹膜剪刀在横膈膜水平处切割下腔静脉和下降胸主动脉。用27 G针刺穿心尖区域的心脏，然后小心地将针头推入左心室（LV）。将 5-10 mL 冰冷的 PBS 轻轻注入左心室以灌注心脏。
注意：心脏的颜色应从红色变为灰色，表明PBS灌注成功。 - 用镊子小心地抬起心脏的顶点，以切割大血管并取出心脏。
- 通过尽可能远离心脏切开大动脉和静脉来切除心脏，以避免对上腔静脉 （SVC） 造成任何损害。保存 SVC，因为它将在以后的处理中充当重要的地标。
- 心脏取出后，关闭异氟醚蒸发器。
- 在解剖显微镜下将心脏放入装满冰冷PBS的解剖盘中。确定心脏的左/右和前/后，将心脏的前部放在培养皿底部（以暴露位于后方的大血管）转动心脏。
- 通过将小针穿过顶点和左心耳（LAA）放入解剖盘底部的琼脂糖中来固定心脏（图2A）。使用细镊子和剪刀，小心地去除上腔静脉和下腔静脉（IVC）（例如肺，脂肪，心包）周围的非心脏组织，以暴露腔间区域（图3A）。
- 通过用微型剪刀平行切割心室和心房之间的凹槽来去除大部分心室。保留一小部分心室组织，以便以后在Plexiglas环上加载。
- 对于固定和脱水，将样品（包含心房，SVC和IVC）放入4%PFA中，在4°C下过夜。
- 第二天，将心脏转移到4°C下的15%蔗糖溶液中24小时。
- 第二天，将心脏转移到30%蔗糖溶液中，在4°C下24小时。
注意：对于步骤2.13，2.14和2.15中的固定和脱水，样品保持在4°C，无需进一步搅拌或摇摆。
3. 全安装免疫荧光染色
- 用PBS稀释的1%Triton X-100洗涤心脏，并在封闭溶液（表1）中封闭并透化过夜，温度为4°C。
- 将心脏置于1.5mL管中，并与兔抗小鼠连接蛋白-43（稀释1：200）和大鼠抗小鼠HCN4（稀释1：200）抗体在4°C下用封闭溶液稀释7天孵育。
注意：在使用数据表作为方向之前，应测试一抗的最佳浓度。其他感兴趣的抗原也可以在此步骤中染色，只要主要抗原的宿主物种与其他抗原不同。较高浓度的Triton X-100可能有助于获得更有效的抗体染色，如10之前所示，但浓度可以单独确定。 - 7天后，使用移液器除去含有一抗的溶液，并用1%Triton X-100溶液洗涤心脏3次（每次在室温下在轨道振荡器上洗涤1小时）。
- 洗涤后，将心脏=与Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG（稀释度为1：200）和Alexa Fluor 647山羊抗兔IgG（稀释度为1：200）在4°C下孵育7天。
- 7天后，使用移液器除去所有含有二抗的溶液。然后使用洗涤溶液（表1）洗涤心脏3次（每次在室温下在轨道振荡器上洗涤1小时）。
- 要对细胞核进行染色，请将心脏在 DAPI 溶液 （10 μg/mL） 中在 4 °C 下孵育过夜。
- 第二天，用洗涤溶液洗涤心脏3次（每次在室温下在轨道摇床上洗涤1小时）。
注意：对于步骤3.1，3.2，3.4和3.6中的封闭，透化，抗体孵育和DAPI染色，将样品保持在4°C的稳态，无需搅拌。染色的组织可以在4°C下用洗涤溶液完全覆盖并避光几天，直到在共聚焦显微镜上成像。
4. 共聚焦显微镜
- 准备Plexiglas环并填充橡皮泥（图1）。在橡皮泥的中心形成一个小凹槽，用于装载心脏。在步骤4.4中，做一个浅凹槽，因为这更容易获得平坦的成像平面，并调整空间并避免样品和盖玻片之间的气泡。
- 使用相同的心脏样本按顺序对 SAN 和 AVN 进行成像。对于 SAN 成像，直接加载心脏，而对于 AVN 成像，在之前进行显微切割。
- SAN 映像
- 通过解剖标志物识别SAN：它位于腔间区域（上腔静脉和下腔静脉之间的区域）内的心脏背侧。终突（CT）是SAN和RAA之间的肌肉条纹。
- 将心脏放入橡皮泥槽中，心脏背面朝上。将PBS添加到心脏上以置换腔内的所有空气，直到心脏完全被PBS覆盖（通常几滴PBS就足够了）。
- 在解剖显微镜下，将RAA，LAA和左心室的其余部分轻轻按入橡皮泥中以固定心脏。确保可以清楚地看到整个腔间区域和末端吼肘（未被橡皮泥覆盖）。将成像的区域如图 3A所示。
- AVN 成像
- 完成SAN成像后，重新收集相同的样品，随后用于AVN成像。对于AVN显微切割，将心脏=放在解剖显微镜下的解剖盘上。
- 使心脏右侧朝上（包括右心室的其余部分）定向。将针穿过LV自由壁的其余部分（现在位于底部）以固定组织（图2B）。
- 通过三尖瓣和上腔静脉向上切开剩余的无右心室壁。然后将 RV 和 RA 翻转开，露出室间和房间隔。（图3B）
注意：注意不要损伤冠状窦（CS），因为它是找到Koch三角形的重要解剖标志，然后可以定位AVN。CS在心脏后侧的左房室沟中横向运行，CS口开口位于IVC和房间隔下部的三尖瓣之间（图3A 和B）。 - 识别可在右心房心内膜表面找到的 Koch 三角形，前边界为三尖瓣 （TV） 隔叶的铰链线，后方与 Todaro 肌腱接壤。基底由冠状窦的孔形成（图3B）。由于这是AVN成像的目标区域，因此需要清晰可见。
- 将心脏转移到Plexiglas环内的橡皮泥槽中，科赫三角形明显暴露（即没有被橡皮泥覆盖）。轻轻地将科赫三角形周围的组织按入橡皮泥中以固定样品。将PBS添加到心脏上以置换腔内的所有空气，直到心脏完全被PBS覆盖（通常几滴PBS就足够了）。
- SAN 映像
- 将硅胶涂在Plexiglas环的边缘，以便用盖玻片覆盖填充橡皮泥的Plexiglas环内的心脏。
- 轻轻按压橡皮泥的背面以挤出PBS的一部分并将心脏连接到盖玻片上，同时避免成像区域内出现任何气泡。
注意： 确保在按压橡皮泥的背面时未折叠和覆盖感兴趣的区域。没有样品过度压缩的平面成像平面对于保存解剖结构和样品的正确共聚焦成像是必要的。对于 SAN，重要的是要确保腔间区域清晰暴露。对于AVN，科赫三角形应该完全暴露。 - 将整个安装染色样品倒置在共聚焦显微镜的平台上。附在盖玻片上的暴露的SAN/AVN现在位于显微镜平台的底部（图4）。
注意：要拍摄图像，我们使用带有Airyscan单元的卡尔蔡司LSM800和软件ZEN 2.3 SP1黑色。 - 选择板“BP420-480 + LP605”来激发Alexa Fluor 647共轭抗HCN4。改变主增益范围为650-750。
- 使用 切片扫描 功能获取整个SAN和AVN区域的概述图像。然后，通过单击并在将要扫描的感兴趣区域周围的概述图像上添加一个正方形来选择 HCN4 阳性区域。
- 检查共聚焦显微镜其余通道（Alexa Fluor 488和DAPI）的参数，包括板和主增益，并按照步骤4.6中所述进行设置。
- 从样本的顶部到底部缓慢调整焦点以预览整个样品，并为 Z 堆栈范围设置“ 第一个 ”和 “最后一个 ”。根据光学样品的厚度为 Z 堆栈设置最佳间隔。我们使用20倍物镜，0.8-1μm作为Z堆栈的间隔。
- 正确设置所有参数后，扫描 SAN 和 AVN 的整个区域。
- 使用软件（例如，Imaris 版本 8.4.2）对图像进行 3D 重建。
- 选择 图像处理 |基线减法 以去除背景染色。
- 在所选通道和感兴趣区域的设置上选择曲面创建以进行处理。
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Representative Results
通过使用上述协议，可以可靠地执行SAN和AVN的共聚焦显微镜成像。使用靶向HCN4的荧光抗体对传导系统进行特异性染色，并使用靶向Cx43的荧光抗体对工作心肌进行染色，可以清晰地识别完整解剖结构内的SAN（图5，视频1）和AVN（图6，视频2）。
图 1：用于解剖和Plexiglas环支架的仪器。A.Plexiglas装满橡皮泥的环（红色箭头表示在中心形成的用于装载心脏的凹槽）。 B.用琼脂糖凝胶解剖培养皿。 C.弹簧剪刀。 D.虹膜剪刀。 E.弯曲的镊子。 F.细镊子。 请点击此处查看此图的大图。
图2：心脏大体解剖结构示意图。 SAN显微切割的示意图。针通过顶点和左心耳 （LAA） 施加。SAN 由红色虚线圆圈表示。 二. AVN显微切割示意图。销钉穿过无 LV 壁的其余部分（现在位于底部）。AVN 由红色虚线圆圈表示。SVC，上腔静脉;IVC，下腔静脉;CS，冠状窦;LAA，左心耳;RAA，右心耳;肺动脉;PV，肺静脉;左心室，左心室;IVS，室间隔;IAS，房间隔;OF，椭圆形窝。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：SAN 和 AVN 在成年小鼠心脏中的位置。 成年小鼠心脏中窦房结 （SAN） 的位置。从心底看。SAN 的位置由腔间区域内的红色虚线（黑色虚线）表示。SVC，上腔静脉;IVC，下腔静脉;CS，冠状窦;LAA，左心耳;RAA，右心耳;PV，肺静脉;CT，克里斯塔终端;左心室，左心室;右心室，右心室。 二. 成年小鼠心脏中房室结 （AVN） 的位置。从右侧查看。AVN（红色虚线圆圈）位于科赫三角形（白色虚线三角形）的顶点，靠近膜隔底部。科赫三角形由Todaro的肌腱（TT，绿色虚线），三尖瓣（TV，蓝色虚线）和冠状窦口（CS，黄色虚线）形成。上腔静脉、上腔静脉;IVC，下腔静脉;IVS，室间隔;OF，椭圆形窝。 请点击此处查看此图的大图。
图4：在共聚焦显微镜上加载的制备样品。 制备的用于共聚焦显微镜的样品（红色箭头）与橡皮泥（黑色箭头）一起安装到Plexiglas环中。从底部查看。 二. Plexiglas环，将已安装的样品倒置在共聚焦显微镜（逆显微镜）的平台上。 请点击此处查看此图的大图。
图5.在用抗HCN4（红色）和Cx43（白色）抗体染色的C57BL6 / J小鼠中重建SAN的共聚焦显微镜成像。一个。 虚线区域描绘了 SAN，它沿着上腔静脉和下腔静脉之间的腔间区域定向。 二. 镶嵌体的放大倍率来自面板 A. C. 面板 B. RAA，右心耳的 3D 重建;RA，右心房;SAN，窦房结。 请点击此处查看此图的大图。
图6.在用抗HCN4（红色）和Cx43（白色）抗体染色的C57BL6 / J小鼠中重建AVN的共聚焦显微镜成像。一个。 虚线区域表示 AVN。 B 。 面板 A. C 的镶嵌放大倍数B.面板的3D重建。 IVS，室间隔;IAS，房间隔;AVN，房室结。 请点击此处查看此图的大图。
图7.阴性对照图像。一个。 SAN 阴性对照全封口染色。虚线圆圈表示由解剖特征点确认的 SAN 区域。 二. 仅使用第二抗体对 SAN 进行阴性对照染色。 三. DAPI 染色 SAN 。 D.AVN 的阴性对照全封口染色。虚线圆圈表示由解剖特征点确认的 AVN 区域。 E. 仅用第二抗体对AVN进行阴性对照染色。 F. DAPI 染色针对 AVN. RAA，右心耳;RA，右心房;上腔静脉、上腔静脉;IVS，室间隔;IAS，房间隔; 请点击此处查看此图的大图。
视频 1：SAN 的 3D 重建 请单击此处下载此视频。
视频 2：AVN 的 3D 重建 请点击此处下载此视频。
| 复合 | 最终浓度 | 需要克或毫升/100 毫升 | |
| 固定解决方案 | |||
| 甲醛 （16%） | 4% | 25毫升 | |
| 公共广播公司 （1x） | 75毫升 | ||
| 1% 海卫一溶液 | |||
| 海卫一 X100 | 1% | 1毫升 | |
| 公共广播公司 | 99毫升 | ||
| 阻断解决方案 | |||
| 海卫一 X-100 | 1% | 1毫升 | |
| 软件联盟 | 0.50% | 0.5 克 | |
| 正常山羊血清 | 20% | 20毫升 | |
| 公共广播公司 （1x） | 89毫升 | ||
| 洗涤液 | |||
| 吐温 20 | 0.10% | 0.1毫升 | |
| 软件联盟 | 0.50% | 0.5 克 | |
| 公共广播公司 （1x） | 99.9毫升 | ||
| 泰（50倍） | |||
| 三基 | 24.20% | 24.2 克 | |
| 100%醋酸 | 5.71% | 5.71毫升 | |
| 0.5 米 EDTA | 0.05 米 | 10毫升 | |
| dH2O | 最多可添加 100 mL | ||
表 1.
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Discussion
传统上，心脏解剖学研究使用薄的组织学切片11。然而，这些方法不保留传导系统的三维结构，因此仅提供2D信息。此处描述的全卡口免疫荧光染色方案可以克服这些限制，并且可以常规用于SAN和AVN成像。
与需要石蜡包埋、切片和抗原修复的常规免疫组织化学等标准方法相比，全卡口方法有利于解决SAN和AVN的精确3D定位和形态，并检查与周围组织的关系，因为组织形态得以显着保留，只有最小的组织脱水和物理破裂。此外，免疫反应性（即抗体与组织抗原的结合）也得到高度维持。
我们通过使用填充有橡皮泥12，13的塑料环形安装支架建立了一种用于共聚焦显微镜的实用样品处理方法。橡皮泥是理想的选择，因为它可以根据组织的大小单独调整，它足够坚硬，可以在不对组织施加过大压力的情况下可靠地固定组织。最重要的是，它不是荧光的，避免了自发荧光背景，因此不会干扰所用抗体的荧光信号。
我们将共聚焦激光扫描显微镜（LSM-Zeiss）与Airyscan探测器一起使用，它可以在获得高质量图像方面提供明显的优势。使用宽视场成像显微镜只能提供组织水平的信息，但缺乏细胞分辨率。此外，宽视场显微镜存在高背景的风险14。通过使用用于共聚焦LSM的Airyscan探测器，与传统的针孔和探测器共聚焦成像系统15相比，可以获得更高的分辨率和信噪比（SNR）。
SAN和AVN的形状和位置以3D重建的形式呈现，从3D重建中获得的其他虚拟切片平面可以增强对组织学切片的解释，而传统的组织学仅允许对解剖结构进行2D评估，具有无法检测到小而相关结构的固有风险。此外，3D重建提供了通过壁和完整微环境检查感兴趣的解剖结构的机会，例如支配心脏的内在自主神经丛16。整体安装原位染色和 3D 重建允许研究细胞环境以及特定的细胞类型及其方向。此外，区域和细胞类型特异性蛋白表达可以可视化，并可能进一步支持蛋白质印迹和蛋白质组学分析17。
SAN 和 AVN 是心脏内的特殊结构，具有不同的离子通道和连接蛋白表达模式，可用于可靠识别10，18。超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道（HCN）在起搏器细胞中建立了舒张脱极化，因此在传导系统中特异性表达，HCN4是小鼠中的主要亚型19。研究表明，HCN4是整个SAN和AVN11，20中可检测且稳定表达的HCN亚型之一。连接蛋白直接连接相邻细胞，并允许离子在细胞之间通过;因此，它们对于通过心脏传导电脉冲至关重要21。连接蛋白表达模式在心脏的不同区域之间有所不同，Cx43是最丰富的亚型，除了SAN和AVN22之外，几乎在心脏的所有部位都发现了这种亚型。结合显微切割以允许使用抗HCN4和抗CX43抗体曝光感兴趣的特定区域，以及在计算机方法中用于共聚焦图像的三维重建，可以可靠地识别SAN和AVN，并全面研究SAN/AVN形态以及它们与周围组织的相互作用。
用特异性抗体染色后，SAN 和 AVN 可能很容易区分。然而，要通过解剖标志定位SAN和AVN，在进行正确的显微切割之前，需要进行一些练习。
使用上述方案，还可以应用许多其他抗原。该方案也适用于灌注固定和浸入固定组织。然而，孵育时间可以调整以获得最佳固定，因为当抗原过度固定时，某些抗体显示出免疫反应性降低。由于全封口染色方法需要 7 天的一抗和二抗孵育时间，因此将样品完全浸没在足够体积的含抗体溶液中非常重要。每种抗体的稀释比例应在实验前进行测试。为了获得最佳染色效果，应去除任何不相关的组织。对于该方案，我们只保留了心室的一小部分，以便更好地定向，并去除了所有周围的脂肪组织和肺静脉，因为周围的（不相关的）组织也可能结合抗体，特别是当靶抗原全局表达时。
全安装原位染色、共聚焦成像和 3D 重建对于各个领域的研究人员来说是一种宝贵而强大的技术。但是，该方法也有一些局限性。（i） 它需要专门的设备，例如并非每个机构都普遍拥有的共聚焦显微镜。（ii）如上所述，对SAN或AVN等特殊解剖结构进行显微解剖，以及共聚焦成像和成像后处理，需要密集的实践和经验丰富的人员。（iii）该方法的成功在很大程度上取决于所用抗体的质量，因此在某些情况下可能非常具有挑战性。此外（iv）3D重建可能难以实现，可能需要密集的故障排除以优化程序。例如，在图像采集期间必须设置最佳间隔，因为间隔太远的部分会留下间隙，并且可能无法对解剖结构进行充分的3D重建。太近的部分可能会由于过度照明而导致过采样和漂白，并且需要很长时间才能完成一个图像。最后（v）共聚焦显微镜的主要限制是成像深度，这意味着如果样品厚度超过共聚焦显微镜的最大工作深度，则无法检测到进一步的荧光团。
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Disclosures
提交人声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家留学基金委（CSC，对R. Xia），德国心血管研究中心（DZHK;81X2600255给S. Clauss，81Z0600206给S. Kääb），科罗纳基金会（S199/10079/2019给S. Clauss），SFB 914（项目Z01给H. Ishikawa-Ankerhold和S. Massberg，项目A10到C. Schulz），ERA-NET心血管疾病（ERA-CVD;01KL1910给S. Clauss）和Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung（给S. Clauss）的支持。资助者在手稿准备中没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglass ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |
References
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Tags
医学，第166期，窦房结，房室结，心脏病学，电生理学，心脏传导系统，显微解剖，免疫荧光，共聚焦显微镜Erratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
