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माउस में सिनोट्रियल और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड के पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग, कॉन्फोकल इमेजिंग और 3 डी पुनर्निर्माण

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/62058
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2,3, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

ERRATUM NOTICE

Summary

हम मुराइन दिल में साइनोएट्रियल नोड (एसएएन) और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) के पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

सिनोएट्रियल नोड (एसएएन) में पेसमेकर कोशिकाओं द्वारा शारीरिक रूप से उत्पन्न विद्युत संकेत चालन प्रणाली के माध्यम से आयोजित किया जाता है, जिसमें पूरे दिल के उत्तेजना और संकुचन की अनुमति देने के लिए एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) शामिल है। सैन या एवीएन की किसी भी शिथिलता के परिणामस्वरूप अतालता होती है, जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और अरिदमोजेनेसिस में उनकी मौलिक भूमिका का संकेत देती है। माउस मॉडल का व्यापक रूप से अतालता अनुसंधान में उपयोग किया जाता है, लेकिन सैन और एवीएन की विशिष्ट जांच चुनौतीपूर्ण बनी हुई है।

सैन बेहतर वेना कावा के साथ क्रिस्टा टर्मिनलिस के जंक्शन पर स्थित है और एवीएन कोच के त्रिकोण के शीर्ष पर स्थित है, जो कोरोनरी साइनस के छिद्र, ट्राइकसपिड एन्यूलस और टोडारो के कण्डरा द्वारा बनाया गया है। हालांकि, छोटे आकार के कारण, पारंपरिक हिस्टोलॉजी द्वारा विज़ुअलाइज़ेशन चुनौतीपूर्ण रहता है और यह अपने 3 डी वातावरण के भीतर सैन और एवीएन के अध्ययन की अनुमति नहीं देता है।

यहां हम एक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं जो लेबल किए गए माउस सैन और एवीएन के स्थानीय विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। इस उद्देश्य के लिए, माउस के दिल को विच्छेदित किया जाता है, अवांछित ऊतक को हटा दिया जाता है, इसके बाद निर्धारण, परमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग होती है। सैन और एवीएन के भीतर चालन प्रणाली की कोशिकाओं को तब एंटी-एचसीएन 4 एंटीबॉडी के साथ दाग दिया जाता है। कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण नोडल कोशिकाओं और काम करने वाले कार्डियोमायोसाइट्स के बीच भेदभाव की अनुमति देते हैं, और स्पष्ट रूप से सैन और एवीएन को स्थानीयकृत करते हैं। इसके अलावा, अतिरिक्त एंटीबॉडी को अन्य सेल प्रकारों को लेबल करने के लिए भी जोड़ा जा सकता है, जैसे तंत्रिका फाइबर।

पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोलॉजी की तुलना में, होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हृदय चालन प्रणाली की शारीरिक अखंडता को संरक्षित करता है, इस प्रकार एवीएन की जांच की अनुमति देता है; विशेष रूप से उनकी शारीरिक रचना और आसपास के काम करने वाले मायोकार्डियम और गैर-मायोसाइट कोशिकाओं के साथ बातचीत में।

Introduction

अतालता लाखों लोगों को प्रभावित करने वाली आम बीमारियां हैं, और दुनिया भर में महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु दर का कारण हैं। उपचार और रोकथाम में भारी प्रगति के बावजूद, जैसे कि कार्डियक पेसमेकर का विकास, अतालता का उपचार चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, मुख्य रूप से अंतर्निहित रोग तंत्र 1,2,3 के बारे में बहुत सीमित ज्ञान के कारण। सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और अतालता के पैथोफिज़ियोलॉजी दोनों की बेहतर समझ भविष्य में नवीन, अभिनव और कारण उपचार रणनीतियों को विकसित करने में मदद कर सकती है। इसके अतिरिक्त, अरिदमोजेनेसिस का व्यापक रूप से अध्ययन करने के लिए, माउस जैसे पशु मॉडल में विशिष्ट कार्डियक चालन प्रणाली को स्थानीयकृत और कल्पना करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि चूहों का व्यापक रूप से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अनुसंधान में उपयोग किया जाता है।

कार्डियक चालन प्रणाली के प्रमुख भाग सिनोएट्रियल नोड (एसएएन) हैं, जहां विद्युत आवेग विशेष पेसमेकर कोशिकाओं में उत्पन्न होता है, और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन), जो एट्रिया और वेंट्रिकल्स4 के बीच एकमात्र विद्युत कनेक्शन है। जब भी सैन और एवीएन के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को बदल दिया जाता है, तो बीमार साइनस सिंड्रोम या एट्रियोवेंट्रिकुलर ब्लॉक जैसे अतालता हो सकती है जो हेमोडायनामिक गिरावट, सिंकोप और यहां तक कि मृत्यु का कारण बन सकती है, और इस प्रकार इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और एरिथमोजेनेसिस5 में सैन और एवीएन दोनों की आवश्यक भूमिका को रेखांकित करती है।

सैन या एवीएन पर व्यापक अध्ययन के लिए दोनों संरचनाओं के सटीक स्थानीयकरण और विज़ुअलाइज़ेशन की आवश्यकता होती है, आदर्श रूप से उनके शारीरिक वातावरण के भीतर। हालांकि, काम करने वाले मायोकार्डियम के भीतर उनके छोटे आकार और स्थान के कारण, एक स्पष्ट मैक्रोस्कोपिक रूप से दृश्यमान संरचना स्थापित किए बिना, सैन और एवीएन की शारीरिक रचना और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण है। एनाटोमिकल लैंडमार्क का उपयोग मोटे तौर पर उस क्षेत्र की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जिसमें सैन और एवीएन 6,7,8 शामिल हैं। संक्षेप में, सैन पेशी क्रिस्टा टर्मिनलिस (सीटी) से सटे दाहिने आलिंद के अंतर-कैवल क्षेत्र में स्थित है, एवीएन ट्राइकसपिड वाल्व, कोरोनरी साइनस के ओस्टियम और टोडारो के कण्डरा द्वारा स्थापित कोच के त्रिकोण के भीतर स्थित है। इस प्रकार, इन शारीरिक स्थलों का उपयोग मुख्य रूप से सैन और एवीएन को व्यक्तिगत संरचनाओं (जैसे, पारंपरिक हिस्टोलॉजी द्वारा) के रूप में स्थानीयकृत करने, हटाने और फिर अध्ययन करने के लिए किया गया था। सैन और एवीएन के जटिल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को बेहतर ढंग से समझने के लिए (उदाहरण के लिए, काम करने वाले मायोकार्डियम के आसन्न कोशिकाओं के नियामक प्रभाव), हालांकि, फिजियोलॉजिकल 3 डी वातावरण के भीतर चालन प्रणालियों का अध्ययन करना आवश्यक है।

होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग एक विधि है जिसका उपयोग आसपास के ऊतक9 की अखंडता को संरक्षित करते हुए सीटू में शारीरिक संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का लाभ उठाते हुए, सैन और एवीएन को फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी के साथ कल्पना की जा सकती है जो विशेष रूप से इन क्षेत्रों में व्यक्त आयन चैनलों को लक्षित करते हैं।

यह निम्नलिखित प्रोटोकॉल सैन और एवीएन माइक्रोस्कोप स्थानीयकरण और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित होल-माउंट स्टेनिंग विधि करने के लिए आवश्यक चरणों की व्याख्या करता है। विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल बताता है कि (1) स्टेनिंग और माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए इन नमूनों को तैयार करने के लिए शारीरिक स्थलों द्वारा सैन और एवीएन को स्थानीयकृत करने के लिए (2) संदर्भ मार्कर एचसीएन 4 और सीएक्स 43 (3) के पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए सैन और एवीएन नमूने तैयार करने के लिए (4) सैन और एवीएन की कॉन्फोकल इमेजिंग करने के लिए। हम यह भी वर्णन करते हैं कि इस प्रोटोकॉल को आसपास के मायोकार्डियम या गैर-मायोसाइट कोशिकाओं जैसे स्वायत्त तंत्रिका तंतुओं के अतिरिक्त धुंधलापन को शामिल करने के लिए कैसे संशोधित किया जा सकता है जो हृदय के भीतर हृदय चालन प्रणाली की गहन जांच की अनुमति देता है।

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Protocol

पशु देखभाल और सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को म्यूनिख विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था, और चूहों पर की गई सभी प्रक्रियाओं को बवेरिया, म्यूनिख, जर्मनी (आरओबी -55.2-2532.Vet_02-16-106, आरओबी -55.2-2532.Vet_02-19-86) सरकार द्वारा अनुमोदित किया गया था। C57BL6/J चूहों को जैक्सन प्रयोगशाला से खरीदा गया था।

नोट: चित्रा 1 प्रयोग के लिए आवश्यक उपकरणों को दर्शाता है। चित्रा 2 सकल कार्डियक शरीर रचना विज्ञान का एक चित्रण दिखाता है। चित्रा 3 एक वयस्क माउस दिल में सैन और एवीएन के स्थान को दर्शाता है। चित्रा 4 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर लोड किए गए तैयार नमूने को दर्शाता है।

1. तैयारी

  1. पीबीएस के 30 एमएल में 16% फॉर्मलाडेहाइड घोल के 10 एमएल को पतला करके 4% फॉर्मलाडेहाइड समाधान (4% पीएफए) तैयार करें।
  2. क्रमशः 15 ग्राम और 30 ग्राम सुक्रोज पाउडर को 100 एमएल पीबीएस में घोलकर 15% सुक्रोज समाधान और 30% सुक्रोज समाधान तैयार करें। सुक्रोज पाउडर पूरी तरह से घुल जाने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने से पहले 0.2 μm सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें।
  3. एक बीकर में 3% -4% अगारोस जेल तैयार करें, 3 ग्राम या 4 ग्राम अगारोस पाउडर और 100 एमएल 1 एक्स टीएई (50 एक्स टीएई स्टॉक समाधान से पतला) जोड़ें। बीकर को एक चुंबकीय हलचल पर रखें और इसे तब तक उबालें जब तक कि अगारोस पूरी तरह से घुल न जाए।
  4. 100 मिमी व्यास पेट्री डिश में धीरे से 30 एमएल अगारोस जेल (3% -4%) डालकर विच्छेदन डिश तैयार करें। पेट्री डिश को कमरे के तापमान पर बेंच पर ठंडा करने और सख्त होने के लिए छोड़ दें।
  5. तालिका 1 में दिए गए व्यंजनों के अनुसार ब्लॉकिंग समाधान और धोने का समाधान तैयार करें। उपयोग के दिन तैयार किए गए सभी समाधान तैयार करें। दीर्घकालिक भंडारण की सिफारिश नहीं की जाती है।
  6. ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) 1x PBS में उन्हें पतला करके एंटीबॉडी समाधान तैयार करें, कमजोर पड़ने को प्रकाश से बचाएं (उदाहरण के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी को चारों ओर लपेटकर) और उपयोग होने तक बर्फ पर कमजोर रखें। इनक्यूबेशन से कुछ समय पहले एंटीबॉडी को पतला करें। कमरे के तापमान पर पतला एंटीबॉडी छोड़ने से बचें।
    नोट: उचित एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का परीक्षण पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला करके तुलनीय ऊतक नमूनों के साथ किया जाना चाहिए। यहां, हमने 10 μm की मोटाई पर काटे गए जमे हुए वर्गों को धुंधला करके एंटीबॉडी का परीक्षण किया।

2. अंग की फसल और ऊतक तैयार करना

  1. माउस को आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र से जुड़े इनक्यूबेशन कक्ष में रखकर एनेस्थेटाइज करें। वेपोराइज़र को 4-5% आइसोफ्लुरेन (क्रमशः 96-95% ऑक्सीजन) देने के लिए सेट करें।
    नोट: पूर्ण संज्ञाहरण की पुष्टि पोस्टुरल प्रतिक्रिया के नुकसान से होती है और कक्ष को धीरे से घुमाकर रिफ्लेक्स को सही किया जाता है जब तक कि माउस को उसकी पीठ पर नहीं रखा जाता है।
  2. माउस को सर्जिकल टेबल पर लापरवाह स्थिति में रखें। माउस नाक को एक संशोधित बैन सर्किट से जुड़े संज्ञाहरण मास्क में रखें, जिसकी आंतरिक ट्यूब आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र से जुड़ी होती है। संज्ञाहरण को बनाए रखने के लिए, 1 एल / मिनट की प्रवाह दर पर ऑक्सीजन में 1-2% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करें। मुखौटे की बाहरी ट्यूब के माध्यम से माउस से अतिरिक्त एनेस्थेटिक वाष्प को हटा दें और सक्रिय लकड़ी का कोयला के कनस्तर के माध्यम से खींचें, जो अतिरिक्त एनेस्थेटिक गैस को अवशोषित करता है।
  3. जब पूर्ण संज्ञाहरण प्राप्त किया जाता है, तो एनाल्जेसिया (0.1 μजी / 25 ग्राम शरीर के वजन यानी) के लिए फेंटानिल इंजेक्ट करें।
  4. जब पैर की अंगुली-चुटकी रिफ्लेक्स का पता नहीं चल पाता है, तो फर और त्वचा को हटाने के लिए आईरिस कैंची का उपयोग करके जुगुलम से सिम्फिसिस तक एक स्पष्ट कट बनाएं। पेट को सावधानी से खोलने के लिए आईरिस कैंची का उपयोग करके पसलियों के नीचे बाएं से दाएं एक और कट बनाएं।
  5. किसी भी अंग को चोट पहुंचाए बिना डायाफ्राम को बाएं से दाएं काटने की अनुमति देने के लिए घुमावदार बल का उपयोग करके ज़िफॉइड को थोड़ा सा जीवन दें। पसली के पिंजरे को दोनों तरफ एक औसत दर्जे की एक्सिलरी लाइन में काटें ताकि इसे कपाल रूप से फ्लिप किया जा सके और दिल तक पहुंच की अनुमति मिल सके।
  6. आइरिस कैंची का उपयोग करके डायाफ्राम के स्तर पर अवर वेना कावा और अवरोही वक्ष महाधमनी को काटें। शीर्ष के क्षेत्र में 27 जी सुई के साथ दिल को पंचर करें और फिर सुई को सावधानीपूर्वक बाएं वेंट्रिकल (एलवी) में धकेलें। धीरे से दिल को शांत करने के लिए एलवी में 5-10 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस इंजेक्ट करें।
    नोट: दिल का रंग लाल से ग्रे में बदलना चाहिए जो पीबीएस के साथ सफल छिड़काव का संकेत देता है।
  7. एक चिमटी का उपयोग करके दिल के शीर्ष को ध्यान से उठाएं जिससे बड़ी वाहिकाओं को काटने और दिल को हटाने की अनुमति मिलती है।
  8. सुपीरियर वेना कावा (एसवीसी) को किसी भी नुकसान से बचने के लिए दिल से जितना संभव हो सके बड़ी धमनियों और नसों को काटकर दिल को एक्साइज करें। एसवीसी का संरक्षण करें क्योंकि यह बाद में प्रसंस्करण के दौरान महत्वपूर्ण मील का पत्थर के रूप में काम करेगा।
  9. दिल को हटाने के बाद, आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र को बंद कर दें।
  10. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत बर्फ ठंडे पीबीएस से भरे विच्छेदन पकवान में दिल डालें। दिल के बाएं / दाएं और सामने / पीछे के निर्धारण के बाद, डिश के नीचे दिल के सामने के साथ दिल को घुमाएं (पीछे स्थित बड़ी वाहिकाओं को उजागर करने के लिए)।
  11. विच्छेदन डिश (चित्रा 2 ए) के निचले भाग में एपेक्स और बाएं एट्रियल उपांग (एलएए) के माध्यम से थोड़ा पिन डालकर दिल को स्थिर करें। बारीक चिमटी और कैंची का उपयोग करके, अंतर-कैवल क्षेत्र को उजागर करने के लिए एसवीसी और अवर वेना कावा (आईवीसी) (जैसे, फेफड़े, वसा, पेरिकार्डियम) के आसपास गैर-हृदय ऊतक को सावधानीपूर्वक हटा दें (चित्रा 3 ए)।
  12. माइक्रो कैंची के साथ वेंट्रिकल्स और एट्रिया के बीच समानांतर नाली काटकर अधिकांश वेंट्रिकल्स को हटा दें। प्लेक्सीग्लास रिंग पर बाद में लोडिंग के लिए वेंट्रिकुलर ऊतक के एक छोटे से हिस्से को संरक्षित करें।
  13. निर्धारण और निर्जलीकरण के लिए, नमूना (एट्रिया, एसवीसी और आईवीसी युक्त) को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए में रखें।
  14. अगले दिन, दिल को 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 15% सुक्रोज समाधान में स्थानांतरित करें।
  15. अगले दिन, दिल को 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 30% सुक्रोज समाधान में स्थानांतरित करें।
    नोट: चरण 2.13, 2.14 और 2.15 में निर्धारण और निर्जलीकरण के लिए, नमूने को आगे हिलाने या हिलाने के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दिया जाता है।

3. होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. पीबीएस में पतला 1% ट्राइटन एक्स -100 में दिल को धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ब्लॉक समाधान (तालिका 1) में ब्लॉक और परमेबिलाइज करें।
  2. दिल को 1.5 एमएल ट्यूब में रखें और खरगोश एंटी-माउस कॉनेक्सिन -43 (1:200 का कमजोर पड़ना) और चूहे एंटी-माउस एचसीएन 4 (1:200 का कमजोर पड़ना) एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें, जो 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए ब्लॉकिंग समाधान के साथ पतला होता है।
    नोट: अभिविन्यास के रूप में डेटाशीट का उपयोग करने से पहले प्राथमिक एंटीबॉडी की इष्टतम एकाग्रता का परीक्षण किया जाना चाहिए। इस चरण में रुचि के अन्य एंटीजन भी दाग दिए जा सकते हैं, जब तक कि प्राथमिक एंटीजन की मेजबान प्रजातियां अन्य लोगों से अलग हों। ट्राइटन एक्स -100 की उच्च सांद्रता10 से पहले प्रदर्शित अधिक कुशल एंटीबॉडी धुंधला प्राप्त करने में मदद कर सकती है, लेकिन एकाग्रता व्यक्तिगत रूप से निर्धारित की जा सकती है।
  3. 7 दिनों के बाद, पिपेट का उपयोग करके प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान को हटा दें और दिल को 1% ट्राइटन एक्स -100 समाधान के साथ 3 बार धोएं (कक्षीय शेकर पर कमरे के तापमान पर हर बार 1 घंटे के लिए)।
  4. धोने के बाद, दिल को इनक्यूबेट करें = एलेक्सा फ्लूर 488 बकरी एंटी-रैट आईजीजी (1:200 का कमजोर पड़ना) और एलेक्सा फ्लोर 647 बकरी एंटी-खरगोश आईजीजी (1:200 का कमजोर पड़ना) 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए।
  5. 7 दिनों के बाद, पिपेट का उपयोग करके द्वितीयक एंटीबॉडी युक्त सभी समाधान को हटा दें। फिर धोने के घोल (तालिका 1) का उपयोग करके दिल को 3 बार धोएं (कक्षीय शेकर पर कमरे के तापमान पर हर बार 1 घंटे के लिए)।
  6. नाभिक को दागने के लिए, दिल को डीएपीआई समाधान (10 μg / mL) में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. अगले दिन, 3 बार धोने के घोल के साथ दिल को धोएं (कक्षीय शेकर पर कमरे के तापमान पर हर बार 1 घंटे के लिए)।
    नोट: चरण 3.1, 3.2, 3.4 और 3.6 में ब्लॉकिंग, परमेबिलाइजेशन, एंटीबॉडी इनक्यूबेशन और डीएपीआई धुंधला करने के लिए, नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस में स्थिर अवस्था में छोड़ दें, कोई सरगर्मी की आवश्यकता नहीं है। दाग वाले ऊतक को 4 डिग्री सेल्सियस पर धोने के घोल के साथ पूरी तरह से कवर किया जा सकता है और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग तक कुछ दिनों के लिए प्रकाश से संरक्षित किया जा सकता है।

4. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. प्लेक्सीग्लास रिंग तैयार करें और प्लास्टिसिन से भरें (चित्रा 1)। प्लास्टिसिन के केंद्र में दिल को लोड करने के लिए केंद्र में एक छोटी सी नाली बनती है। एक उथला नाली बनाएं, क्योंकि यह एक फ्लैट इमेजिंग विमान प्राप्त करना आसान होगा, और अंतरिक्ष को समायोजित करना और चरण 4.4 में नमूने और कवरलिप्स के बीच हवा के बुलबुले से बचना होगा।
  2. क्रमिक रूप से सैन और एवीएन दोनों की इमेजिंग के लिए एक ही दिल के नमूने का उपयोग करें। सैन इमेजिंग के लिए, सीधे दिल को लोड करें जबकि एवीएन इमेजिंग के लिए, पहले माइक्रोडिसेक्शन करें।
    1. सैन इमेजिंग
      1. शारीरिक स्थलों द्वारा सैन की पहचान करें: यह अंतर-कैवल क्षेत्र (बेहतर और अवर वेना कावा के बीच का क्षेत्र) के भीतर दिल के पृष्ठीय पक्ष पर स्थित है। क्रिस्टा टर्मिनलिस (सीटी) सैन और आरएए के बीच मांसपेशियों की लकीर है।
      2. दिल को प्लास्टिसिन नाली में रखें जिसमें दिल का पिछला हिस्सा ऊपर की ओर हो। गुहा के भीतर सभी हवा को विस्थापित करने के लिए दिल पर पीबीएस जोड़ें जब तक कि दिल पीबीएस के साथ पूरी तरह से कवर न हो जाए (आमतौर पर पीबीएस की कुछ बूंदें पर्याप्त होती हैं)।
      3. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, दिल को ठीक करने के लिए प्लास्टिसिन में धीरे से आरएए, एलएए और बाएं वेंट्रिकल के शेष हिस्सों को दबाएं। सुनिश्चित करें कि पूरे अंतर-कैवल क्षेत्र और क्रिस्टा टर्मिनल को स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है (प्लास्टिसिन द्वारा कवर नहीं किया गया है)। जिस क्षेत्र को चित्रित किया जाएगा वह चित्र 3 ए में दिखाया गया है।
    2. एवीएन इमेजिंग
      1. सैन की इमेजिंग खत्म करने के बाद, उसी नमूने को याद करें और बाद में एवीएन इमेजिंग के लिए उपयोग करें। एवीएन माइक्रोडिसेक्शन के लिए, विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदन डिश पर दिल = रखें।
      2. दिल को दाईं ओर उन्मुख करें (दाएं वेंट्रिकल के शेष हिस्सों सहित)। ऊतक को गतिहीन करने के लिए एलवी मुक्त दीवार (जो अब नीचे है) के शेष भाग के माध्यम से पिन डालें (चित्रा 2 बी)।
      3. शेष आरवी मुक्त दीवार को ट्राइकसपिड वाल्व और बेहतर वेना कावा के माध्यम से ऊपर की ओर काटें। फिर इंटरवेंट्रिकुलर और इंटरट्रियल सेप्टम को उजागर करने के लिए आरवी और आरए को दूर फ्लिप करें। (चित्र 3B)
        नोट: कोरोनरी साइनस (सीएस) को नुकसान न पहुंचाने पर ध्यान दें, क्योंकि कोच के त्रिकोण को खोजने के लिए यह एक महत्वपूर्ण शारीरिक मील का पत्थर है जो तब एवीएन को स्थानीयकृत करने की अनुमति देता है। सीएस हृदय के पीछे की ओर बाएं एट्रियोवेंट्रिकुलर नाली में अनुप्रस्थ रूप से चलता है, और सीएस छिद्र उद्घाटन इंटरट्रियल सेप्टम (चित्रा 3 ए और बी) के अवर भाग में आईवीसी और ट्राइकसपिड वाल्व के बीच स्थित है।
      4. कोच के त्रिकोण की पहचान करें जो दाहिने आलिंद की एंडोकार्डियल सतह पर पाया जा सकता है, जो ट्राइकसपिड वाल्व (टीवी) के सेप्टल पत्रक की हिंज-लाइन से घिरा हुआ है, और पीछे की ओर टोडारो के कण्डरा से घिरा हुआ है। आधार कोरोनरी साइनस (चित्रा 3 बी) के छिद्र द्वारा बनता है। चूंकि यह एवीएन इमेजिंग के लिए लक्ष्य क्षेत्र है, इसलिए इसे स्पष्ट रूप से दिखाई देने की आवश्यकता है।
      5. प्लेक्सीग्लास रिंग के भीतर प्लास्टिसिन नाली में दिल को स्थानांतरित करें, जिसमें कोच का त्रिकोण स्पष्ट रूप से उजागर हो रहा है (यानी प्लास्टिसिन द्वारा कवर नहीं किया गया है)। नमूना ठीक करने के लिए धीरे से कोच त्रिकोण के आसपास के ऊतक को प्लास्टिसिन में दबाएं। गुहा के भीतर सभी हवा को विस्थापित करने के लिए दिल पर पीबीएस जोड़ें जब तक कि दिल पीबीएस के साथ पूरी तरह से कवर न हो जाए (आमतौर पर पीबीएस की कुछ बूंदें पर्याप्त होती हैं)।
  3. प्लास्टिक से भरे प्लेक्सीग्लास रिंग्स के भीतर लोड किए गए दिलों को कवर स्लिप के साथ कवर करने की अनुमति देने के लिए प्लेक्सीग्लास रिंग्स के किनारों पर सिलिकॉन लागू करें।
  4. पीबीएस के कुछ हिस्सों को निचोड़ने के लिए धीरे से प्लास्टिसिन के पीछे की तरफ दबाएं और इमेजिंग क्षेत्र के भीतर किसी भी हवा के बुलबुले से बचते हुए दिल को कवरस्लिप से संलग्न करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि प्लास्टिसिन के पीछे की ओर दबाने के दौरान रुचि के क्षेत्रों को मोड़ा और कवर नहीं किया गया है। नमूना ओवरकंप्रेशन के बिना एक फ्लैट इमेजिंग विमान शरीर रचना विज्ञान के संरक्षण और नमूनों के उचित कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए आवश्यक है। सैन के लिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि अंतर-कैवल क्षेत्र स्पष्ट रूप से उजागर हो। एवीएन के लिए, कोच के त्रिकोण को पूरी तरह से उजागर किया जाना चाहिए।
  5. पूरे माउंट धुंधला नमूने को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के मंच पर ऊपर-साइड नीचे रखें। कवर स्लिप से जुड़ा उजागर सैन / एवीएन अब माइक्रोस्कोप प्लेटफॉर्म (चित्रा 4) के निचले हिस्से पर है।
    नोट: छवियों को लेने के लिए, हम Airyscan यूनिट और सॉफ्टवेयर ZEN 2.3 SP1 ब्लैक के साथ कार्ल Zeiss LSM800 का उपयोग करते हैं।
  6. एलेक्सा फ्लोर 647 संयुग्मित एंटी-एचसीएन 4 के उत्तेजना के लिए प्लेट "बीपी 420-480 + एलपी 605" चुनें। मास्टर लाभ को 650-750 से अलग करें।
  7. टाइल स्कैन फ़ंक्शन का उपयोग करके पूरे सैन और एवीएन क्षेत्र की एक अवलोकन छवि लें। फिर स्कैन किए जाने वाले रुचि के क्षेत्र के आसपास अवलोकन छवि पर क्लिक करके और जोड़कर एचसीएन 4-पॉजिटिव क्षेत्र का चयन करें।
  8. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के शेष चैनलों (एलेक्सा फ्लोर 488 और डीएपीआई) के लिए प्लेटों और मास्टर लाभ सहित मापदंडों की जांच करें और चरण 4.6 में वर्णित के रूप में सेट करें।
  9. धीरे-धीरे पूरे नमूने का पूर्वावलोकन करने और जेड-स्टैक रेंज के लिए पहला और अंतिम सेट करने के लिए नमूने के ऊपर से नीचे तक फोकस समायोजित करें। ऑप्टिकल नमूने की मोटाई के आधार पर जेड-स्टैक के लिए एक इष्टतम अंतराल सेट करें। हम जेड-स्टैक के लिए अंतराल के रूप में 20x उद्देश्य, और 0.8-1 μm का उपयोग करते हैं।
  10. सभी मापदंडों को ठीक से सेट करने के बाद, सैन और एवीएन के पूरे क्षेत्र को स्कैन करें।
  11. सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों का 3 डी पुनर्निर्माण करें (उदाहरण के लिए, इमारिस संस्करण 8.4.2)।
    1. छवियों का चयन करें प्रसंस्करण | पृष्ठभूमि धुंधलाहट को हटाने के लिए बेसलाइन घटाव।
    2. चयनित चैनल के लिए सेटिंग पर सतह निर्माण का चयन करें और प्रसंस्करण के लिए रुचि का क्षेत्र.

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Representative Results

ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, सैन और एवीएन दोनों की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग को मज़बूती से किया जा सकता है। एचसीएन 4 को लक्षित करने वाले फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग करके चालन प्रणाली का विशिष्ट धुंधलापन और सीएक्स 43 को लक्षित करने वाले फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग करके काम करने वाले मायोकार्डियम का धुंधला होना बरकरार शरीर रचना विज्ञान के भीतर एसएएन (चित्रा 5, वीडियो 1) और एवीएन (चित्रा 6, वीडियो 2) की स्पष्ट पहचान की अनुमति देता है।

Figure 1
चित्र 1: विच्छेदन और प्लेक्सीग्लास रिंग धारक के लिए उपकरण। प्लास्टिसिन से भरी प्लेक्सीग्लास रिंग (लाल तीर दिल को लोड करने के लिए केंद्र में गठित नाली को दर्शाता है)। बी. एगारोस जेल के साथ पेट्री डिश का विच्छेदन। सी. स्प्रिंग कैंची। डी. आइरिस कैंची। ई. घुमावदार बल। F. ठीक बल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: सकल कार्डियक एनाटॉमी का चित्रण। सैन माइक्रोडिसेक्शन का योजनाबद्ध चित्रण। पिन शीर्ष और बाएं एट्रियल उपांग (एलएए) के माध्यम से लागू होते हैं। सैन को लाल डैश्ड सर्कल द्वारा इंगित किया गया है। बी। एवीएन माइक्रोडिसेक्शन का योजनाबद्ध चित्रण। पिन को एलवी मुक्त दीवार के शेष भाग के माध्यम से रखा जाता है (जो अब नीचे है)। एवीएन को एक लाल डैश्ड सर्कल द्वारा इंगित किया जाता है। एसवीसी, सुपीरियर वेना कावा; आईवीसी, अवर वेना कावा; सीएस, कोरोनरी साइनस; एलएए, बाएं एट्रियल उपांग; आरएए, दाएं एट्रियल उपांग; पीए, फुफ्फुसीय धमनी; पीवी, फुफ्फुसीय नस; एलवी, बाएं वेंट्रिकल; आईवीएस, इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम; आईएएस, इंटरट्रियल सेप्टम; अंडाकार फोसा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: एक वयस्क माउस दिल में सैन और एवीएन का स्थान। एक वयस्क माउस दिल में साइनोएट्रियल नोड (एसएएन) का स्थान। दिल के पीछे से देखें। सैन का स्थान अंतर-कैवल क्षेत्र (काली डैश्ड लाइनों) के भीतर लाल डैश लाइन द्वारा इंगित किया जाता है। एसवीसी, सुपीरियर वेना कावा; आईवीसी, अवर वेना कावा; सीएस, कोरोनरी साइनस; एलएए, बाएं एट्रियल उपांग; आरएए, दाएं एट्रियल उपांग; पीवी, फुफ्फुसीय नस; सीटी, क्रिस्टा टर्मिनलिस; एलवी, बाएं वेंट्रिकल; आरवी, दाएं वेंट्रिकल। बी। एक वयस्क माउस दिल में एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) का स्थान। दाईं ओर से देखें। एवीएन (लाल डैश्ड सर्कल) झिल्लीदार सेप्टम के तल के पास कोच (सफेद डैश्ड त्रिकोण) के त्रिकोण के शीर्ष पर स्थित है। कोच का त्रिकोण टोडारो (टीटी, हरे डैश्ड लाइन), ट्राइकसपिड वाल्व (टीवी, ब्लू डैश्ड लाइन) और कोरोनरी साइनस (सीएस, पीले डैश्ड लाइन) के छिद्र से बनता है। एसवीसी, बेहतर वेना कावा; आईवीसी, अवर वेना कावा; आईवीएस, इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम; अंडाकार फोसा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर लोड किया गया नमूना। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार नमूना (लाल तीर) प्लास्टिसिन (काला तीर) के साथ प्लेक्सीग्लास रिंग में लगाया गया। नीचे से देखें। बी। कॉनफोकल माइक्रोस्कोप (व्युत्क्रम माइक्रोस्कोप) के मंच पर माउंटेड नमूने के साथ प्लेक्सीग्लास रिंग ऊपर-साइड-डाउन लोड किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5. एंटी-एचसीएन 4 (लाल) और सीएक्स 43 (सफेद) एंटीबॉडी से सना हुआ सी 57बीएल 6 / जे माउस में सैन के कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का पुनर्निर्माण। एक। धराशायी क्षेत्र सैन को चित्रित करता है, जो बेहतर और अवर वेना कावा के बीच अंतर-कैवल क्षेत्र के साथ उन्मुख है। बी। पैनल ए.सी. से इनले का आवर्धन। पैनल बी आरएए का 3 डी पुनर्निर्माण, दाएं एट्रियल उपांग; आरए, दाएं आलिंद; सैन, साइनोएट्रियल नोड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6. एंटी-एचसीएन 4 (लाल) और सीएक्स 43 (सफेद) एंटीबॉडी से सना एक सी 57बीएल 6 / जे माउस में एवीएन की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का पुनर्निर्माण। एक। डैश्ड क्षेत्र एवीएन को इंगित करता है। पैनल ए.सी. से इनले का आवर्धन। आईवीएस, इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम पैनल का 3 डी पुनर्निर्माण; आईएएस, इंटरट्रियल सेप्टम; एवीएन, एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7. नकारात्मक नियंत्रण छवि। एक। सैन के लिए नकारात्मक नियंत्रण पूरे माउंट धुंधला। धराशायी सर्कल ने एनाटॉमी लैंडमार्क द्वारा पुष्टि किए गए सैन क्षेत्र को दिखाया। बी। केवल दूसरे एंटीबॉडी के साथ सैन के लिए नकारात्मक नियंत्रण धुंधला। सी। सैन के लिए DAPI धुंधला। डी. एवीएन के लिए नकारात्मक नियंत्रण पूरे माउंट धुंधलापन। धराशायी सर्कल ने शरीर रचना स्थलों द्वारा पुष्टि किए गए एवीएन क्षेत्र को दिखाया। ई. केवल दूसरे एंटीबॉडी के साथ एवीएन के लिए नकारात्मक नियंत्रण धुंधला। F. एवीएन आरएए, दाएं एट्रियल उपांग के लिए डीएपीआई धुंधला; आरए, दाएं आलिंद; एसवीसी, बेहतर वेना कावा; आईवीएस, इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम; आईएएस, इंटरट्रियल सेप्टम; कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1: सैन का 3 डी पुनर्निर्माण कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: एवीएन का 3 डी पुनर्निर्माण कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

यौगिक अंतिम एकाग्रता g या mL/100 mL की आवश्यकता है
समाधान ठीक करना
फॉर्मलाडेहाइड (16%) 4% 25 mL
पीबीएस (1x) 75 mL
1% ट्राइटन समाधान
ट्राइटन एक्स100 1% 1 mL
पीबीएस 99 mL
ब्लॉकिंग समाधान
ट्राइटन एक्स-100 1% 1 mL
बीएसए 0.50% 0.5 ग्राम
सामान्य बकरी सीरम 20% 20 mL
पीबीएस (1x) 89 mL
धोने का घोल
ट्वीन 20 0.10% 0.1 एमएल
बीएसए 0.50% 0.5 ग्राम
पीबीएस (1x) 99.9 एमएल
TAE (50x)
Tris-base 24.20% 24.2 ग्राम
100% एसिटिक एसिड 5.71% 5.71 एमएल
0.5 एम ईडीटीए 0.05 M 10 mL
dH2O 100 mL तक जोड़ें

तालिका 1.

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Discussion

कार्डियक एनाटॉमी का अध्ययन पारंपरिक रूप से पतले हिस्टोलॉजिकल सेक्शन11 का उपयोग करके किया गया है। हालांकि, ये विधियां चालन प्रणाली की त्रि-आयामी संरचना को संरक्षित नहीं करती हैं और इस प्रकार, केवल 2 डी जानकारी प्रदान करती हैं। यहां वर्णित होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग प्रोटोकॉल इन सीमाओं को दूर करने की अनुमति देता है और सैन और एवीएन इमेजिंग के लिए नियमित रूप से उपयोग किया जा सकता है।

पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसे मानक तरीकों की तुलना में, जिन्हें पैराफिन-एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और एंटीजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता होती है, सैन और एवीएन के सटीक 3 डी स्थानीयकरण और आकृति विज्ञान को संबोधित करने और आसपास के ऊतक के साथ संबंधों की जांच करने के लिए पूरे-माउंट पद्धति फायदेमंद है क्योंकि ऊतक आकृति विज्ञान केवल न्यूनतम ऊतक निर्जलीकरण और शारीरिक टूटने के साथ काफी संरक्षित है। इसके अलावा, विकृति (यानी, ऊतक एंटीजन के लिए एंटीबॉडी का बंधन) भी अत्यधिक बनाए रखा जाता है।

हमने प्लास्टिसिन12,13 से भरे प्लास्टिक रिंग माउंटेड होल्डर का उपयोग करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए एक व्यावहारिक नमूना जुलूस विधि की स्थापना की। प्लास्टिसिन आदर्श है क्योंकि इसे व्यक्तिगत रूप से ऊतक के आकार में समायोजित किया जा सकता है, ऊतक के अत्यधिक दबाव के बिना ऊतक को मज़बूती से पकड़ना काफी कठिन है। सबसे महत्वपूर्ण बात, यह फ्लोरोसेंट नहीं है, ऑटो-फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि से बचता है और इसलिए उपयोग किए गए एंटीबॉडी के फ्लोरोसेंट सिग्नल के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है।

हमने एयरिस्कैन डिटेक्टर के साथ कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (एलएसएम-ज़ीस) का उपयोग किया, जो उच्च गुणवत्ता के साथ छवियों को प्राप्त करने में एक अलग लाभ प्रदान कर सकता है। वाइडफील्ड इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग केवल ऊतक-स्तर की जानकारी प्रदान कर सकता है लेकिन सेलुलर रिज़ॉल्यूशन का अभाव है। इसके अलावा, वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप उच्च पृष्ठभूमि14 का जोखिम उठाता है। कॉन्फोकल एलएसएम के लिए एक एयरिस्कैन डिटेक्टर का उपयोग करके, पारंपरिक एक पिनहोल-एंड-डिटेक्टर कॉन्फोकल इमेजिंग सिस्टम15 की तुलना में बेहतर रिज़ॉल्यूशन और सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) प्राप्त किया जा सकता है।

सैन और एवीएन के आकार और स्थिति को 3 डी पुनर्निर्माण के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और 3 डी पुनर्निर्माण से प्राप्त अतिरिक्त आभासी खंड विमान हिस्टोलॉजिकल वर्गों की व्याख्या को बढ़ा सकते हैं, जबकि पारंपरिक हिस्टोलॉजी छोटे लेकिन प्रासंगिक संरचनाओं का पता नहीं लगाने के अंतर्निहित जोखिम के साथ शरीर रचना विज्ञान के केवल 2 डी मूल्यांकन की अनुमति देता है। इसके अलावा, 3 डी पुनर्निर्माण पारस्परिक रूप से और बरकरार माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर रुचि की शारीरिक संरचनाओं की जांच करने का अवसर प्रदान करता है, उदाहरण के लिए आंतरिक स्वायत्त तंत्रिका प्लेक्स दिल16 को आंतरिक करता है। सीटू धुंधलापन और 3 डी पुनर्निर्माण में पूरे माउंट सेलुलर वातावरण के साथ-साथ विशिष्ट सेल प्रकारों और उनके अभिविन्यास की जांच की अनुमति देता है। इसके अलावा, क्षेत्रीय और सेल-प्रकार विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति की कल्पना की जा सकती है और आगे पश्चिमी धब्बा और प्रोटिओमिक्स विश्लेषण17 का समर्थन कर सकती है।

सैन और एवीएन हृदय के भीतर आयन चैनलों और कॉनेक्सिन के एक अलग अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ विशेष संरचनाएं हैं जिनका उपयोग विश्वसनीय पहचान10,18 के लिए किया जा सकता है। हाइपरपोलराइजेशन-सक्रिय चक्रीय न्यूक्लियोटाइड-गेटेड केशन चैनल (एचसीएन) पेसमेकर कोशिकाओं में डायस्टोलिक विध्रुवण स्थापित करते हैं और इसलिए विशेष रूप से चालन प्रणाली के भीतर व्यक्त किए जाते हैं जिसमें एचसीएन 4 माउस19 में प्रमुख आइसोफॉर्म होता है। अध्ययनों से पता चला है कि एचसीएन 4 एसएएन और एवीएन11,20 में पता लगाने योग्य और स्थिर रूप से व्यक्त एचसीएन आइसोफॉर्म में से एक है। कॉनेक्सिन सीधे पड़ोसी कोशिकाओं को जोड़ते हैं और कोशिका से कोशिका तक आयनों के पारित होने की अनुमति देते हैं; इसलिए वे हृदय21 के माध्यम से विद्युत आवेग के चालन के लिए आवश्यक हैं। कॉनेक्सिन अभिव्यक्ति पैटर्न दिल में विभिन्न क्षेत्रों के बीच भिन्न होते हैं, जिसमें सीएक्स 43 सबसे प्रचुर मात्रा में आइसोफॉर्म है जो सैन और एवीएन22 को छोड़कर हृदय के लगभग सभी हिस्सों में पाया गया है। एंटी-एचसीएन 4 और एंटी-सीएक्स 43 एंटीबॉडी के साथ-साथ कॉन्फोकल छवियों के त्रि-आयामी पुनर्निर्माण के लिए सिलिको दृष्टिकोण में रुचि के विशिष्ट क्षेत्रों के संपर्क में आने की अनुमति देने के लिए माइक्रोडिसेक्शन के संयोजन से सैन और एवीएन की विश्वसनीय पहचान और एसएएन / एवीएन आकृति विज्ञान की व्यापक जांच के साथ-साथ आसपास के ऊतकों के साथ उनकी बातचीत हो सकती है।

एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने के बाद सैन और एवीएन को अलग करना आसान हो सकता है। सैन और एवीएन को उनके शारीरिक स्थलों द्वारा स्थानीयकृत करने के लिए, हालांकि, सही माइक्रोडिसेक्शन करने से पहले कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है।

उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके, कई अन्य एंटीजन भी लागू किए जा सकते हैं। प्रोटोकॉल छिड़काव-निश्चित और विसर्जन-निश्चित ऊतक दोनों पर भी अच्छी तरह से काम करता है। हालांकि, इनक्यूबेशन समय को इष्टतम निर्धारण के लिए समायोजित किया जा सकता है क्योंकि एंटीजन के अति-निर्धारित होने पर कुछ एंटीबॉडी कम विकृति दिखाते हैं। चूंकि प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के लिए पूरे माउंट स्टेनिंग दृष्टिकोण को 7 दिनों की आवश्यकता होती है, इसलिए एंटीबॉडी युक्त समाधानों की पर्याप्त मात्रा में नमूनों को पूरी तरह से जलमग्न करना महत्वपूर्ण है। प्रयोग से पहले प्रत्येक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के अनुपात का परीक्षण किया जाना चाहिए। इष्टतम धुंधलापन के लिए, किसी भी अप्रासंगिक ऊतक को हटा दिया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल के लिए, हमने केवल बेहतर अभिविन्यास के लिए वेंट्रिकल्स के छोटे हिस्सों को संरक्षित किया और आसपास के सभी वसा ऊतक और फुफ्फुसीय नसों को हटा दिया, क्योंकि आसपास के (अप्रासंगिक) ऊतक एंटीबॉडी को भी बांध सकते हैं, खासकर जब लक्ष्य एंटीजन विश्व स्तर पर व्यक्त किए जाते हैं।

सीटू स्टेनिंग, कॉन्फोकल इमेजिंग और 3 डी पुनर्निर्माण में होल-माउंट विभिन्न क्षेत्रों के शोधकर्ताओं के लिए एक अमूल्य और शक्तिशाली तकनीक है। हालांकि, विधि की कुछ सीमाएं भी हैं। (i) इसके लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है जैसे कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप जो आमतौर पर प्रत्येक संस्थान में उपलब्ध नहीं होता है। (ii) जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, सैन या एवीएन जैसी विशिष्ट शारीरिक संरचनाओं के सूक्ष्म विच्छेदन के साथ-साथ कॉन्फोकल इमेजिंग और पोस्ट-इमेजिंग प्रोसेसिंग के लिए गहन अभ्यास और अनुभवी कामकों की आवश्यकता होती है। (iii) विधि की सफलता अत्यधिक उपयोग किए गए एंटीबॉडी की गुणवत्ता पर निर्भर करती है और इसलिए कुछ मामलों में बहुत चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इसके अलावा (iv) 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है और प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए गहन समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, छवि अधिग्रहण के दौरान इष्टतम अंतराल सेट किया जाना चाहिए क्योंकि बहुत दूर स्थित खंड अंतराल छोड़ देंगे और शरीर रचना विज्ञान के पर्याप्त 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति नहीं दे सकते हैं। जो खंड बहुत करीब हैं, वे अत्यधिक रोशनी के कारण ओवरसैंपलिंग और ब्लीचिंग का कारण बन सकते हैं और एक छवि को पूरा करने में लंबा समय लगेगा। अंत में (v) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की प्रमुख सीमा इमेजिंग गहराई है जिसका अर्थ है कि यदि नमूना मोटाई कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की अधिकतम परिचालन गहराई से परे है, तो आगे फ्लोरोफोरे का पता नहीं लगाया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस कार्य को चीन छात्रवृत्ति परिषद (सीएससी, आर ज़िया), जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च (डीजेडएचके; 81X2600255 से एस क्लॉस, 81जेड0600206 से एस काब), कोरोना फाउंडेशन (एस199/10079/2019 से एस क्लॉस), एसएफबी 914 (परियोजना जेड01 से एच. इशिकावा-एंकरहोल्ड) और एस. 10 से 1000-1019 और एस. पांडुलिपि तैयार करने में फंड की कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system  Hugo Sachs Elektronik 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit Hugo Sachs Elektronik 73-4860 Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform Kent Scientific SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps Fine Science Tools 11295-51
Iris scissors Fine Science Tools 14084-08
Spring scissors Fine Science Tools 91500-09
Tissue forceps Fine Science Tools 11051-10
Tissue pins Fine Science Tools 26007-01 Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker Sunlab D-8040
Magnetic stirrer IKA  RH basic
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL Eppendorf Z683884-1EA
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope  VWR 10836-004
Laser Scanning Confocal microscope Zeiss LSM 800
Software
Imaris 8.4.2 Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 black Zeiss
General Lab Material
0.2 µm syringe filter Sartorius 17597
100 mm petri dish Falcon 351029
27G needle BD Microlance 3 300635
50 ml Polypropylene conical Tube Falcon 352070
5ml Syringe Braun 4606108V
Cover slips Thermo Scientific 7632160
Eppendorf Tubes Eppendorf 30121872
Chemicals
0.5 M EDTA Sigma 20-158 Components of TEA
16% Formaldehyde Solution Thermo Scientific  28908 use as a 4% solution 
Acetic acid Merck 100063 Components of TEA
Agarose Biozym 850070
Bovine Serum Albumin Sigma A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 14190-094
Normal goat serum Sigma NS02L
Sucrose Sigma S1888-1kg
Tris-base Roche TRIS-RO Components of TEA
Triton X-100 Sigma T8787-250ml Diluted to 1% in PBS
Tween 20 Sigma P2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 mL Braun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mL Cp-pharma 31303
Oxygen 5 L Linde 2020175 Includes a pressure regulator
Antibodies
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488  Cell Signaling Technology #4412 diluted to 1:200
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 Invitrogen #A-21247 diluted to 1:200
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) Invitrogen H3570 diluted to 1:1000
Rabbit Anti-Connexin-43 Sigma C6219 diluted to 1:200
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) Invitrogen MA3-903 diluted to 1:200
Other
Plexiglass ring Self-designed and 3D printed
Plasticine Cernit 49655005
Silikonpasten, Baysilone VWR 291-1220
Animals
Mouse, C57BL/6 The Jackson Laboratory

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References

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Tags

मेडिसिन इश्यू 166 सिनोट्रियल नोड एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड कार्डियोलॉजी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी कार्डियक चालन प्रणाली माइक्रोडिसेक्शन इम्यूनोफ्लोरेसेंस कॉनफोकल माइक्रोस्कोपी

Erratum

Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

to:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

माउस में सिनोट्रियल और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड के पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग, कॉन्फोकल इमेजिंग और 3 डी पुनर्निर्माण
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Xia, R., Vlcek, J., Bauer, J.,… More

Xia, R., Vlcek, J., Bauer, J., Kääb, S., Ishikawa-Ankerhold, H., van den Heuvel, D. A., Schulz, C., Massberg, S., Clauss, S. Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. J. Vis. Exp. (166), e62058, doi:10.3791/62058 (2020).

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