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Summary
우리는 쥐 심장에서 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN)의 전체 마운트 면역 형광 염색을위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
동방 결절 (SAN)의 심박 조율기 세포에 의해 생리 학적으로 생성 된 전기 신호는 방실 결절 (AVN)을 포함하는 전도 시스템을 통해 전도되어 전체 심장의 흥분과 수축을 허용합니다. SAN 또는 AVN의 기능 장애는 부정맥을 유발하여 전기 생리학 및 부정맥 발생에서 근본적인 역할을 나타냅니다. 마우스 모델은 부정맥 연구에 널리 사용되지만 SAN 및 AVN에 대한 구체적인 조사는 여전히 어렵습니다.
SAN은 상대 정맥과 크리스타 터미널의 교차점에 위치하고 AVN은 관상 동맥, 삼첨판 고리 및 Todaro의 힘줄의 구멍에 의해 형성된 Koch의 삼각형의 정점에 위치합니다. 그러나 크기가 작기 때문에 기존 조직학에 의한 시각화는 여전히 어렵고 3D 환경 내에서 SAN 및 AVN을 연구할 수 없습니다.
여기에서는 라벨링된 마우스 SAN 및 AVN의 로컬 시각화를 허용하는 전체 마운트 면역형광 접근법에 대해 설명합니다. 전체 마운트 면역형광 염색은 수동 절편이 필요 없는 조직의 더 작은 부분을 위한 것입니다. 이를 위해 마우스 심장을 해부하고 원치 않는 조직을 제거한 다음 고정, 투과 및 차단합니다. SAN 및 AVN 내의 전도 시스템의 세포는 항 -HCN4 항체로 염색됩니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 및 이미지 처리를 통해 결절 세포와 작동하는 심근 세포를 구별하고 SAN과 AVN을 명확하게 국소화할 수 있습니다. 또한, 추가 항체를 결합하여 신경 섬유와 같은 다른 세포 유형도 표지 할 수 있습니다.
기존의 면역 조직학과 비교하여 전체 마운트 면역 형광 염색은 심장 전도 시스템의 해부학 적 무결성을 보존하여 AVN을 조사 할 수 있습니다. 특히 해부학 적 구조와 주변의 작동하는 심근 및 비 근육 세포 세포와의 상호 작용에 대해서도 마찬가지입니다.
Introduction
부정맥은 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 흔한 질병이며 전 세계적으로 심각한 이환율과 사망률의 원인입니다. 심장 박동기의 개발과 같은 치료 및 예방의 엄청난 발전에도 불구하고 부정맥 치료는 주로 근본적인 질병 메커니즘에 대한 지식이 매우 제한적이기 때문에 여전히 어렵습니다 1,2,3. 정상적인 전기 생리학과 부정맥의 병태생리학을 더 잘 이해하면 미래에 새롭고 혁신적이며 인과 관계가 있는 치료 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 부정맥 발생을 종합적으로 연구하려면 마우스가 전기 생리학 연구에 널리 사용되기 때문에 마우스와 같은 동물 모델에서 특정 심장 전도 시스템을 국소화하고 시각화하는 것이 중요합니다.
심장 전도 시스템의 주요 부분은 특수 심박 조율기 세포에서 전기 충격이 생성되는 동방 결절 (SAN)과 심방과 심실 사이의 유일한 전기적 연결 인 방실 결절 (AVN)입니다4. SAN과 AVN의 전기 생리 학적 특성이 변경 될 때마다 아픈 부비동 증후군이나 방실 차단과 같은 부정맥이 발생하여 혈역학 적 악화, 실신 및 심지어 사망으로 이어질 수 있으므로 전기 생리학 및 부정맥 발생에서 SAN과 AVN의 필수적인 역할을 강조합니다5.
SAN 또는 AVN에 대한 포괄적인 연구에서는 두 구조의 정확한 위치 파악과 시각화가 필요하며, 이상적으로는 생리학적 환경 내에서 가능합니다. 그러나 작동하는 심근 내의 크기와 위치가 작기 때문에 명확한 거시적으로 보이는 구조를 설정하지 않고 SAN 및 AVN의 해부학 및 전기 생리학을 연구하는 것은 어렵습니다. 해부학적 랜드마크를 사용하여 SAN 및 AVN 6,7,8이 포함된 영역을 대략적으로 식별할 수 있습니다. 간단히 말해서, SAN은 근육 크리스타 터미널 (CT)에 인접한 우심방의 기병 간 영역에 위치하며, AVN은 삼첨판 막, 관상 동맥동의 ostium 및 Todaro의 힘줄에 의해 설정된 Koch의 삼각형 내에 위치합니다. 지금까지 이러한 해부학 적 랜드 마크는 주로 SAN 및 AVN을 개별 구조로 국소화, 제거 및 연구하는 데 사용되었습니다 (예 : 기존 조직학). 그러나 SAN 및 AVN의 복잡한 전기 생리학(예: 작동하는 심근의 인접 세포의 조절 효과)을 더 잘 이해하려면 생리학적 3D 환경 내에서 전도 시스템을 연구해야 합니다.
전체 마운트 면역 형광 염색은 주변 조직의 무결성을 유지하면서 현장에서 해부학 적 구조를 연구하는 데 사용되는 방법입니다9. 컨포칼 현미경 및 이미지 분석 소프트웨어를 활용하여 SAN 및 AVN은 이러한 영역에서 특이적으로 발현되는 이온 채널을 표적으로 하는 형광 표지된 항체로 시각화할 수 있습니다.
다음 프로토콜은 SAN 및 AVN 현미경 위치 파악 및 시각화를 위해 잘 정립된 전체 마운트 염색 방법을 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 특히, 이 프로토콜은 (1) 염색 및 현미경 분석을 위해 이러한 샘플을 준비하기 위해 해부학적 랜드마크로 SAN 및 AVN을 국소화하는 방법 (2) 참조 마커 HCN4 및 Cx43의 전체 마운트 면역형광 염색을 수행하는 방법(3)을 설명하고, SAN 및 AVN의 컨포칼 이미징을 수행하기 위해 컨포칼 현미경을 위한 SAN 및 AVN 샘플을 준비합니다(4). 우리는 또한 심장 내의 심장 전도 시스템을 철저히 조사 할 수있는 자율 신경 섬유와 같은 주변 작동 심근 또는 비 근육 세포 세포의 추가 염색을 포함하도록이 프로토콜을 수정하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
동물 관리 및 모든 실험 절차는 뮌헨 대학의 동물 관리 및 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었으며 마우스에 대한 모든 절차는 독일 뮌헨 바이에른 정부의 승인을 받았습니다(ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J 마우스는 잭슨 연구소로부터 구입하였다.
참고: 그림 1 은 실험에 필요한 기기를 보여줍니다. 도 2 는 총 심장 해부학의 그림을 나타낸다. 도 3 은 성인 마우스 심장에서 SAN 및 AVN의 위치를 나타낸다. 도 4 는 공초점 현미경에 로딩된 준비된 샘플을 나타낸다.
1. 준비
- PBS 30mL에 16% 포름알데히드 용액 10mL를 희석하여 4% 포름알데히드 용액(4% PFA)을 준비합니다.
- 수크로오스 분말 15g과 30g을 각각 PBS 100mL에 녹여 15% 수크로오스 용액과 30% 수크로오스 용액을 제조한다. 슈크로스 분말이 완전히 용해된 후, 4°C에서 저장하기 전에 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과한다.
- 3%-4% 아가로스 겔을 준비하고, 3g 또는 4g의 아가로스 분말과 100mL의 1x TAE(50x TAE 원액에서 희석)를 비이커에 추가합니다. 비커를 자기 교반기에 놓고 아가 로스가 완전히 녹을 때까지 끓입니다.
- 직경 30mm의 페트리 접시에 아가로스 겔(3%-4%)을 100mL 부드럽게 부어 해부 접시를 준비합니다. 페트리 접시를 실온의 벤치에 두어 식히고 굳 힙니다.
- 블로킹 용액과 세척액을 표 1에 제공된 레시피에 따라 준비한다. 사용 당일에 준비된 모든 용액을 준비하십시오. 장기 보관은 권장하지 않습니다.
- 항체 용액을 차가운(4°C) 1x PBS로 희석하여 준비하고, 희석액을 빛으로부터 보호하고(예: 알루미늄 호일을 감싸서) 사용할 때까지 희석액을 얼음 위에 보관합니다. 배양 직전에 항체를 희석하십시오. 희석된 항체를 실온에 방치하지 마십시오.
참고: 적절한 항체 희석은 기존의 면역형광 염색을 수행하여 비교 가능한 조직 샘플로 테스트해야 합니다. 여기에서, 10 μm의 두께로 절단된 동결 절편을 염색하여 항체를 시험하였다.
2. 장기 적출 및 조직 준비
- 마우스를 이소플루란 기화기에 연결된 배양 챔버에 넣어 마취합니다. 4-5 % 이소 플루 란 (각각 96-95 % 산소)을 전달하도록 기화기를 설정하십시오.
알림: 완전 마취는 자세 반응의 상실과 마우스가 등을 대고 놓일 때까지 챔버를 부드럽게 굴려 반사를 교정함으로써 확인됩니다. - 마우스를 수술대 위의 앙와위 자세로 놓습니다. 마우스 코를 이소플루란 기화기에 연결된 내부 튜브가 있는 수정된 Bain 회로에 연결된 마취 마스크에 넣습니다. 마취를 유지하려면 1 L / min의 유속으로 산소에 1-2 % 이소 플루 란을 사용하십시오. 마스크의 외부 튜브를 통해 마우스에서 과도한 마취 증기를 제거하고 과도한 마취 가스를 흡수하는 활성탄 용기를 통해 흡입합니다.
- 완전 마취가 이루어지면 진통제를 위해 펜타닐을 주사하십시오 (0.1 μg / 25 g 체중 i.p.).
- 발가락 핀치 반사가 감지되지 않으면 홍채 가위를 사용하여 경정맥에서 교합체까지 명확하게 절단하여 모피와 피부를 제거합니다. 홍채 가위를 사용하여 갈비뼈 아래에서 왼쪽에서 오른쪽으로 다시 잘라 복부를 조심스럽게 엽니 다.
- 구부린 집게를 사용하여 xiphoid를 약간 살려 장기를 손상시키지 않고 다이어프램을 왼쪽에서 오른쪽으로 절단할 수 있습니다. 홍채 가위를 사용하여 양쪽의 내측 겨드랑이 선에서 흉곽을 잘라 두개골로 뒤집고 심장에 접근 할 수 있도록합니다.
- 홍채 가위를 사용하여 횡격막 수준에서 하대 정맥과 하강 흉부 대동맥을 자릅니다. 정점 부위에 27G 바늘로 심장을 뚫은 다음 바늘을 좌심실 (LV)에 조심스럽게 밀어 넣습니다. 5-10mL의 얼음처럼 차가운 PBS를 LV에 부드럽게 주입하여 심장을 관류시킵니다.
알림: 심장의 색이 빨간색에서 회색으로 바뀌어 PBS로 성공적으로 관류되었음을 나타냅니다. - 핀셋을 사용하여 심장의 정점을 조심스럽게 들어 올려 큰 혈관을 자르고 심장을 제거합니다.
- 상대정맥(SVC)의 손상을 방지하기 위해 심장에서 가능한 한 멀리 떨어진 큰 동맥과 정맥을 절단하여 심장을 절제하십시오. SVC는 나중에 처리하는 동안 중요한 랜드마크 역할을 하므로 보존합니다.
- 심장 제거 후 이소 플루 란 기화기를 끄십시오.
- 해부 현미경으로 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 해부 접시에 심장을 넣으십시오. 심장의 왼쪽 / 오른쪽 및 앞 / 뒤를 결정한 후 접시 바닥에있는 심장의 앞쪽으로 심장을 돌립니다 (뒤쪽에있는 큰 혈관을 노출시키기 위해).
- 정점과 좌심방 부속기 (LAA)를 통해 작은 핀을 해부 접시 바닥의 아가 로스에 넣어 심장을 고정시킵니다 (그림 2A). 가는 핀셋과 가위를 사용하여 SVC 주변의 비심장 조직과 하대정맥(IVC)(예: 폐, 지방, 심낭)을 조심스럽게 제거하여 기층 간 영역을 노출시킵니다(그림 3A).
- 마이크로 가위로 심실과 심방 사이의 홈을 평행하게 절단하여 대부분의 심실을 제거합니다. 나중에 Plexiglas 링에 로딩하기 위해 심실 조직의 작은 부분을 보존하십시오.
- 고정 및 탈수를 위해, 샘플(심방, SVC 및 IVC 함유)을 4% PFA에 넣고 4°C에서 밤새 하였다.
- 다음날, 심장을 4°C에서 24시간 동안 15% 수크로스 용액으로 옮긴다.
- 다음날, 심장을 4°C에서 24시간 동안 30% 수크로스 용액으로 옮긴다.
참고: 2.13, 2.14 및 2.15단계의 고정 및 탈수를 위해 샘플을 더 이상 교반하거나 흔들지 않고 4°C에 둡니다.
3. 전체 마운트 면역 형광 염색
- PBS에 희석된 1% Triton X-100으로 심장을 세척하고 4°C에서 밤새 블로킹 용액(표 1)에서 차단 및 투과화시켰다.
- 심장을 1.5mL 튜브에 넣고 블로킹 용액으로 희석한 토끼 항-마우스 코넥신-43(1:200의 희석) 및 래트 항-마우스 HCN4(1:200의 희석) 항체와 함께 4°C에서 7일 동안 배양합니다.
참고: 데이터시트를 배향으로 사용하기 전에 1차 항체의 최적 농도를 테스트해야 합니다. 1차 항원의 숙주 종이 다른 항원과 상이한 한, 관심있는 다른 항원도 이 단계에서 염색될 수 있다. Triton X-100의 농도가 높을수록10 이전에 입증 된 바와 같이보다 효율적인 항체 염색을 얻는 데 도움이 될 수 있지만 농도는 개별적으로 결정될 수 있습니다. - 7 일 후, 피펫을 사용하여 1 차 항체가 포함 된 용액을 제거하고 1 % Triton X-100 용액으로 심장을 3 회 (오비 탈 셰이커에서 실온에서 1 시간 동안) 씻어 낸다.
- 세척 후, 심장=알렉사 플루오르 488 염소 항-래트 IgG (1:200의 희석) 및 알렉사 플루오르 647 염소 항-래빗 IgG (1:200의 희석)와 함께 4°C에서 7일 동안 인큐베이션한다.
- 7일 후, 피펫을 사용하여 2차 항체를 포함하는 모든 용액을 제거한다. 그런 다음 세척액 (표 1)을 사용하여 3 회 (오비 탈 쉐이커에서 실온에서 1 시간 동안마다) 심장을 씻으십시오.
- 핵을 염색하려면 심장을 DAPI 용액(10μg/mL)에서 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 다음날, 세척액으로 심장을 3 번 씻으십시오 (오비 탈 셰이커의 실온에서 1 시간 동안).
참고: 단계 3.1, 3.2, 3.4 및 3.6에서 차단, 투과화, 항체 인큐베이션 및 DAPI 염색을 위해, 샘플을 4°C에서 정상 상태로 두고, 교반이 필요하지 않다. 염색된 조직은 4°C에서 세척액으로 완전히 덮고 보존할 수 있었고 컨포칼 현미경에서 이미징될 때까지 며칠 동안 빛으로부터 보호될 수 있었습니다.
4. 컨포칼 현미경
- 플렉시 유리 링을 준비하고 플라스틱으로 채 웁니다 (그림 1). 플라스틱의 중앙에는 심장을 적재하기 위해 중앙에 작은 홈이 형성됩니다. 평평한 이미징 평면을 획득하고 공간을 조정하고 4.4단계에서 샘플과 커버슬립 사이의 기포를 피하기 위해 얕은 홈을 만드십시오.
- SAN과 AVN의 이미징에 동일한 심장 샘플을 순차적으로 사용합니다. SAN 영상의 경우 심장에 직접 부하를 가하는 반면 AVN 영상의 경우 전에 미세 해부를 수행하십시오.
- SAN 이미징
- 해부학 적 랜드 마크로 SAN을 식별하십시오 : 그것은 기병 간 영역 (상대 정맥과 하대 정맥 사이의 영역) 내에서 심장의 등쪽에 위치합니다. 크리스타 터미널리스 (CT)는 SAN과 RAA 사이의 근육 줄무늬입니다.
- 심장의 뒷면이 위를 향하도록 하여 심장을 플라스틱 홈에 넣습니다. 심장이 PBS로 완전히 덮일 때까지 PBS를 심장에 추가하여 구멍 내의 모든 공기를 대체합니다(일반적으로 PBS 몇 방울이면 충분합니다).
- 해부 현미경으로 RAA, LAA 및 좌심실의 나머지 부분을 플라스틱으로 부드럽게 눌러 심장을 고정시킵니다. 전체 기병 간 영역과 크리스타 터미널이 명확하게 보일 수 있는지 확인하십시오 (플라스틱으로 덮여 있지 않음). 이미징 될 영역은 그림 3A에 나와 있습니다.
- AVN 이미징
- SAN의 이미징을 완료한 후 동일한 샘플을 회수한 후 AVN 이미징에 사용합니다. AVN 미세 해부의 경우 심장 = 해부 현미경 아래의 해부 접시에 놓습니다.
- 오른쪽이 위를 향하도록 심장의 방향을 잡습니다 (우심실의 나머지 부분 포함). LV 자유 벽의 나머지 부분 (현재 하단에 있음)에 핀을 넣어 조직을 고정시킵니다 (그림 2B).
- 나머지 RV 자유 벽을 삼첨판 막과 상대 정맥을 통해 위쪽으로 자릅니다. 그런 다음 RV와 RA를 뒤집어 심실 및 심방 중격을 노출시킵니다. (그림 3B)
알림: 관상 동맥 부비동 (CS)은 AVN을 국소화 할 수있는 Koch의 삼각형을 찾는 중요한 해부학 적 랜드 마크이므로 손상되지 않도록주의하십시오. CS는 심장 뒤쪽의 좌측 방실 홈에서 횡 방향으로 움직이며 CS 구멍 개구부는 심방 중격의 하부에있는 IVC와 삼첨판 사이에 위치합니다 (그림 3A 및 B). - 우심방의 심내막 표면에서 찾을 수있는 Koch의 삼각형을 확인하고, 삼첨판 막 (TV)의 중격 전단지의 힌지 라인에 의해 앞쪽으로, Todaro의 힘줄에 의해 뒤쪽으로 경계를 이룹니다. 기저부는 관상 동맥의 구멍에 의해 형성됩니다 (그림 3B). AVN 이미징의 대상 영역이므로 명확하게 표시되어야 합니다.
- Koch의 삼각형이 명확하게 노출된 상태에서 Plexiglas 링 내의 플라스틱 홈으로 심장을 옮깁니다(즉, 플라스틱으로 덮여 있지 않음). Koch 삼각형 주변의 조직을 플라스틱으로 부드럽게 눌러 샘플을 고정합니다. 심장이 PBS로 완전히 덮일 때까지 PBS를 심장에 추가하여 구멍 내의 모든 공기를 대체합니다(일반적으로 PBS 몇 방울이면 충분합니다).
- SAN 이미징
- 플렉시 글라스 링의 가장자리에 실리콘을 바르면 플라스틱으로 채워진 플렉시 글라스 링 내에로드 된 하트를 커버 슬립으로 덮을 수 있습니다.
- 플라스틱의 뒷면을 부드럽게 눌러 PBS의 일부를 짜내고 이미징 영역 내의 기포를 피하면서 커버슬립에 하트를 부착합니다.
알림: 플라스틱의 뒷면을 누르는 동안 관심 영역이 접히거나 덮이지 않았는지 확인하십시오. 샘플 과압축이 없는 평평한 이미징 평면은 해부학을 보존하고 샘플의 적절한 컨포칼 이미징에 필요합니다. SAN의 경우 기병 간 영역이 명확하게 노출되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. AVN의 경우 Koch의 삼각형이 완전히 노출되어야합니다. - 전체 마운트 염색 샘플을 컨포칼 현미경의 플랫폼에 거꾸로 놓습니다. 커버 슬립에 부착된 노출된 SAN/AVN은 이제 현미경 플랫폼의 바닥에 있습니다(그림 4).
참고: 이미지를 촬영하기 위해 에어리스캔 유닛이 장착된 칼자이스 LSM800과 소프트웨어 ZEN 2.3 SP1 검정색을 사용합니다. - Alexa Fluor 647 접합 항 HCN4의 여기를 위해 플레이트 "BP420-480 + LP605"를 선택하십시오. 마스터 게인을 650-750으로 변경합니다.
- 타일 스캔 기능을 사용하여 전체 SAN 및 AVN 영역의 개요 이미지를 촬영합니다. 그런 다음 스캔할 관심 영역 주변의 개요 이미지에 사각형을 클릭하고 추가하여 HCN4 포지티브 영역을 선택합니다.
- 컨포칼 현미경의 나머지 채널(Alexa Fluor 488 및 DAPI)에 대한 플레이트 및 마스터 게인을 포함한 파라미터를 확인하고 4.6단계에 설명된 대로 설정합니다.
- 샘플의 위에서 아래로 초점을 천천히 조정하여 전체 샘플을 미리 보고 Z 스택 범위의 첫 번째 와 마지막 을 설정합니다. 광학 샘플의 두께를 기준으로 Z 스택에 대한 최적 간격을 설정합니다. 20x 대물렌즈를 사용하고 Z 스택의 간격으로 0.8-1μm를 사용합니다.
- 모든 매개 변수가 올바르게 설정되면 SAN 및 AVN의 전체 영역을 스캔합니다.
- 소프트웨어(예: Imaris 버전 8.4.2)를 사용하여 이미지의 3D 재구성을 수행합니다.
- 이미지 처리 선택 | 기준선 빼기 - 배경 얼룩을 제거합니다.
- 선택한 채널 및 처리할 관심 영역에 대한 설정에서 표면 생성을 선택합니다.
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Representative Results
위에서 설명한 프로토콜을 사용하면 SAN과 AVN 모두의 컨포칼 현미경 이미징을 안정적으로 수행할 수 있습니다. HCN4를 표적으로 하는 형광 항체를 사용한 전도 시스템의 특정 염색과 Cx43을 표적으로 하는 형광 항체를 사용한 작동 심근의 염색을 통해 온전한 해부학 내에서 SAN (그림 5, 비디오 1) 및 AVN (그림 6, 비디오 2)을 명확하게 식별할 수 있습니다.
그림 1: 해부용 기구 및 플렉시유리 링 홀더. A. 플라스틱으로 채워진 플렉시 유리 링 (빨간색 화살표는 심장을 적재하기 위해 중앙에 형성된 홈을 나타냄). B. 아가 로스 젤로 페트리 접시를 해부하십시오. C. 봄 가위. D. 아이리스 가위. E. 곡선 집게. F. 미세 집게. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 전체 심장 해부학의 그림. 답변. SAN 미세 해부의 개략도. 핀은 정점과 좌심방 부속기 (LAA)를 통해 적용됩니다. SAN은 빨간색 파선으로 표시됩니다. 나. AVN 미세 해부의 개략도. 핀은 LV 자유 벽의 나머지 부분 (현재 하단에 있음)을 통과합니다. AVN은 빨간색 파선으로 표시됩니다. SVC, 우수한 대정맥; IVC, 하대 정맥; CS, 관상 동맥; LAA, 좌심방 부속기; RAA, 우심방 부속기; PA, 폐동맥; PV, 폐정맥; LV, 좌심실; IVS, 심실 중격; IAS, 심방 중격; OF, 타원형 포사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 성인 마우스 심장에서 SAN 및 AVN의 위치. 답변. 성인 마우스 심장에서 동방 결절 (SAN)의 위치. 마음의 뒤에서 볼 수 있습니다. SAN의 위치는 기공 간 영역 내에서 빨간색 점선(검은색 점선)으로 표시됩니다. SVC, 우수한 대정맥; IVC, 하대 정맥; CS, 관상 동맥; LAA, 좌심방 부속기; RAA, 우심방 부속기; PV, 폐정맥; CT, 크리스타 터미널; LV, 좌심실; RV, 우심실. 나. 성인 마우스 심장에서 방실 결절 (AVN)의 위치. 오른쪽에서 본 모습. AVN (빨간색 점선 원)은 막 중격의 바닥 근처에있는 Koch 삼각형 (흰색 점선 삼각형)의 정점에 있습니다. Koch의 삼각형은 Todaro (TT, 녹색 점선), 삼첨판 막 (TV, 파란색 점선) 및 관상 동맥 구멍 (CS, 노란색 점선)의 힘줄에 의해 형성됩니다. SVC, 우수한 대정맥; IVC, 하대 정맥; IVS, 심실 중격; OF, 타원형 포사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 컨포칼 현미경에 로드된 준비된 샘플. 답변. 공초점 현미경을 위해 준비된 샘플 (빨간색 화살표)을 플라 스티 신 (검은 색 화살표)으로 플렉시 글라스 링에 장착합니다. 아래에서 본 모습. 나. 컨포칼 현미경(역 현미경)의 플랫폼에 거꾸로 로드된 샘플이 장착된 플렉시유리 링. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 항 HCN4(빨간색) 및 Cx43(흰색) 항체로 염색된 C57BL6/J 마우스에서 SAN의 컨포칼 현미경 이미징 재구성. 답변. 점선 영역은 SAN을 묘사하며, 이는 상대 정맥과 하대 정맥 사이의 기간 영역을 따라 지향됩니다. 나. 패널 A.C에서 상감 세공의 확대 패널 B. RAA, 우심방 부속기의 3D 재구성; RA, 우심방; SAN, 동방 결절. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 항 HCN4 (빨간색) 및 Cx43 (흰색) 항체로 염색 된 C57BL6 / J 마우스에서 AVN의 컨 포칼 현미경 이미징 재구성. 답변. 파선 영역은 AVN을 나타냅니다. 패널 A. C. 로부터의 인레이의 배율 패널 B. IVS의 3D 재구성, 심실 중격; IAS, 심방 중격; AVN, 방실 결절. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 음성 제어 이미지. 답변. SAN에 대한 음성 대조군 전체 마운트 염색. 점선은 해부학 랜드 마크로 확인 된 SAN 영역을 보여주었습니다. 나. 두 번째 항체로만 SAN에 대한 음성 대조군 염색. 씨. SAN에 대한 DAPI 염색. D . AVN에 대한 음성 대조군 전체 마운트 염색. 점선은 해부학 적 랜드 마크로 확인 된 AVN 영역을 보여주었습니다. E . 두 번째 항체만으로 AVN에 대한 음성 대조군 염색. 에프. AVN에 대한 DAPI 염색. RAA, 우심방 부속기; RA, 우심방; SVC, 우수한 대정맥; IVS, 심실 중격; IAS, 심방 중격; 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: SAN의 3D 재구성 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: AVN의 3D 재구성 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 화합물 | 최종 농도 | g 또는 mL/100mL 필요 | |
| 고정 솔루션 | |||
| 포름 알데히드 (16 %) | 4% | 25 밀리리터 | |
| PBS (1x) | 75 밀리리터 | ||
| 1% 트리톤 용액 | |||
| 트리톤 X100 | 1% | 1 mL | |
| 증권 시세 표시기 | 99 밀리리터 | ||
| 차단 솔루션 | |||
| 트리톤 X-100 | 1% | 1 mL | |
| 증권 시세 표시기 | 0.50% | 0.5 지 | |
| 일반 염소 혈청 | 20% | 20 밀리리터 | |
| PBS (1x) | 89 밀리리터 | ||
| 세척액 | |||
| 트윈 20 | 0.10% | 0.1 밀리리터 | |
| 증권 시세 표시기 | 0.50% | 0.5 지 | |
| PBS (1x) | 99.9 밀리리터 | ||
| 태(50×) | |||
| 트리스 베이스 | 24.20% | 24.2 그램 | |
| 100% 아세트산 | 5.71% | 5.71 밀리리터 | |
| 0.5 미터 EDTA | 0.05 미터 | 10 밀리리터 | |
| dH2O | 최대 100mL 추가 | ||
표 1.
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Discussion
심장 해부학은 전통적으로 얇은 조직 학적 섹션11을 사용하여 연구되었습니다. 그러나 이러한 방법은 전도 시스템의 3차원 구조를 보존하지 않으므로 2D 정보만 제공합니다. 여기에 설명된 전체 마운트 면역형광 염색 프로토콜을 사용하면 이러한 한계를 극복할 수 있으며 SAN 및 AVN 이미징에 일상적으로 사용할 수 있습니다.
파라핀 임베딩, 절편 및 항원 회수가 필요한 기존의 면역조직화학과 같은 표준 방법과 비교할 때, 전체 장착 방법론은 SAN 및 AVN의 정확한 3D 국소화 및 형태를 해결하고 조직 형태가 최소한의 조직 탈수 및 물리적 파열만으로 상당히 보존되기 때문에 주변 조직과의 관계를 조사하는 데 유리합니다. 또한, 면역반응성 (즉, 조직 항원에 대한 항체의 결합) 또한 높게 유지된다.
우리는 플라스틱12,13으로 채워진 플라스틱 링 장착 홀더를 사용하여 컨포칼 현미경을 위한 실용적인 샘플 행렬 방법을 확립했습니다. 플라 스티 신은 조직의 크기에 맞게 개별적으로 조정할 수 있기 때문에 이상적이며, 조직의 과도한 압력없이 조직을 안정적으로 유지하기에 충분히 어렵습니다. 가장 중요한 것은 형광성이 아니므로 자동 형광 배경을 피하므로 사용 된 항체의 형광 신호를 방해하지 않는다는 것입니다.
우리는 Airyscan 검출기와 함께 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(LSM-Zeiss)을 사용했는데, 이는 고품질의 이미지를 얻는 데 뚜렷한 이점을 제공할 수 있습니다. 광시야 이미징 현미경을 사용하면 조직 수준의 정보만 제공할 수 있지만 세포 해상도가 부족합니다. 또한 광시야 현미경은 높은 배경14의 위험을 수반합니다. 공초점 LSM을 위한 Airyscan 검출기를 사용함으로써, 기존의 하나의 핀홀-및-검출기 공초점 이미징 시스템(15)에 비해 개선된 분해능 및 신호 대 잡음비(SNR)를 획득할 수 있다.
SAN 및 AVN의 모양과 위치는 3D 재구성으로 표시되며 3D 재구성에서 파생된 추가 가상 단면 평면은 조직학적 섹션의 해석을 향상시킬 수 있는 반면, 기존 조직학은 작지만 관련성이 있는 구조를 감지하지 못할 위험이 내재된 해부학의 2D 평가만 허용합니다. 더욱이, 3D 재구성은 관심있는 해부학 적 구조를 경벽적으로 그리고 손상되지 않은 미세 환경 내에서, 예를 들어 심장을 자극하는 내재적 자율 신경 플렉스(16)를 검사 할 수있는 기회를 제공한다. 전체 장착 현장 염색 및 3D 재구성을 통해 세포 환경뿐만 아니라 특정 세포 유형 및 방향을 조사할 수 있습니다. 또한, 지역 및 세포 유형 특이적 단백질 발현을 시각화할 수 있고, 웨스턴 블롯 및 단백질체학 분석(17)을 추가로 지원할 수 있다.
SAN 및 AVN은 신뢰할 수 있는 식별(10,18)에 사용될 수 있는 이온 채널 및 연결의 상이한 발현 패턴을 갖는 심장 내의 특수 구조이다. 과분극-활성화된 고리형 뉴클레오티드-게이팅 양이온 채널 (HCN)은 심박 조율기 세포에서 이완기 탈분극을 확립하고, 따라서 HCN4가 마우스(19)에서 우세한 이소형인 전도 시스템 내에서 특이적으로 발현된다. 연구에 따르면 HCN4는 SAN 및 AVN11,20 전반에 걸쳐 검출 가능하고 안정적으로 발현되는 HCN 이소 폼 중 하나입니다. Connexins는 인접한 세포를 직접 연결하고 세포에서 세포로 이온의 통과를 허용합니다. 따라서 그들은 심장을 통한 전기 충격의 전도에 필수적입니다21. Connexin 발현 패턴은 심장의 여러 영역마다 다르며 Cx43은 SAN 및 AVN22를 제외한 심장의 거의 모든 부분에서 발견되는 가장 풍부한 이소 형입니다. 미세 해부를 결합하여 특정 관심 영역을 항 HCN4 및 항 CX43 항체와 결합하고 컨포칼 이미지의 3차원 재구성을 위한 인실리코 접근법을 통해 SAN 및 AVN을 안정적으로 식별하고 SAN/AVN 형태 및 주변 조직과의 상호 작용을 포괄적으로 조사할 수 있습니다.
SAN과 AVN은 특정 항체로 염색한 후 쉽게 구별할 수 있습니다. 그러나 해부학적 랜드마크로 SAN과 AVN을 현지화하려면 올바른 미세 해부를 수행하기 전에 몇 가지 연습이 필요합니다.
상기 프로토콜을 사용하여, 다수의 다른 항원이 또한 적용될 수 있다. 이 프로토콜은 또한 관류 고정 및 침지 고정 조직 모두에서 잘 작동합니다. 그러나, 특정 항체는 항원이 과도하게 고정될 때 감소된 면역반응성을 나타내기 때문에 최적의 고정을 위해 배양 시간이 조정될 수 있다. 전체 마운트 염색 접근법은 1차 및 2차 항체 배양에 7일이 필요하므로 적절한 양의 항체 함유 용액에 샘플을 완전히 담그는 것이 중요합니다. 각 항체의 희석 비율은 실험 전에 테스트해야합니다. 최적의 염색을 위해서는 관련없는 조직을 제거해야합니다. 프로토콜의 경우, 특히 표적 항원이 전 세계적으로 발현될 때 주변(관련이 없는) 조직도 항체에 결합할 수 있으므로 더 나은 방향을 위해 심실의 작은 부분만 보존하고 주변의 모든 지방 조직과 폐정맥을 제거했습니다.
전체 장착 현장 염색, 컨포칼 이미징 및 3D 재구성은 다양한 분야의 연구자에게 매우 중요하고 강력한 기술입니다. 그러나이 방법에는 몇 가지 제한 사항도 있습니다. (i) 모든 기관에서 일반적으로 사용할 수 없는 컨포칼 현미경과 같은 특수 장비가 필요합니다. (ii) 위에서 언급했듯이 SAN 또는 AVN과 같은 특수 해부학적 구조의 미세 해부뿐만 아니라 컨포칼 이미징 및 사후 이미징 처리에는 집중적인 연습과 숙련된 인력이 필요합니다. (iii) 상기 방법의 성공은 사용된 항체의 품질에 크게 의존하며, 따라서 어떤 경우에는 매우 어려울 수 있다. 또한 (iv) 3D 재구성은 달성하기 어려울 수 있으며 절차를 최적화하기 위해 집중적 인 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 너무 멀리 떨어진 섹션은 간격을 남기고 해부학의 적절한 3D 재구성을 허용하지 않을 수 있으므로 이미지 획득 중에 최적의 간격을 설정해야 합니다. 너무 가까운 섹션은 과도한 조명으로 인해 오버샘플링 및 표백이 발생할 수 있으며 하나의 이미지를 완성하는 데 시간이 오래 걸립니다. 마지막으로 (v) 컨포칼 현미경의 주요 한계는 이미징 깊이이며, 이는 샘플 두께가 컨포칼 현미경의 최대 작동 깊이를 초과하면 추가 형광단을 검출할 수 없음을 의미합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 장학위원회 (CSC, R. Xia), 독일 심혈관 연구 센터 (DZHK; 81X2600255에서 S. Clauss, 81Z0600206에서 S. Kääb), 코로나 재단 (S199 / 10079 / 2019에서 S. Clauss), SFB 914 (프로젝트 Z01에서 H. Ishikawa-Ankerhold 및 S. Massberg 및 프로젝트 A10에서 C. Schulz까지), 심혈관 질환에 관한 ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910에서 S. Clauss까지) 및 Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss에게). 기금 제공자는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglass ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |
References
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의학 166호 동방결절 방실결절 심장학 전기생리학 심장전도계 미세해부 면역형광법 공초점 현미경Erratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
