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Summary
Forniamo un protocollo passo-passo per la colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero del nodo senoatriale (SAN) e del nodo atrioventricolare (AVN) nei cuori murini.
Abstract
Il segnale elettrico fisiologicamente generato dalle cellule pacemaker nel nodo senoatriale (SAN) viene condotto attraverso il sistema di conduzione, che include il nodo atrioventricolare (AVN), per consentire l'eccitazione e la contrazione di tutto il cuore. Qualsiasi disfunzione di SAN o AVN provoca aritmie, indicando il loro ruolo fondamentale nell'elettrofisiologia e nell'aritmogenesi. I modelli murini sono ampiamente utilizzati nella ricerca sull'aritmia, ma l'indagine specifica su SAN e AVN rimane impegnativa.
Il SAN si trova alla giunzione della crista terminalis con la vena cava superiore e l'AVN si trova all'apice del triangolo di Koch, formato dall'orifizio del seno coronarico, dall'anulus tricuspide e dal tendine di Todaro. Tuttavia, a causa delle dimensioni ridotte, la visualizzazione mediante istologia convenzionale rimane impegnativa e non consente lo studio di SAN e AVN all'interno del loro ambiente 3D.
Qui descriviamo un approccio di immunofluorescenza a montaggio intero che consente la visualizzazione locale di SAN e AVN di topo marcati. La colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero è destinata a sezioni più piccole di tessuto senza la necessità di sezionamento manuale. A tale scopo, il cuore del topo viene sezionato, con tessuto indesiderato rimosso, seguito da fissazione, permeabilizzazione e blocco. Le cellule del sistema di conduzione all'interno di SAN e AVN vengono quindi colorate con un anticorpo anti-HCN4. La microscopia a scansione laser confocale e l'elaborazione delle immagini consentono la differenziazione tra cellule linfonodali e cardiomiociti funzionanti e di localizzare chiaramente SAN e AVN. Inoltre, ulteriori anticorpi possono essere combinati per marcare anche altri tipi di cellule, come le fibre nervose.
Rispetto all'immunoistologia convenzionale, la colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero preserva l'integrità anatomica del sistema di conduzione cardiaca, consentendo così l'indagine dell'AVN; soprattutto nella loro anatomia e nelle interazioni con le cellule del miocardio e non miociti circostanti.
Introduction
Le aritmie sono malattie comuni che colpiscono milioni di persone e sono la causa di una significativa morbilità e mortalità in tutto il mondo. Nonostante gli enormi progressi nel trattamento e nella prevenzione, come lo sviluppo di pacemaker cardiaci, il trattamento delle aritmie rimane impegnativo, principalmente a causa delle conoscenze molto limitate sui meccanismi della malattia sottostante 1,2,3. Una migliore comprensione sia dell'elettrofisiologia normale che della fisiopatologia delle aritmie può aiutare a sviluppare strategie di trattamento nuove, innovative e causali in futuro. Inoltre, per studiare in modo completo l'aritmogenesi, è importante localizzare e visualizzare il sistema di conduzione cardiaca specifico in modelli animali come il topo, poiché i topi sono ampiamente utilizzati nella ricerca elettrofisiologica.
Le parti principali del sistema di conduzione cardiaca sono il nodo senoatriale (SAN), dove l'impulso elettrico viene generato in cellule pacemaker specializzate, e il nodo atrioventricolare (AVN), che è l'unica connessione elettrica tra gli atri e i ventricoli4. Ogni volta che le proprietà elettrofisiologiche di SAN e AVN sono alterate, possono verificarsi aritmie come la sindrome del seno malato o il blocco atrioventricolare che possono portare al deterioramento emodinamico, alla sincope e persino alla morte, sottolineando così il ruolo essenziale di SAN e AVN nell'elettrofisiologia e nell'aritmogenesi5.
Studi completi su SAN o AVN richiedono una localizzazione e una visualizzazione precise di entrambe le strutture, idealmente all'interno del loro ambiente fisiologico. Tuttavia, a causa delle loro piccole dimensioni e della loro posizione all'interno del miocardio funzionante, senza stabilire una chiara struttura macroscopicamente visibile, studiare l'anatomia e l'elettrofisiologia di SAN e AVN è impegnativo. I punti di riferimento anatomici possono essere utilizzati per identificare approssimativamente la regione che contiene SAN e AVN 6,7,8. In breve, la SAN si trova nella regione inter-cavale dell'atrio destro adiacente alla crista terminale muscolare (TC), l'AVN si trova all'interno del triangolo di Koch stabilito dalla valvola tricuspide, dall'ostio del seno coronarico e dal tendine di Todaro. Finora, questi punti di riferimento anatomici sono stati utilizzati principalmente per localizzare, rimuovere e quindi studiare SAN e AVN come strutture individuali (ad esempio, mediante istologia convenzionale). Per comprendere meglio la complessa elettrofisiologia di SAN e AVN (ad esempio, gli effetti regolatori delle cellule adiacenti del miocardio funzionante), tuttavia, è necessario studiare i sistemi di conduzione all'interno dell'ambiente fisiologico 3D.
La colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero è un metodo utilizzato per studiare le strutture anatomiche in situ preservando l'integrità del tessuto circostante9. Sfruttando la microscopia confocale e il software di analisi delle immagini, SAN e AVN possono essere visualizzati con anticorpi marcati con fluorescenza che prendono di mira i canali ionici specificamente espressi in queste regioni.
Questo protocollo seguente spiega i passaggi necessari per eseguire un metodo di colorazione a montaggio intero consolidato per la localizzazione e la visualizzazione del microscopio SAN e AVN. In particolare, questo protocollo descrive come (1) localizzare SAN e AVN in base a punti di riferimento anatomici per preparare questi campioni per la colorazione e l'analisi al microscopio (2) eseguire la colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero dei marcatori di riferimento HCN4 e Cx43 (3) preparare campioni SAN e AVN per la microscopia confocale (4) eseguire l'imaging confocale di SAN e AVN. Descriviamo anche come questo protocollo può essere modificato per includere un'ulteriore colorazione delle cellule miocardiche o non miocitarie circostanti come le fibre nervose autonome che consentono un'indagine approfondita del sistema di conduzione cardiaca all'interno del cuore.
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Protocol
La cura degli animali e tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del comitato per la cura e l'etica degli animali dell'Università di Monaco e tutte le procedure intraprese sui topi sono state approvate dal governo della Baviera, Monaco, Germania (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). I topi C57BL6/J sono stati acquistati dal Jackson Laboratory.
NOTA: la Figura 1 mostra gli strumenti necessari per l'esperimento. La figura 2 mostra un'illustrazione dell'anatomia cardiaca grossolana. La Figura 3 mostra la posizione di SAN e AVN in un cuore di topo adulto. La figura 4 mostra il campione preparato caricato sulla microscopia confocale.
1. Preparativi
- Preparare una soluzione di formaldeide al 4% (PFA al 4%) diluendo 10 ml di soluzione di formaldeide al 16% in 30 ml di PBS.
- Preparare una soluzione di saccarosio al 15% e una soluzione di saccarosio al 30% sciogliendo rispettivamente 15 g e 30 g di polvere di saccarosio in 100 ml di PBS. Dopo che la polvere di saccarosio è completamente sciolta, filtrare la soluzione con un filtro a siringa da 0,2 μm prima di conservare a 4 °C.
- Preparare un gel di agarosio al 3% -4%, aggiungere 3 g o 4 g di polvere di agarosio e 100 ml di 1x TAE (diluito da 50x soluzione madre TAE) in un becher. Posizionare il becher su un agitatore magnetico e farlo bollire fino a quando l'agarosio è completamente sciolto.
- Preparare il piatto di dissezione versando delicatamente 30 ml di gel di agarosio (3% -4%) in una capsula di Petri da 100 mm di diametro. Lasciare la capsula di Petri sul banco a temperatura ambiente per raffreddare e indurire.
- Preparare la soluzione bloccante e la soluzione di lavaggio secondo le ricette fornite nella Tabella 1. Preparare tutte le soluzioni preparate il giorno dell'uso. L'archiviazione a lungo termine non è raccomandata.
- Preparare le soluzioni anticorpali diluendoli a freddo (4 °C) 1x PBS, proteggere la diluizione dalla luce (ad esempio, avvolgendo un foglio di alluminio) e mantenere le diluizioni su ghiaccio fino all'uso. Diluire gli anticorpi poco prima dell'incubazione. Evitare di lasciare gli anticorpi diluiti a temperatura ambiente.
NOTA: La diluizione anticorpale appropriata deve essere testata con campioni di tessuto comparabili eseguendo una colorazione immunofluorescente convenzionale. Qui, abbiamo testato gli anticorpi colorando sezioni congelate tagliate a uno spessore di 10 μm.
2. Prelievo di organi e preparazione dei tessuti
- Anestetizzare il topo mettendolo in una camera di incubazione collegata ad un vaporizzatore di isoflurano. Impostare il vaporizzatore in modo da fornire il 4-5% di isoflurano (96-95% di ossigeno, rispettivamente).
NOTA: L'anestesia completa è confermata dalla perdita della reazione posturale e del riflesso raddrizzante ruotando delicatamente la camera fino a quando il mouse non viene posizionato sul dorso. - Metti il mouse in posizione supina sul tavolo chirurgico. Inserire il naso del topo in una maschera per anestesia collegata a un circuito Bain modificato con la camera d'aria collegata al vaporizzatore isoflurano. Per mantenere l'anestesia, utilizzare l'isoflurano all'1-2% nell'ossigeno ad una portata di 1 L / min. Eliminare il vapore anestetico in eccesso dal mouse attraverso il tubo esterno della maschera e aspirare attraverso un contenitore di carbone attivo, che assorbe il gas anestetico in eccesso.
- Una volta ottenuta l'anestesia completa, iniettare fentanil per l'analgesia (0,1 μg/25 g di peso corporeo i.p.).
- Quando il riflesso del pizzico del piede non è rilevabile, fai un taglio netto dal giugulo alla sinfisi usando le forbici dell'iride per rimuovere la pelliccia e la pelle. Fai un altro taglio da sinistra a destra sotto le costole usando le forbici dell'iride per aprire con cura l'addome.
- Vivi un po 'lo xifoide usando una pinza curva per consentire di tagliare il diaframma da sinistra a destra senza ferire alcun organo. Tagliare la gabbia toracica in una linea ascellare mediale su entrambi i lati usando le forbici dell'iride per capovolgerla cranicamente e consentire l'accesso al cuore.
- Tagliare la vena cava inferiore e l'aorta toracica discendente a livello del diaframma usando le forbici dell'iride. Forare il cuore con un ago da 27 Gnella zona dell'apice e quindi spingere con attenzione l'ago nel ventricolo sinistro (LV). Iniettare delicatamente 5-10 ml di PBS ghiacciato nel ventricolo sinistro per perfondere il cuore.
NOTA: Il colore del cuore dovrebbe passare dal rosso al grigio indicando una perfusione riuscita con PBS. - Sollevare con attenzione l'apice del cuore usando una pinzetta che consente di tagliare i grandi vasi e di rimuovere il cuore.
- Asportare il cuore tagliando le grandi arterie e vene il più lontano possibile dal cuore per evitare danni alla vena cava superiore (SVC). Conservare lo SVC poiché servirà come punto di riferimento importante durante la lavorazione successiva.
- Dopo la rimozione del cuore, spegnere il vaporizzatore isoflurano.
- Metti il cuore in un piatto di dissezione pieno di PBS ghiacciato al microscopio da dissezione. Dopo aver determinato la parte sinistra / destra e anteriore / posteriore del cuore, girare il cuore con la parte anteriore del cuore nella parte inferiore del piatto (per esporre i grandi vasi che si trovano posteriormente).
- Immobilizzare il cuore mettendo piccoli spilli attraverso l'apice e l'appendice atriale sinistra (LAA) nell'agarosio sul fondo del piatto di dissezione (Figura 2A). Utilizzando pinzette sottili e forbici, rimuovere con attenzione il tessuto non cardiaco attorno alla SVC e alla vena cava inferiore (IVC) (ad esempio, polmoni, grasso, pericardio) per esporre la regione inter-cavale (Figura 3A).
- Rimuovere la maggior parte dei ventricoli tagliando parallelamente la scanalatura tra i ventricoli e gli atri con la micro forbice. Conservare una piccola parte del tessuto ventricolare per il successivo carico sull'anello di plexiglas.
- Per la fissazione e la disidratazione, mettere il campione (contenente gli atri, SVC e IVC) in PFA al 4% per una notte a 4 °C.
- Il giorno successivo, trasferire il cuore in una soluzione di saccarosio al 15% per 24 ore a 4 °C.
- Il giorno successivo, trasferire il cuore in soluzione di saccarosio al 30% per 24 ore a 4 °C.
NOTA: Per la fissazione e la disidratazione nei punti 2.13, 2.14 e 2.15, i campioni vengono lasciati a 4°C senza ulteriore agitazione o oscillazione.
3. Colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero
- Lavare il cuore in Triton X-100 all'1% diluito in PBS e bloccare e permeabilizzare in soluzione bloccante (Tabella 1) per una notte a 4 °C.
- Porre il cuore in una provetta da 1,5 mL e incubare con anticorpi coniglio anti-topo connessina-43 (diluizione di 1:200) e HCN4 anti-topo di ratto (diluizione di 1:200) diluiti con soluzione bloccante per 7 giorni a 4 °C.
NOTA: La concentrazione ottimale di anticorpi primari deve essere testata prima di utilizzare le schede tecniche come orientamento. Anche altri antigeni di interesse potrebbero essere colorati in questa fase, purché la specie ospite dell'antigene primario sia diversa dagli altri. Una maggiore concentrazione di Triton X-100 può aiutare a ottenere una colorazione anticorpale più efficiente come dimostrato prima di10, ma la concentrazione potrebbe essere determinata individualmente. - Dopo 7 giorni, rimuovere la soluzione contenente anticorpi primari usando una pipetta e lavare il cuore con la soluzione di Triton X-100 all'1% 3 volte (ogni volta per 1 ora a temperatura ambiente sullo shaker orbitale).
- Dopo il lavaggio, incubare il cuore = con Alexa Fluor 488 capra anti-ratto IgG (diluizione di 1:200) e Alexa Fluor 647 capra anti-coniglio IgG (diluizione di 1:200) per 7 giorni a 4 °C.
- Dopo 7 giorni, rimuovere tutta la soluzione contenente gli anticorpi secondari usando una pipetta. Quindi lavare il cuore usando la soluzione di lavaggio (Tabella 1) 3 volte (ogni volta per 1 ora a temperatura ambiente sullo shaker orbitale).
- Per colorare i nuclei, incubare il cuore in soluzione DAPI (10 μg/ml) per una notte a 4 °C.
- Il giorno successivo, lavare il cuore con soluzione di lavaggio 3 volte (ogni volta per 1 ora a temperatura ambiente sullo shaker orbitale).
NOTA: Per il blocco, la permeabilizzazione, l'incubazione degli anticorpi e la colorazione DAPI nei punti 3.1, 3.2, 3.4 e 3.6, lasciare i campioni allo stato stazionario a 4 °C, non è necessaria alcuna agitazione. Il tessuto colorato potrebbe essere conservato completamente coperto con una soluzione di lavaggio a 4 °C e protetto dalla luce per alcuni giorni fino all'imaging al microscopio confocale.
4. Microscopia confocale
- Preparare anelli di plexiglas e riempirli con plastilina (Figura 1). Al centro della plastilina si forma un piccolo solco al centro per caricare il cuore. Creare una scanalatura poco profonda, poiché sarebbe più facile acquisire un piano di imaging piatto e regolare lo spazio ed evitare bolle d'aria tra il campione e i vetrini di copertura nel passaggio 4.4.
- Utilizzare lo stesso campione cardiaco per l'imaging di SAN e AVN in sequenza. Per l'imaging SAN, caricare direttamente il cuore mentre per l'imaging AVN, eseguire prima la microdissezione.
- Imaging SAN
- Identificare il SAN da punti di riferimento anatomici: si trova sul lato dorsale del cuore all'interno della regione inter-cavale (la regione tra la vena cava superiore e inferiore). La crista terminalis (CT) è la striscia muscolare tra SAN e RAA.
- Posizionare il cuore nella scanalatura della plastilina con la parte posteriore del cuore rivolta verso l'alto. Aggiungere PBS sul cuore per spostare tutta l'aria all'interno della cavità fino a quando il cuore è completamente coperto di PBS (di solito sono sufficienti poche gocce di PBS).
- Sotto il microscopio a dissezione, premere delicatamente RAA, LAA e le parti rimanenti del ventricolo sinistro nella plastilina per fissare il cuore. Assicurarsi che l'intera regione inter-cavallica e la crista terminalis possano essere chiaramente visibili (non coperte da plastilina). L'area che verrà ripresa è mostrata nella Figura 3A.
- Imaging AVN
- Dopo aver terminato l'imaging di SAN, raccogliere lo stesso campione e successivamente utilizzarlo per l'imaging AVN. Per la microdissezione AVN, posizionare il cuore = su un piatto di dissezione sotto il microscopio da dissezione.
- Orientare il cuore con il lato destro rivolto verso l'alto (comprese le parti rimanenti del ventricolo destro). Mettere dei perni attraverso la parte rimanente della parete libera LV (che ora si trova nella parte inferiore) per immobilizzare il tessuto (Figura 2B).
- Tagliare la parete libera RV rimanente verso l'alto attraverso la valvola tricuspide e la vena cava superiore. Quindi capovolgere il RV e l'AR per esporre il setto interventricolare e interatriale. (Figura 3B)
NOTA: Prestare attenzione a non danneggiare il seno coronarico (CS), in quanto è un importante punto di riferimento anatomico trovare il triangolo di Koch che permette quindi di localizzare l'AVN. Il CS scorre trasversalmente nel solco atrioventricolare sinistro sul lato posteriore del cuore e l'apertura dell'orifizio CS si trova tra IVC e la valvola tricuspide nella parte inferiore del setto interatriale (Figura 3A e B). - Identificare il triangolo di Koch che si trova sulla superficie endocardica dell'atrio destro, delimitato anteriormente dalla linea cerniera del foglietto settale della valvola tricuspide (TV) e posteriormente dal tendine di Todaro. La base è formata dall'orifizio del seno coronarico (Figura 3B). Poiché questa è la regione di destinazione per l'imaging AVN, deve essere chiaramente visibile.
- Trasferire il cuore nella scanalatura della plastilina all'interno dell'anello di plexiglas con il triangolo di Koch chiaramente esposto (cioè non coperto da plastilina). Premere delicatamente il tessuto attorno al triangolo di Koch nella plastilina per fissare il campione. Aggiungere PBS sul cuore per spostare tutta l'aria all'interno della cavità fino a quando il cuore è completamente coperto di PBS (di solito sono sufficienti poche gocce di PBS).
- Imaging SAN
- Applicare il silicone sui bordi degli anelli in plexiglas per permettere di coprire i cuori caricati all'interno degli anelli in plexiglas riempiti di plastilina con slip di copertura.
- Premere delicatamente il lato posteriore della plastilina per spremere parti del PBS e per attaccare il cuore al vetrino evitando bolle d'aria all'interno dell'area di imaging.
NOTA: Assicurarsi che le regioni di interesse non siano piegate e coperte durante la pressione sul lato posteriore della plastilina. Un piano di imaging piatto senza sovracompressione del campione è necessario per conservare l'anatomia e per una corretta imaging confocale dei campioni. Per SAN, è importante assicurarsi che la regione inter-cavale sia chiaramente esposta. Per AVN, il triangolo di Koch dovrebbe essere completamente esposto. - Mettere i campioni di colorazione a montaggio intero capovolti sulla piattaforma del microscopio confocale. La SAN/AVN esposta attaccata al vetrino di copertura si trova ora sul fondo della piattaforma del microscopio (Figura 4).
NOTA: Per scattare immagini, utilizziamo il Carl Zeiss LSM800 con Airyscan Unit e il software ZEN 2.3 SP1 nero. - Scegli la piastra "BP420-480 + LP605" per l'eccitazione di Alexa Fluor 647 coniugato anti-HCN4. Variare il guadagno master da 650-750.
- Acquisire un'immagine panoramica dell'intera regione SAN e AVN utilizzando la funzione Tile Scan . Quindi selezionare la regione HCN4-positiva facendo clic e aggiungendo un quadrato sull'immagine panoramica intorno all'area di interesse che verrà scansionata.
- Controllare i parametri, comprese le piastre e il guadagno master per i canali rimanenti (Alexa Fluor 488 e DAPI) del microscopio confocale e impostarli come descritto al punto 4.6.
- Regolare lentamente lo stato attivo dall'alto verso il basso del campione per visualizzare in anteprima l'intero campione e impostare il primo e l'ultimo per l'intervallo Z-stack. Impostare un intervallo ottimale per lo stack Z in base allo spessore del campione ottico. Usiamo un obiettivo 20x e 0,8-1 μm come intervallo per Z-stack.
- Dopo aver impostato correttamente tutti i parametri, eseguire la scansione dell'intera area della SAN e dell'AVN.
- Eseguire la ricostruzione 3D delle immagini utilizzando un software (ad esempio, Imaris versione 8.4.2).
- Seleziona l'elaborazione delle immagini | Sottrazione della linea di base per rimuovere la colorazione dello sfondo.
- Selezionate Creazione superficie sull'impostazione per il canale selezionato e la regione di interesse per l'elaborazione.
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Representative Results
Utilizzando il protocollo sopra descritto, è possibile eseguire in modo affidabile l'imaging al microscopio confocale di SAN e AVN. La colorazione specifica del sistema di conduzione utilizzando anticorpi fluorescenti mirati a HCN4 e la colorazione del miocardio funzionante utilizzando anticorpi fluorescenti mirati a Cx43 consente la chiara identificazione di SAN (Figura 5, Video 1) e AVN (Figura 6, Video 2) all'interno dell'anatomia intatta.
Figura 1: Strumenti per la dissezione e portaanelli in plexiglas. A. Anello in plexiglas riempito di plastilina (la freccia rossa mostra la scanalatura formata al centro per caricare il cuore). B. Dissezione capsula di Petri con gel di agarosio. C. Forbici a molla. D. Forbici Iris. E. Pinze curve. F. Pinza fine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Illustrazione dell'anatomia cardiaca grossolana. Illustrazione schematica della microdissezione SAN. I perni vengono applicati attraverso l'apice e l'appendice atriale sinistra (LAA). SAN è indicato da un cerchio tratteggiato rosso. B. Illustrazione schematica della microdissezione AVN. I perni vengono inseriti attraverso la parte rimanente della parete libera LV (che ora si trova nella parte inferiore). AVN è indicato da un cerchio tratteggiato rosso. SVC, Vena cava superiore; IVC, vena cava inferiore; CS, seno coronarico; LAA, appendice atriale sinistra; RAA, appendice atriale destra; PA, arteria polmonare; PV, vena polmonare; LV, ventricolo sinistro; IVS, setto interventricolare; IAS, setto interatriale; DI, fossa ovale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Posizione di SAN e AVN in un cuore di topo adulto. A. Posizione del nodo senoatriale (SAN) in un cuore di topo adulto. Vista dal retro del cuore. La posizione della SAN è indicata da una linea tratteggiata rossa all'interno della regione inter-cavale (linee tratteggiate nere). SVC, Vena cava superiore; IVC, vena cava inferiore; CS, seno coronarico; LAA, appendice atriale sinistra; RAA, appendice atriale destra; PV, vena polmonare; CT, Crista terminalis; LV, ventricolo sinistro; RV, ventricolo destro. B. Posizione del nodo atrioventricolare (AVN) in un cuore di topo adulto. Vista da destra. L'AVN (cerchio tratteggiato rosso) si trova all'apice del triangolo di Koch (triangolo tratteggiato bianco) vicino alla parte inferiore del setto membranoso. Il triangolo di Koch è formato dal tendine di Todaro (TT, linea tratteggiata verde), dalla valvola tricuspide (TV, linea tratteggiata blu) e dall'orifizio del seno coronarico (CS, linea tratteggiata gialla). SVC, vena cava superiore; IVC, vena cava inferiore; IVS, setto interventricolare; DI, fossa ovale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Campione preparato caricato sulla microscopia confocale. A. Il campione preparato (freccia rossa) per microscopia confocale montato nell'anello di plexiglas con plastilina (freccia nera). Vista dal basso. B. Anello in plexiglas con campione montato caricato capovolto sulla piattaforma del microscopio confocale (microscopio inverso). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5. Ricostruzione dell'imaging al microscopio confocale di SAN in un topo C57BL6/J colorato con anticorpi anti-HCN4 (rosso) e Cx43 (bianco). Un. L'area tratteggiata delinea il SAN, che è orientato lungo la regione inter-cavale tra la vena cava superiore e inferiore. B. Ingrandimento dell'intarsio dal pannello A. C. Ricostruzione 3D del pannello B. RAA, appendice atriale destra; RA, atrio destro; SAN, nodo senoatriale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6. Ricostruzione al microscopio confocale di AVN in un topo C57BL6/J colorato con anticorpi anti-HCN4 (rosso) e Cx43 (bianco). Un. L'area tratteggiata indica l'AVN . Ingrandimento dell'intarsio dal pannello A. C. Ricostruzione 3D del pannello B. IVS, setto interventricolare; IAS, setto interatriale; AVN, nodo atrioventricolare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7. Immagine di controllo negativa. Un. colorazione a montaggio intero con controllo negativo per SAN. Il cerchio tratteggiato mostrava la regione SAN confermata dai punti di riferimento anatomici. B. colorazione di controllo negativo per SAN solo con secondi anticorpi. C. Colorazione DAPI per SAN. D . colorazione a montaggio intero con controllo negativo per AVN. Il cerchio tratteggiato mostrava la regione AVN confermata dai punti di riferimento anatomici. E . colorazione di controllo negativo per AVN solo con secondi anticorpi. F. Colorazione DAPI per AVN. RAA, appendice atriale destra; RA, atrio destro; SVC, vena cava superiore; IVS, setto interventricolare; IAS, setto interatriale; Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Video 1: Ricostruzione 3D della SAN Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Ricostruzione 3D dell'AVN Clicca qui per scaricare questo video.
| Composto | Concentrazione finale | g o mL/100 mL richiesti | |
| Soluzione di fissaggio | |||
| Formaldeide (16%) | 4% | 25 ml | |
| PBS (1x) | 75 ml | ||
| Soluzione di Triton all'1% | |||
| Triton X100 | 1% | 1 mL | |
| PBS | 99 ml | ||
| Soluzione di blocco | |||
| Triton X-100 | 1% | 1 mL | |
| BSA | 0.50% | 0,5 g | |
| Siero di capra normale | 20% | 20 ml | |
| PBS (1x) | 89 ml | ||
| Soluzione di lavaggio | |||
| Interpolazione 20 | 0.10% | 0,1 mL | |
| BSA | 0.50% | 0,5 g | |
| PBS (1x) | 99,9 ml | ||
| TAE (50x) | |||
| Tris-base | 24.20% | 24,2 g | |
| 100% acido acetico | 5.71% | 5,71 mL | |
| 0,5 M EDTA | 0,05 m | 10 ml | |
| dH2O | Aggiungere fino a 100 ml | ||
Tabella 1.
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Discussion
L'anatomia cardiaca è stata tradizionalmente studiata utilizzando sezioni istologiche sottili11. Tuttavia, questi metodi non preservano la struttura tridimensionale del sistema di conduzione e, quindi, forniscono solo informazioni 2D. Il protocollo di colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero qui descritto consente di superare queste limitazioni e può essere utilizzato di routine per l'imaging SAN e AVN.
Rispetto ai metodi standard come l'immunoistochimica convenzionale che richiedono l'incorporazione di paraffina, il sezionamento e il recupero dell'antigene, la metodologia a montaggio intero è vantaggiosa per affrontare l'esatta localizzazione e morfologia 3D di SAN e AVN e per esaminare la relazione con il tessuto circostante poiché la morfologia del tessuto è considerevolmente preservata con solo una minima disidratazione tissutale e rottura fisica. Inoltre, anche l'immunoreattività (cioè il legame degli anticorpi agli antigeni tissutali) è altamente mantenuta.
Abbiamo stabilito un metodo pratico di processione del campione per la microscopia confocale utilizzando un supporto montato ad anello di plastica riempito con plastilina12,13. La plastilina è ideale poiché può essere regolata individualmente in base alle dimensioni del tessuto, è abbastanza difficile da trattenere in modo affidabile il tessuto senza eccessiva pressione del tessuto. Soprattutto, non è fluorescente, evitando lo sfondo auto-fluorescente e quindi non interferendo con il segnale fluorescente degli anticorpi utilizzati.
Abbiamo utilizzato il microscopio a scansione laser confocale (LSM-Zeiss) con il rivelatore Airyscan, che può offrire un netto vantaggio nell'ottenere immagini di alta qualità. L'uso di un microscopio di imaging a campo ampio può offrire solo informazioni a livello tissutale, ma manca di risoluzione cellulare. Inoltre, il microscopio a campo largo comporta un rischio di fondo elevato14. Utilizzando un rivelatore Airyscan per LSM confocale, è possibile ottenere una risoluzione e un rapporto segnale-rumore (SNR) migliorati, rispetto al tradizionale sistema di imaging confocale monoforo e rivelatore15.
Le forme e la posizione di SAN e AVN sono presentate come ricostruzione 3D e ulteriori piani di sezione virtuale derivati dalla ricostruzione 3D possono migliorare l'interpretazione delle sezioni istologiche, mentre l'istologia convenzionale consente solo una valutazione 2D dell'anatomia con il rischio intrinseco di non rilevamento di strutture piccole ma rilevanti. Inoltre, la ricostruzione 3D offre l'opportunità di esaminare le strutture anatomiche di interesse transmuralmente e all'interno del microambiente intatto, ad esempio il plesso nervoso autonomo intrinseco che innerva il cuore16. La colorazione in situ a montaggio intero e la ricostruzione 3D consentono di studiare l'ambiente cellulare, nonché i tipi di cellule specifici e il loro orientamento. Inoltre, l'espressione proteica specifica regionale e cellulare può essere visualizzata e può supportare ulteriormente le analisi di western blot e proteomica17.
SAN e AVN sono strutture specializzate all'interno del cuore con un diverso modello di espressione di canali ionici e connessine che possono essere utilizzate per l'identificazione affidabile10,18. I canali cationici ciclici (HCN) attivati dall'iperpolarizzazione stabiliscono la depolarizzazione diastolica nelle cellule pacemaker e sono quindi specificamente espressi all'interno del sistema di conduzione con HCN4 come isoforma predominante nel topo19. Gli studi hanno dimostrato che HCN4 è una delle isoforme HCN rilevabili e stabilmente espresse in tutta la SAN e AVN11,20. Le connessine collegano direttamente le cellule vicine e consentono il passaggio di ioni da cellula a cellula; Sono quindi essenziali per la conduzione dell'impulso elettrico attraverso il cuore21. I modelli di espressione delle connessine variano tra le diverse regioni del cuore con Cx43 che è l'isoforma più abbondante che è stata trovata in quasi tutte le parti del cuore ad eccezione di SAN e AVN22. La combinazione di microdissezione per consentire l'esposizione di specifiche regioni di interesse con anticorpi anti-HCN4 e anti-CX43 e approcci in silico per la ricostruzione tridimensionale di immagini confocali consente un'identificazione affidabile di SAN e AVN e un'indagine completa della morfologia SAN/AVN e della loro interazione con il tessuto circostante.
La SAN e l'AVN potrebbero essere facili da distinguere dopo la colorazione con un anticorpo specifico. Per localizzare SAN e AVN in base ai loro punti di riferimento anatomici, tuttavia, è necessaria una certa pratica prima che possa essere eseguita la corretta microdissezione.
Utilizzando il protocollo di cui sopra, è possibile applicare anche una serie di altri antigeni. Il protocollo funziona bene anche su tessuto fisso sia per perfusione che per immersione. Tuttavia, il tempo di incubazione può essere regolato per una fissazione ottimale poiché alcuni anticorpi mostrano una ridotta immunoreattività quando l'antigene è sovrafissato. Poiché l'approccio di colorazione a montaggio intero richiede 7 giorni per l'incubazione di anticorpi primari e secondari, è importante immergere completamente i campioni in volumi adeguati di soluzioni contenenti anticorpi. Il rapporto di diluizione di ciascun anticorpo deve essere testato prima dell'esperimento. Per una colorazione ottimale, qualsiasi tessuto irrilevante deve essere rimosso. Per il protocollo, abbiamo conservato solo piccole parti dei ventricoli per un migliore orientamento e rimuovere tutto il tessuto adiposo circostante e le vene polmonari, poiché anche il tessuto circostante (irrilevante) potrebbe legare gli anticorpi, specialmente quando gli antigeni bersaglio sono espressi globalmente.
La colorazione in situ a montaggio completo, l'imaging confocale e la ricostruzione 3D sono una tecnica inestimabile e potente per i ricercatori di vari campi. Tuttavia, il metodo ha anche alcune limitazioni. (i) Richiede attrezzature specializzate come un microscopio confocale che non è comunemente disponibile in tutte le istituzioni. (ii) Come accennato in precedenza, la microdissezione di strutture anatomiche specializzate come SAN o AVN, ma anche l'imaging confocale e l'elaborazione post-imaging richiedono una pratica intensiva e personale esperto. (iii) Il successo del metodo dipende in larga misura dalla qualità degli anticorpi utilizzati e può quindi essere molto difficile in alcuni casi. Inoltre (iv) la ricostruzione 3D può essere difficile da ottenere e può richiedere un'intensa risoluzione dei problemi per ottimizzare la procedura. Ad esempio, è necessario impostare intervalli ottimali durante l'acquisizione dell'immagine poiché sezioni troppo distanziate lasceranno spazi vuoti e potrebbero non consentire un'adeguata ricostruzione 3D dell'anatomia. Le sezioni troppo vicine possono causare sovracampionamento e sbiancamento a causa dell'illuminazione eccessiva e richiedono molto tempo per completare un'immagine. Infine, (v) il principale limite della microscopia confocale è la profondità di imaging, il che significa che se lo spessore del campione è oltre la profondità operativa massima del microscopio confocale, l'ulteriore fluoroforo non può essere rilevato.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal China Scholarship Council (CSC, a R. Xia), dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb), dalla Fondazione Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), dall'SFB 914 (progetto Z01 a H. Ishikawa-Ankerhold e S. Massberg e progetto A10 a C. Schulz), dall'ERA-NET sulle malattie cardiovascolari (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) e dalla Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella preparazione dei manoscritti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglass ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |
References
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Medicina Numero 166 Nodo senoatriale Nodo atrioventricolare Cardiologia elettrofisiologia Sistema di conduzione cardiaca Microdissezione Immunofluorescenza Microscopia confocaleErratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
