Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה, הדמיה קונפוקלית ושחזור תלת ממדי של הצומת הסינואטרולי והאטריובנטריקולרי בעכבר

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/62058
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2,3, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

ERRATUM NOTICE

Summary

אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב לצביעה אימונופלואורסצנטית מלאה של הצומת הסינואפרוזדורי (SAN) והצומת האטריובנטריקולרי (AVN) בלבבות מורין.

Abstract

האות החשמלי שנוצר פיזיולוגית על ידי תאי קוצב לב בצומת הסינואפרוזדורי (SAN) מתבצע דרך מערכת ההולכה, הכוללת את הצומת האטריובנטריקולרי (AVN), כדי לאפשר עירור והתכווצות של הלב כולו. כל תפקוד לקוי של SAN או AVN גורם להפרעות קצב, דבר המצביע על תפקידן הבסיסי באלקטרופיזיולוגיה והפרעות קצב. מודלים של עכברים נמצאים בשימוש נרחב במחקר הפרעות קצב, אך החקירה הספציפית של SAN ו- AVN נותרה מאתגרת.

ה- SAN ממוקם בצומת של מסוף הקריסטה עם הווריד הנבוב העליון ו- AVN ממוקם בקודקוד המשולש של קוך, שנוצר על ידי פתח הסינוס הכלילי, הטבעת הטריקוספידית והגיד של טודרו. עם זאת, בשל הגודל הקטן, הדמיה על ידי היסטולוגיה קונבנציונלית נותרה מאתגרת והיא אינה מאפשרת את המחקר של SAN ו- AVN בסביבת התלת-ממד שלהם.

כאן אנו מתארים גישה אימונופלואורסצנטית של הר שלם המאפשרת הדמיה מקומית של SAN ו- AVN של עכבר מתויג. צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה מלאה מיועדת למקטעים קטנים יותר של רקמה ללא צורך בחתך ידני. לשם כך, לב העכבר מנותח, עם רקמות לא רצויות הוסרו, ואחריו קיבוע, חדירה וחסימה. תאים של מערכת ההולכה בתוך SAN ו-AVN מוכתמים בנוגדן אנטי-HCN4. מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי ועיבוד תמונה מאפשרים התמיינות בין תאי קשרית לבין קרדיומיוציטים עובדים, ולמקם בבירור SAN ו- AVN. יתר על כן, ניתן לשלב נוגדנים נוספים כדי לסמן גם סוגי תאים אחרים, כגון סיבי עצב.

בהשוואה לאימונוהיסטולוגיה קונבנציונלית, צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה שומרת על השלמות האנטומית של מערכת הולכת הלב, ובכך מאפשרת חקירה של AVN; במיוחד כך לתוך האנטומיה שלהם ואת האינטראקציות עם שריר הלב עובד שמסביב תאים שאינם מיוציטים.

Introduction

הפרעות קצב הן מחלות שכיחות הפוגעות במיליוני אנשים, והן גורמות לתחלואה ותמותה משמעותיות ברחבי העולם. למרות התקדמות עצומה בטיפול ובמניעה, כגון פיתוח קוצבי לב, הטיפול בהפרעות קצב נותר מאתגר, בעיקר בשל הידע המוגבל מאוד לגבי מנגנוני המחלה הבסיסיים 1,2,3. הבנה טובה יותר הן של האלקטרופיזיולוגיה הרגילה והן של הפתופיזיולוגיה של הפרעות קצב עשויה לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשניות, חדשניות וסיבתיות בעתיד. בנוסף, כדי לחקור באופן מקיף הפרעות קצב, חשוב למקם ולדמיין את מערכת הולכת הלב הספציפית במודלים של בעלי חיים כגון עכבר, שכן עכברים נמצאים בשימוש נרחב במחקר אלקטרופיזיולוגי.

החלקים העיקריים של מערכת ההולכה הלבבית הם הצומת הסינואפרוזדורי (SAN), שבו נוצר הדחף החשמלי בתאי קוצב מיוחדים, והצומת האטריובנטריקולרי (AVN), שהוא החיבור החשמלי היחיד בין האטריה לחדרים4. בכל פעם שהתכונות האלקטרופיזיולוגיות של SAN ו- AVN משתנות, הפרעות קצב כגון תסמונת סינוס חולה או בלוק אטריובנטריקולרי יכולות להתרחש אשר עלולות להוביל להידרדרות המודינמית, סינקופה ואפילו מוות, ובכך להדגיש את התפקיד החיוני של SAN ו- AVN הן באלקטרופיזיולוגיה והן בהפרעות קצב5.

מחקרים מקיפים על SAN או AVN דורשים לוקליזציה מדויקת והדמיה של שני המבנים, באופן אידיאלי בסביבה הפיזיולוגית שלהם. עם זאת, בשל גודלם הקטן ומיקומם בתוך שריר הלב העובד, מבלי לקבוע מבנה ברור הנראה לעין מבחינה מקרוסקופית, חקר האנטומיה והאלקטרופיזיולוגיה של SAN ו- AVN הוא מאתגר. ניתן להשתמש בציוני דרך אנטומיים כדי לזהות בערך את האזור המכיל SAN ו- AVN 6,7,8. בקצרה, SAN ממוקם באזור הבין-קוואלי של האטריום הימני הסמוך למסוף הקריסטה השרירי (CT), AVN ממוקם בתוך המשולש של קוך שהוקם על ידי המסתם הטריקוספיד, האוסטיום של הסינוס הכלילי והגיד של טודרו. עד כה, ציוני דרך אנטומיים אלה שימשו בעיקר כדי למקם, להסיר ולאחר מכן לחקור SAN ו- AVN כמבנים בודדים (למשל, על ידי היסטולוגיה קונבנציונלית). עם זאת, כדי להבין טוב יותר את האלקטרופיזיולוגיה המורכבת של SAN ו-AVN (למשל, השפעות רגולטוריות של תאים סמוכים של שריר הלב העובד), יש צורך לחקור את מערכות ההולכה בסביבה הפיזיולוגית התלת-ממדית.

צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה היא שיטה המשמשת לחקר מבנים אנטומיים באתרם תוך שמירה על שלמות הרקמה שמסביב9. באמצעות שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי ובתוכנה לניתוח תמונה, ניתן להמחיש SAN ו-AVN באמצעות נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי המכוונים לתעלות יונים המבוטאות באופן ספציפי באזורים אלה.

פרוטוקול זה להלן מסביר את השלבים הדרושים לביצוע שיטת צביעה מבוססת היטב להרכבה מלאה עבור לוקליזציה והדמיה של מיקרוסקופ SAN ו- AVN. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר כיצד (1) למקם SAN ו- AVN לפי ציוני דרך אנטומיים כדי להכין דגימות אלה לצביעה ולניתוח מיקרוסקופיה (2) לבצע צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה שלמה של סמני הייחוס HCN4 ו- Cx43 (3) להכין דגימות SAN ו- AVN למיקרוסקופ קונפוקלי (4) לביצוע הדמיה קונפוקלית של SAN ו- AVN. אנו גם מתארים כיצד ניתן לשנות פרוטוקול זה כך שיכלול צביעה נוספת של שריר הלב העובד שמסביב או תאים שאינם מיוציטים כגון סיבי עצב אוטונומיים המאפשרים חקירה יסודית של מערכת הולכת הלב בתוך הלב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הטיפול בבעלי חיים וכל הליכי הניסוי נערכו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים של אוניברסיטת מינכן, וכל ההליכים שבוצעו בעכברים אושרו על ידי ממשלת בוואריה, מינכן, גרמניה (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). עכברי C57BL6/J נרכשו ממעבדת ג'קסון.

הערה: איור 1 מראה את המכשירים הדרושים לניסוי. איור 2 מראה המחשה של אנטומיה של הלב הגס. איור 3 מראה את המיקום של SAN ו-AVN בלב עכבר בוגר. איור 4 מראה את הדגימה המוכנה שהוטענה במיקרוסקופ קונפוקלי.

1. הכנות

  1. הכינו תמיסת פורמלדהיד 4% (4% PFA) על ידי דילול 10 מ"ל של תמיסת פורמלדהיד 16% ב-30 מ"ל PBS.
  2. הכינו תמיסת 15% סוכרוז ותמיסת 30% סוכרוז על ידי המסת 15 גרם ו-30 גרם אבקת סוכרוז ל-PBS של 100 מ"ל, בהתאמה. לאחר המסת אבקת הסוכרוז במלואה, יש לסנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים 0.2 מיקרומטר לפני האחסון בטמפרטורה של 4°C.
  3. הכינו ג'ל אגרוז 3%-4%, הוסיפו 3 גרם או 4 גרם אבקת אגרוז ו-100 מ"ל של 1x TAE (מדולל מתמיסת מלאי TAE פי 50) לכוסית. מניחים את הכד על מערבל מגנטי ומרתיחים אותו עד שהאגרוז מומס לחלוטין.
  4. מכינים את צלחת הדיסקציה על ידי מזיגה עדינה של 30 מ"ל ג'ל אגרוז (3%-4%) בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ. השאירו את צלחת הפטרי על הספסל בטמפרטורת החדר כדי להתקרר ולהתקשות.
  5. הכינו תמיסת חסימה ותמיסת כביסה בהתאם למתכונים המופיעים בטבלה 1. הכינו את כל הפתרונות שהוכנו ביום השימוש. אחסון לטווח ארוך אינו מומלץ.
  6. הכינו את תמיסות הנוגדנים על ידי דילול שלהן בקור (4°C) 1x PBS, הגנו על הדילול מפני אור (למשל, על ידי עטיפת רדיד אלומיניום מסביב) ושמרו דילול על קרח עד לשימוש. לדלל את הנוגדנים זמן קצר לפני הדגירה. הימנעו מהשארת הנוגדנים המדוללים בטמפרטורת החדר.
    הערה: יש לבדוק את דילול הנוגדנים המתאים עם דגימות רקמה דומות על ידי ביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית קונבנציונלית. כאן בדקנו את הנוגדנים על ידי צביעת חלקים קפואים שנחתכו בעובי של 10 מיקרומטר.

2. קצירת איברים והכנת רקמות

  1. מרדימים את העכבר על ידי הכנסתו לתא דגירה המחובר למאדה איזופלורן. הגדר את הוופורייזר לספק 4-5% isoflurane (96-95% חמצן, בהתאמה).
    הערה: הרדמה מלאה מאושרת על ידי אובדן התגובה היציבתית ורפלקס התיקון על ידי גלגול עדין של החדר עד שהעכבר מונח על גבו.
  2. שים את העכבר במצב שכיבה על שולחן הניתוחים. הכניסו את אף העכבר למסכת הרדמה המחוברת למעגל Bain שונה עם הצינור הפנימי שלו מחובר לוופורייזר איזופלורן. כדי לשמור על הרדמה, יש להשתמש באיזופלורן 1-2% בחמצן בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה. יש לסלק אדי הרדמה עודפים מהעכבר דרך הצינור החיצוני של המסכה ולשאוב דרך מיכל של פחם פעיל, אשר סופג את גז ההרדמה העודף.
  3. כאשר מושגת הרדמה מלאה, יש להזריק פנטניל לשיכוך כאבים (0.1 μגרם / 25 גרם משקל גוף i.p).
  4. כאשר רפלקס צביטת הבוהן אינו ניתן לגילוי, בצע חתך ברור מהג'וגולום לסימפיזיס באמצעות מספריים של הקשתית כדי להסיר פרווה ועור. בצע חתך נוסף משמאל לימין מתחת לצלעות באמצעות מספריים הקשתית כדי לפתוח בזהירות את הבטן.
  5. לחיות את הקסיפואיד קצת באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי לאפשר לחתוך את הסרעפת משמאל לימין מבלי לפגוע באיברים. חתכו את כלוב הצלעות בקו מדיאלי בבית השחי משני הצדדים באמצעות מספריים של הקשתית כדי להפוך אותו באופן גולגולתי ולאפשר גישה ללב.
  6. חותכים את הווריד הנבוב התחתון ואת אבי העורקים החזי היורד בגובה הסרעפת באמצעות מספריים קשתית. נקב את הלב עם מחט 27 G באזור הקודקוד ולאחר מכן בזהירות לדחוף את המחט לתוך החדר השמאלי (LV). הזריקו בעדינות 5-10 מ"ל של PBS קר כקרח לתוך LV כדי לחורר את הלב.
    הערה: צבע הלב צריך להפוך מאדום לאפור המציין זילוח מוצלח עם PBS.
  7. בזהירות להרים את הקודקוד של הלב באמצעות פינצטה המאפשר לחתוך את כלי הדם הגדולים כדי להסיר את הלב.
  8. הבלו את הלב על ידי חיתוך העורקים והוורידים הגדולים רחוק ככל האפשר מהלב כדי למנוע נזק לווריד הנבוב העליון (SVC). שמור על SVC מכיוון שהוא ישמש ציון דרך חשוב במהלך עיבוד מאוחר יותר.
  9. לאחר הסרת הלב, כבו את מכשיר האידוי איזופלורן.
  10. הכניסו את הלב לצלחת דיסקציה מלאה ב-PBS קר כקרח מתחת למיקרוסקופ המנתחת. לאחר קביעת שמאל/ימין וחזית/גב הלב, סובבו את הלב כשקדמת הלב בתחתית הצלחת (כדי לחשוף את כלי הדם הגדולים הממוקמים מאחור).
  11. לשתק את הלב על-ידי הכנסת סיכה קטנה דרך הקודקוד ותוספתן פרוזדורים שמאלי (LAA) לתוך האגרוז בתחתית צלחת הדיסקציה (איור 2A). בעזרת פינצטה עדינה ומספריים, הסירו בזהירות רקמות שאינן לבביות סביב ה-SVC והווריד הנבוב התחתון (IVC) (למשל, ריאות, שומן, קרום הלב) כדי לחשוף את האזור הבין-קוואלי (איור 3A).
  12. הסר את רוב החדרים על ידי חיתוך מקביל את החריץ בין החדרים ואת אטריה עם מספריים מיקרו. שמרו חלק קטן מרקמת החדר לצורך העמסה מאוחרת יותר על טבעת הפרספקס.
  13. עבור קיבוע והתייבשות, לשים את הדגימה (המכילה את אטריה, SVC ו IVC) ב 4% PFA לילה ב 4 ° C.
  14. למחרת, להעביר את הלב לתמיסת סוכרוז 15% למשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
  15. למחרת, להעביר את הלב לתמיסת סוכרוז 30% למשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: עבור הקיבוע וההתייבשות בשלב 2.13, 2.14 ו-2.15, הדגימות נותרות בטמפרטורה של 4°C ללא ערבוב נוסף או נדנוד.

3. צביעה אימונופלואורסצנטית בהר שלם

  1. יש לשטוף את הלב ב-1% Triton X-100 מדולל ב-PBS ולחסום ולחדור בתמיסת חסימה (טבלה 1) למשך הלילה ב-4°C.
  2. מניחים את הלב בצינור של 1.5 מ"ל ודגורים עם ארנב נגד עכבר connexin-43 (דילול של 1:200) ונוגדנים נגד עכבר HCN4 (דילול של 1:200) מדוללים בתמיסת חסימה במשך 7 ימים ב 4 ° C.
    הערה: יש לבדוק את הריכוז האופטימלי של נוגדנים ראשוניים לפני השימוש בגיליונות הנתונים כהתמצאות. גם אנטיגנים אחרים בעלי עניין עלולים להיות מוכתמים בשלב זה, כל עוד המין המארח של האנטיגן הראשוני שונה מהאחרים. ריכוז גבוה יותר של Triton X-100 עשוי לסייע בהשגת צביעת נוגדנים יעילה יותר כפי שהודגם לפני10, אך הריכוז עשוי להיקבע בנפרד.
  3. לאחר 7 ימים, להסיר את התמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים באמצעות פיפטה ולשטוף את הלב עם 1% Triton X-100 פתרון 3 פעמים (כל פעם במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית).
  4. לאחר השטיפה, לדגור על הלב = עם Alexa Fluor 488 עז נגד חולדה IgG (דילול של 1:200) ו Alexa Fluor 647 עז נגד ארנב IgG (דילול של 1:200) במשך 7 ימים ב 4 ° C.
  5. לאחר 7 ימים, להסיר את כל הפתרון המכיל נוגדנים משניים באמצעות פיפטה. לאחר מכן שטפו את הלב באמצעות תמיסת שטיפה (טבלה 1) 3 פעמים (כל פעם למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על השייקר המסלולי).
  6. כדי להכתים גרעינים, יש לדגור על הלב בתמיסת DAPI (10 מיקרוגרם/מ"ל) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  7. למחרת, לשטוף את הלב עם פתרון כביסה 3 פעמים (כל פעם במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי).
    הערה: עבור חסימה, חלחול, דגירה נוגדנים וצביעת DAPI בשלב 3.1, 3.2, 3.4 ו -3.6, להשאיר את הדגימות במצב יציב ב 4 ° C, אין צורך ערבוב. הרקמה המוכתמת יכולה להישמר מכוסה במלואה בתמיסת כביסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומוגנת מפני אור למשך מספר ימים עד להדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי.

4. מיקרוסקופ קונפוקלי

  1. הכינו טבעות פרספקס ומלאו בפלסטלינה (איור 1). במרכז הפלסטלינה נוצר חריץ קטן במרכז לטעינת הלב. צרו חריץ רדוד, מכיוון שיהיה קל יותר לרכוש מישור הדמיה שטוח, ולהתאים את החלל ולהימנע מבועות אוויר בין הדגימה לכיסויים בשלב 4.4.
  2. השתמש באותה דגימת לב להדמיה של SAN ו- AVN ברצף. עבור הדמיית SAN, טען ישירות את הלב ואילו עבור הדמיית AVN, בצע מיקרודיסקציה לפני.
    1. הדמיית SAN
      1. זהה את SAN לפי ציוני דרך אנטומיים: הוא ממוקם בצד הגבי של הלב בתוך האזור הבין-קוואלי (האזור שבין הווריד הנבוב העליון והנחות). קריסטה טרמינליס (באנגלית: crista terminalis, CT) הוא פס השרירים שבין ה-SAN ל-RAA.
      2. הכניסו את הלב לחריץ הפלסטלינה כשגב הלב פונה כלפי מעלה. הוסף PBS ללב כדי להזיז את כל האוויר בתוך החלל עד שהלב מכוסה במלואו עם PBS (בדרך כלל כמה טיפות של PBS מספיקות).
      3. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, לחץ בעדינות את RAA, LAA ואת החלקים הנותרים של החדר השמאלי לתוך הפלסטלינה כדי לתקן את הלב. ודא כי כל האזור inter-caval ואת מסוף crista ניתן לראות בבירור (לא מכוסה על ידי פלסטלינה). האזור שיצולם מוצג באיור 3A.
    2. הדמיית AVN
      1. לאחר סיום ההדמיה של SAN, אסוף מחדש את אותה דגימה ולאחר מכן השתמש בה עבור הדמיית AVN. עבור מיקרודיסקציה AVN, הניחו את הלב = על צלחת דיסקציה מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה.
      2. כיוון הלב כאשר צד ימין פונה כלפי מעלה (כולל החלקים הנותרים של החדר הימני). שימו פינים דרך החלק הנותר של הדופן החופשית של LV (שנמצא עכשיו בתחתית) כדי לשתק את הרקמה (איור 2B).
      3. חתכו את הדופן הפנויה הנותרת של RV כלפי מעלה דרך המסתם הטריקוספיד והווריד הנבוב העליון. לאחר מכן הפוך את RV ו- RA כדי לחשוף מחיצות בין-חדריות ובין פרוזדוריות. (איור 3B)
        הערה: שימו לב לא לפגוע בסינוס הכלילי (CS), שכן זהו ציון דרך אנטומי חשוב למצוא את המשולש של קוך אשר לאחר מכן מאפשר למקם את AVN. ה-CS עובר באופן רוחבי בחריץ האטריובנטריקולרי השמאלי בצד האחורי של הלב, ופתח ה-CS ממוקם בין IVC לבין המסתם הטריקוספיד בחלק התחתון של המחיצה הבין-פרוזדורית (איור 3A ו-B).
      4. זהה את המשולש של קוך שניתן למצוא על פני השטח האנדוקרדליים של האטריום הימני, הגובל קדמית בקו הציר של עלון המחיצה של המסתם הטריקוספיד (TV), ואחורית על ידי גיד טודרו. הבסיס נוצר על-ידי פתח הסינוס הכלילי (איור 3B). מכיוון שזהו אזור היעד להדמיית AVN, הוא צריך להיות גלוי בבירור.
      5. מעבירים את הלב לחריץ הפלסטלינה בתוך טבעת הפרספקס כאשר משולש קוך חשוף בבירור (כלומר לא מכוסה בפלסטלינה). לחץ בעדינות על הרקמה סביב משולש קוך לתוך הפלסטלינה כדי לקבע את הדגימה. הוסף PBS ללב כדי להזיז את כל האוויר בתוך החלל עד שהלב מכוסה במלואו עם PBS (בדרך כלל כמה טיפות של PBS מספיקות).
  3. יש למרוח סיליקון על שולי טבעות הפרספקס כדי לאפשר כיסוי הלבבות הטעונים בתוך טבעות הפרספקס מלאות הפלסטלינה באמצעות החלקות כיסוי.
  4. לחץ בעדינות על הצד האחורי של הפלסטלינה כדי לסחוט חלקים של PBS ולחבר את הלב לכיסוי תוך הימנעות מבועות אוויר באזור ההדמיה.
    הערה: ודא שאזורי העניין אינם מקופלים ומכוסים במהלך לחיצה על הצד האחורי של הפלסטלינה. מישור הדמיה שטוח ללא דחיסת יתר של הדגימה נחוץ לשימור האנטומיה ולהדמיה קונפוקלית נכונה של הדגימות. עבור SAN, חשוב לוודא שהאזור הבין-קוואלי חשוף בבירור. עבור AVN, המשולש של קוך צריך להיות חשוף במלואו.
  5. הניחו את דגימות הצביעה בהרכבה שלמה הפוכה על פלטפורמת המיקרוסקופ הקונפוקלי. ה-SAN/AVN החשוף המחובר לחלקת הכיסוי נמצא כעת בתחתית פלטפורמת המיקרוסקופ (איור 4).
    הערה: כדי לצלם תמונות, אנו משתמשים ב- Carl Zeiss LSM800 עם Airyscan Unit ובתוכנה ZEN 2.3 SP1 שחור.
  6. בחר צלחת "BP420-480 + LP605" עבור עירור של Alexa Fluor 647 מצומד אנטי HCN4. לשנות את רווח המאסטר מ 650-750.
  7. צלם תמונת סקירה כללית של אזור SAN ו- AVN כולו באמצעות הפונקציה סריקת אריחים . לאחר מכן בחר את האזור החיובי HCN4 על ידי לחיצה והוספת ריבוע על תמונת הסקירה סביב אזור העניין שייסרק.
  8. בדוק את הפרמטרים, כולל לוחות ורווח מאסטר עבור שאר הערוצים (Alexa Fluor 488 ו- DAPI) של המיקרוסקופ הקונפוקלי והגדר כמתואר בשלב 4.6.
  9. כוונן באיטיות את המוקד מלמעלה למטה של הדגימה כדי להציג תצוגה מקדימה של הדגימה כולה ולהגדיר את הראשון והאחרון עבור טווח מחסנית Z. הגדר מרווח זמן אופטימלי עבור מחסנית Z בהתבסס על עובי הדגימה האופטית. אנו משתמשים במטרה של 20x, ו- 0.8-1 מיקרומטר כמרווח עבור Z-stack.
  10. לאחר שכל הפרמטרים מוגדרים כראוי, סרוק את כל האזור של SAN ו- AVN.
  11. בצע שחזור תלת ממדי של התמונות באמצעות תוכנה (למשל, Imaris גרסה 8.4.2).
    1. בחר עיבוד תמונות | חיסור קווי בסיס להסרת צביעת רקע.
    2. בחרו 'יצירת משטח ב'קביעה' לערוץ ולאזור העניין שנבחרו לעיבוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, ניתן לבצע הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית הן של SAN והן של AVN. צביעה ספציפית של מערכת ההולכה באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים המכוונים ל-HCN4 וצביעה של שריר הלב העובד באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים המכוונים ל-Cx43 מאפשרת זיהוי ברור של SAN (איור 5, וידאו 1) ו-AVN (איור 6, וידאו 2) בתוך האנטומיה השלמה.

Figure 1
איור 1: מכשירים לדיסקציה ומחזיק טבעת פרספקס. א. טבעת פרספקס מלאה בפלסטלינה (חץ אדום מראה את החריץ שנוצר במרכז להעמסת הלב). ב. צלחת פטרי דיסקציה עם ג'ל אגרוז. ג. מספריים אביביות. ד. מספריים של קשתית. ה. מלקחיים מעוקלים. ו. מלקחיים עדינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: איור של אנטומיה של הלב הגס. א. איור סכמטי של מיקרודיסקציה SAN. הסיכות מיושמות דרך הקודקוד ותוספתן הפרוזדורים השמאלי (LAA). SAN מסומן בעיגול מקווקו אדום. ב. איור סכמטי של מיקרודיסקציה AVN. פינים מועברים דרך החלק הנותר של הקיר החופשי LV (שנמצא כעת בתחתית). AVN מסומן על ידי עיגול מקווקו אדום. SVC, עיריד נבוב מעולה; IVC, נבוב ורידי נחות; CS, סינוס כלילי; LAA, תוספתן פרוזדורים שמאלי; RAA, נספח פרוזדורים ימני; PA, עורק ריאתי; PV, וריד ריאתי; LV, חדר שמאל; IVS, מחיצה בין-חדרית; IAS, מחיצת בין-פרוזדורים; של, פוסה סגלגלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מיקום SAN ו-AVN בלב עכבר בוגר. א. מיקום הצומת הסינואפרוזדורי (SAN) בלב עכבר בוגר. מבט מהחלק האחורי של הלב. מיקום ה-SAN מצוין על-ידי קו מקווקו אדום בתוך האזור הבין-קוואלי (קווים מקווקווים שחורים). SVC, עיריד נבוב מעולה; IVC, נבוב ורידי נחות; CS, סינוס כלילי; LAA, תוספתן פרוזדורים שמאלי; RAA, נספח פרוזדורים ימני; PV, וריד ריאתי; CT, כריסטה טרמינליס; LV, חדר שמאל; RV, החדר הימני. ב. מיקום הצומת האטריובנטריקולרי (AVN) בלב עכבר בוגר. מבט מימין. AVN (עיגול מקווקו אדום) ממוקם בקודקוד המשולש של קוך (משולש מקווקו לבן) בסמוך לתחתית המחיצה הממברנית. המשולש של קוך נוצר על ידי גיד טודרו (TT, קו מקווקו ירוק), שסתום טריקוספיד (TV, קו מקווקו כחול) ופתח הסינוס הכלילי (CS, קו מקווקו צהוב). SVC, vena cava מעולה; IVC, נבוב ורידי נחות; IVS, מחיצה בין-חדרית; של, פוסה סגלגלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דגימה מוכנה שהועמסה במיקרוסקופ קונפוקלי. A. הדגימה שהוכנה (חץ אדום) למיקרוסקופ קונפוקלי המורכבת על טבעת פרספקס עם פלסטלינה (חץ שחור). מבט מלמטה. ב. טבעת פרספקס עם דגימה רכובה טעונה הפוך על פלטפורמת המיקרוסקופ הקונפוקלי (מיקרוסקופ הפוך). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. שחזור של הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי של SAN בעכבר C57BL6/J המוכתם בנוגדנים נגד HCN4 (אדום) ו-Cx43 (לבן). א. האזור המקווקו תוחם את ה-SAN, אשר מכוון לאורך האזור הבין-קוואלי בין הווריד הנבוב העליון והנחות. ב. הגדלת השיבוץמלוח A. C. שחזור תלת ממדי של לוח B. RAA, נספח פרוזדורים ימני; RA, אטריום ימני; SAN, צומת sinoatrial. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6. שחזור של הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי של AVN בעכבר C57BL6/J המוכתם בנוגדנים אנטי-HCN4 (אדום) ו-Cx43 (לבן). א. אזור מקווקו מציין את AVN. B. הגדלת השיבוץ מלוח A. C. שחזור תלת ממדי של לוח B. IVS, מחיצה בין-חדרית; IAS, מחיצת בין-פרוזדורים; AVN, צומת אטריובנטריקולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7. תדמית שליטה שלילית. א. שליטה שלילית צביעה בהרכבה מלאה עבור SAN. העיגול המקווקו הראה את אזור SAN שאושר על ידי ציוני הדרך באנטומיה. ב. צביעת בקרה שלילית עבור SAN רק עם נוגדנים שניים. ג. צביעת DAPI עבור SAN. ד . צביעת בקרה שלילית בהרכבה שלמה עבור AVN. העיגול המקווקו הראה את אזור AVN שאושר על ידי ציוני הדרך באנטומיה. ה . צביעת בקרה שלילית ל-AVN רק עם נוגדנים שניים. ו. צביעת DAPI עבור AVN. RAA, נספח פרוזדורים ימני; RA, אטריום ימני; SVC, vena cava מעולה; IVS, מחיצה בין-חדרית; IAS, מחיצת בין-פרוזדורים; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון 1: שחזור תלת-ממדי של ה-SAN לחץ כאן להורדת סרטון זה.

וידאו 2: שחזור תלת מימד של AVN אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

תרכובת ריכוז סופי נדרש g או mL/100 מ"ל
תיקון פתרון
פורמלדהיד (16%) 4% 25 מ"ל
PBS (1x) 75 מ"ל
תמיסת טריטון 1%
טריטון X100 1% 1 מ"ל
PBS 99 מ"ל
פתרון חסימה
טריטון X-100 1% 1 מ"ל
BSA 0.50% 0.5 גרם
סרום עיזים רגיל 20% 20 מ"ל
PBS (1x) 89 מ"ל
תמיסת כביסה
טווין 20 0.10% 0.1 מ"ל
BSA 0.50% 0.5 גרם
PBS (1x) 99.9 מ"ל
TAE (פי 50)
בסיס טריס 24.20% 24.2 גרם
100% חומצה אצטית 5.71% 5.71 מ"ל
0.5 מטר EDTA 0.05 מטר 10 מ"ל
dH2O הוסף עד 100 מ"ל

טבלה 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנטומיה של הלב נחקרה באופן מסורתי באמצעות חתכים היסטולוגיים דקים11. עם זאת, שיטות אלה אינן משמרות את המבנה התלת מימדי של מערכת ההולכה ולכן מספקות מידע דו-ממדי בלבד. פרוטוקול צביעת האימונופלואורסנציה המתואר כאן מאפשר להתגבר על מגבלות אלה וניתן להשתמש בו באופן שגרתי להדמיית SAN ו-AVN.

בהשוואה לשיטות סטנדרטיות כגון אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית הדורשות הטבעה של פרפין, חתך ושליפת אנטיגן, מתודולוגיית ההרכבה המלאה מועילה לטיפול בלוקליזציה התלת-ממדית המדויקת ובמורפולוגיה של SAN ו-AVN, ולבחינת הקשר עם הרקמה הסובבת מכיוון שמורפולוגיית הרקמה נשמרת במידה ניכרת עם מינימום התייבשות רקמה וקרע פיזי. כמו כן, התגובה החיסונית (כלומר, קשירת נוגדנים לאנטיגנים רקמות) נשמרת גם היא מאוד.

הקמנו שיטת תהלוכה מדגמית מעשית למיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מחזיק טבעת פלסטיק מלא בפלסטלינה12,13. פלסטלינה היא אידיאלית מכיוון שניתן להתאים אותה בנפרד לגודל הרקמה, קשה מספיק להחזיק את הרקמה בצורה אמינה ללא לחץ מוגזם של הרקמה. והכי חשוב, זה לא פלואורסצנטי, הימנעות רקע פלואורסצנטי אוטומטי ולכן לא להפריע אות פלואורסצנטי של נוגדנים בשימוש.

השתמשנו במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (LSM-Zeiss) עם גלאי Airyscan, שיכול להציע יתרון מובהק בקבלת תמונות באיכות גבוהה. שימוש במיקרוסקופ הדמיה רחב שדה יכול לספק רק מידע ברמת הרקמה, אך חסר רזולוציה תאית. בנוסף, המיקרוסקופ רחב השדה טומן בחובו סיכון של רקע גבוה14. על ידי שימוש בגלאי Airyscan עבור LSM קונפוקלי, ניתן להשיג רזולוציה משופרת ויחס אות לרעש (SNR), בהשוואה למערכת הדמיה קונפוקלית מסורתית של חור וגלאי אחד15.

הצורות והמיקום של SAN ו- AVN מוצגים כשחזור תלת ממדי ומישורי חתך וירטואליים נוספים הנגזרים משחזור תלת ממדי יכולים לשפר את הפרשנות של חתכים היסטולוגיים, בעוד שהיסטולוגיה קונבנציונלית מאפשרת רק הערכה דו-ממדית של האנטומיה עם הסיכון האינהרנטי לאי גילוי מבנים קטנים אך רלוונטיים. יתר על כן, שחזור תלת ממדי מספק הזדמנות לבחון מבנים אנטומיים בעלי עניין באופן טרנסמורלי ובתוך מיקרו-סביבה שלמה, למשל פלקס עצבים אוטונומי פנימי המעצבב את הלב16. צביעה באתרו של תושבת שלמה ושחזור תלת ממדי מאפשרים לחקור את הסביבה התאית, כמו גם את סוגי התאים הספציפיים ואת הכיוון שלהם. יתר על כן, ניתן להמחיש ביטוי חלבונים אזורי וספציפי לסוג התא ועשוי לתמוך עוד יותר בניתוחי כתם ופרוטאומיקה מערביים17.

SAN ו-AVN הם מבנים מיוחדים בלב עם דפוס ביטוי שונה של תעלות יונים וקונקסינים שניתן להשתמש בהם לזיהוי אמין10,18. תעלות קטיון מחזוריות מגודרות בנוקלאוטידים המופעלות על ידי היפרפולריזציה (HCN) קובעות את הדפולריזציה הדיאסטולית בתאי קוצב לב ולכן הן מבוטאות באופן ספציפי בתוך מערכת ההולכה, כאשר HCN4 הוא האיזופורם השולט בעכבר19. מחקרים הראו כי HCN4 הוא אחד האיזופורמים של HCN הניתנים לזיהוי ומבוטאים ביציבות ברחבי SAN ו-AVN 11,20. קונקסינים מחברים ישירות תאים שכנים ומאפשרים מעבר יונים מתא לתא; לכן הם חיוניים להולכת הדחף החשמלי דרך הלב21 . דפוסי ביטוי של קונקסין משתנים בין אזורים שונים בלב, כאשר Cx43 הוא האיזופורם הנפוץ ביותר שנמצא כמעט בכל חלקי הלב, למעט SAN ו-AVN22. שילוב מיקרודיסקציה המאפשר חשיפה של אזורי עניין ספציפיים עם נוגדנים אנטי-HCN4 ו-CX43, כמו גם בגישות סיליקו לשחזור תלת-ממדי של תמונות קונפוקליות מאפשר זיהוי אמין של SAN ו-AVN ולחקירה מקיפה של המורפולוגיה SAN/AVN כמו גם האינטראקציה שלהם עם הרקמה הסובבת.

ייתכן שיהיה קל להבחין בין SAN ו-AVN לאחר צביעה בנוגדן ספציפי. עם זאת, כדי למקם את SAN ו- AVN לפי ציוני הדרך האנטומיים שלהם, יש צורך בתרגול מסוים לפני שניתן יהיה לבצע את המיקרודיסקציה הנכונה.

באמצעות הפרוטוקול הנ"ל, ניתן ליישם גם מספר אנטיגנים אחרים. הפרוטוקול עובד היטב גם על רקמה קבועה זילוח וגם על רקמה קבועה טבילה. עם זאת, זמן הדגירה עשוי להיות מותאם לקיבוע אופטימלי שכן נוגדנים מסוימים מראים תגובתיות חיסונית מופחתת כאשר האנטיגן קבוע יתר על המידה. מכיוון שגישת הצביעה המלאה זקוקה ל-7 ימים לצורך דגירה ראשונית ומשנית של נוגדנים, חשוב לטבול לחלוטין את הדגימות בכמויות מתאימות של תמיסות המכילות נוגדנים. יש לבדוק את יחס הדילול של כל נוגדן לפני הניסוי. להכתמה אופטימלית, יש להסיר כל רקמה לא רלוונטית. לצורך הפרוטוקול, שמרנו רק חלקים קטנים של החדרים להתמצאות טובה יותר והסרנו את כל רקמת השומן וורידי הריאה שמסביב, שכן הרקמה שמסביב (לא רלוונטית) עשויה לקשור נוגדנים גם כן, במיוחד כאשר אנטיגני המטרה באים לידי ביטוי גלובלי.

צביעה באתרו שלם, הדמיה קונפוקלית ושחזור תלת ממדי היא טכניקה רבת ערך ורבת עוצמה עבור חוקרים מתחומים שונים. עם זאת, לשיטה יש גם כמה מגבלות. (i) זה דורש ציוד מיוחד כגון מיקרוסקופ קונפוקלי שאינו זמין בדרך כלל בכל מוסד. (ii) כפי שהוזכר לעיל, מיקרודיסקציה של מבנים אנטומיים מיוחדים כגון SAN או AVN אך גם הדמיה קונפוקלית ועיבוד לאחר הדמיה דורשת תרגול אינטנסיבי וכוח אדם מנוסה. (iii) הצלחת השיטה תלויה מאוד באיכות הנוגדנים בהם נעשה שימוש ולכן עשויה להיות מאתגרת מאוד במקרים מסוימים. כמו כן, (iv) שחזור תלת-ממדי יכול להיות קשה להשגה ועשוי לדרוש פתרון בעיות אינטנסיבי כדי לייעל את ההליך. לדוגמה, יש להגדיר מרווחי זמן אופטימליים במהלך רכישת התמונה מכיוון שחלקים מרוחקים מדי זה מזה ישאירו רווחים ועשויים שלא לאפשר שחזור תלת-ממדי הולם של האנטומיה. מקטעים קרובים מדי עלולים לגרום לדגימת יתר ולהלבנה עקב התאורה המוגזמת וייקח זמן רב להשלים תמונה אחת. לבסוף (v) המגבלה העיקרית של מיקרוסקופ קונפוקלי היא עומק ההדמיה, מה שאומר שאם עובי הדגימה הוא מעבר לעומק הפעולה המרבי של המיקרוסקופ הקונפוקלי, לא ניתן לזהות את הפלואורופור הנוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המלגות של סין (CSC, ל R. Xia), המרכז הגרמני למחקר לב וכלי דם (DZHK; 81X2600255 ל S. Clauss, 81Z0600206 ל S. Kääb), קרן הקורונה (S199/10079/2019 ל S. Clauss), SFB 914 (פרויקט Z01 ל H. Ishikawa-Ankerhold ו S. Massberg ופרויקט A10 ל C. Schulz), ERA-NET על מחלות לב וכלי דם (ERA-CVD; 01KL1910 ל S. Clauss) ואת קרן Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl (ל S. Clauss). למממנים לא היה כל תפקיד בהכנת כתבי היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system  Hugo Sachs Elektronik 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit Hugo Sachs Elektronik 73-4860 Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform Kent Scientific SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps Fine Science Tools 11295-51
Iris scissors Fine Science Tools 14084-08
Spring scissors Fine Science Tools 91500-09
Tissue forceps Fine Science Tools 11051-10
Tissue pins Fine Science Tools 26007-01 Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker Sunlab D-8040
Magnetic stirrer IKA  RH basic
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL Eppendorf Z683884-1EA
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope  VWR 10836-004
Laser Scanning Confocal microscope Zeiss LSM 800
Software
Imaris 8.4.2 Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 black Zeiss
General Lab Material
0.2 µm syringe filter Sartorius 17597
100 mm petri dish Falcon 351029
27G needle BD Microlance 3 300635
50 ml Polypropylene conical Tube Falcon 352070
5ml Syringe Braun 4606108V
Cover slips Thermo Scientific 7632160
Eppendorf Tubes Eppendorf 30121872
Chemicals
0.5 M EDTA Sigma 20-158 Components of TEA
16% Formaldehyde Solution Thermo Scientific  28908 use as a 4% solution 
Acetic acid Merck 100063 Components of TEA
Agarose Biozym 850070
Bovine Serum Albumin Sigma A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 14190-094
Normal goat serum Sigma NS02L
Sucrose Sigma S1888-1kg
Tris-base Roche TRIS-RO Components of TEA
Triton X-100 Sigma T8787-250ml Diluted to 1% in PBS
Tween 20 Sigma P2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 mL Braun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mL Cp-pharma 31303
Oxygen 5 L Linde 2020175 Includes a pressure regulator
Antibodies
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488  Cell Signaling Technology #4412 diluted to 1:200
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 Invitrogen #A-21247 diluted to 1:200
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) Invitrogen H3570 diluted to 1:1000
Rabbit Anti-Connexin-43 Sigma C6219 diluted to 1:200
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) Invitrogen MA3-903 diluted to 1:200
Other
Plexiglass ring Self-designed and 3D printed
Plasticine Cernit 49655005
Silikonpasten, Baysilone VWR 291-1220
Animals
Mouse, C57BL/6 The Jackson Laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  2. Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
  3. Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
  4. van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
  5. Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
  6. Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
  7. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
  8. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
  9. Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
  10. Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  11. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
  12. Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
  13. Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
  14. Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
  15. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
  16. Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
  17. Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
  18. Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
  19. Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
  20. Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
  21. Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
  22. van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).

Tags

רפואה גיליון 166 צומת סינופרוזדורי קשרית אטריובנטריקולרית קרדיולוגיה אלקטרופיזיולוגיה מערכת הולכת לב מיקרודיסקציה אימונופלואורסנציה מיקרוסקופ קונפוקלי

Erratum

Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

to:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה, הדמיה קונפוקלית ושחזור תלת ממדי של הצומת הסינואטרולי והאטריובנטריקולרי בעכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xia, R., Vlcek, J., Bauer, J.,… More

Xia, R., Vlcek, J., Bauer, J., Kääb, S., Ishikawa-Ankerhold, H., van den Heuvel, D. A., Schulz, C., Massberg, S., Clauss, S. Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. J. Vis. Exp. (166), e62058, doi:10.3791/62058 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter