ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Мы предоставляем пошаговый протокол для иммунофлуоресцентного окрашивания синоатриального узла (SAN) и атриовентрикулярного узла (AVN) в сердцах мышей.
Abstract
Электрический сигнал, физиологически генерируемый клетками кардиостимулятора в синоатриальном узле (SAN), проводится через проводящую систему, которая включает в себя атриовентрикулярный узел (AVN), чтобы обеспечить возбуждение и сокращение всего сердца. Любая дисфункция SAN или AVN приводит к аритмиям, что указывает на их фундаментальную роль в электрофизиологии и аритмогенезе. Мышиные модели широко используются в исследованиях аритмии, но конкретное исследование SAN и AVN остается сложным.
SAN расположен на стыке crista terminalis с верхней полой веной, а AVN расположен на вершине треугольника Коха, образованного отверстием коронарного синуса, трикуспидальным кольцом и сухожилием Тодаро. Однако из-за небольших размеров визуализация с помощью обычной гистологии остается сложной задачей и не позволяет изучать SAN и AVN в их 3D-среде.
Здесь мы описываем цельномонтный иммунофлуоресцентный подход, который позволяет локально визуализировать меченые мыши SAN и AVN. Полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание предназначено для небольших участков ткани без необходимости ручного сечения. С этой целью сердце мыши рассекают, удаляют нежелательные ткани с последующей фиксацией, пермеабилизацией и блокировкой. Затем клетки проводящей системы внутри SAN и AVN окрашивают антителом против HCN4. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия и обработка изображений позволяют дифференцировать узловые клетки и работающие кардиомиоциты, а также четко локализовать SAN и AVN. Кроме того, дополнительные антитела могут быть объединены для маркировки других типов клеток, таких как нервные волокна.
По сравнению с традиционной иммуногистологией, полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание сохраняет анатомическую целостность сердечной проводящей системы, что позволяет исследовать AVN; особенно в их анатомии и взаимодействиях с окружающими рабочими клетками миокарда и немиоцитарными клетками.
Introduction
Аритмии являются распространенными заболеваниями, поражающими миллионы людей, и являются причиной значительной заболеваемости и смертности во всем мире. Несмотря на огромные успехи в лечении и профилактике, такие как разработка кардиостимуляторов, лечение аритмий остается сложным, в первую очередь из-за очень ограниченных знаний о механизмах основного заболевания 1,2,3. Лучшее понимание как нормальной электрофизиологии, так и патофизиологии аритмий может помочь разработать новые, инновационные и причинно-следственные стратегии лечения в будущем. Кроме того, для всестороннего изучения аритмогенеза важно локализовать и визуализировать конкретную систему сердечной проводимости на животных моделях, таких как мыши, поскольку мыши широко используются в электрофизиологических исследованиях.
Основными частями системы сердечной проводимости являются синоатриальный узел (SAN), где электрический импульс генерируется в специализированных клетках кардиостимулятора, и атриовентрикулярный узел (AVN), который является единственным электрическим соединением между предсердиями и желудочками4. Всякий раз, когда электрофизиологические свойства SAN и AVN изменяются, могут возникать аритмии, такие как синдром больного синуса или атриовентрикулярная блокада, которые могут привести к ухудшению гемодинамики, обмороку и даже смерти, и, таким образом, подчеркнуть существенную роль как SAN, так и AVN в электрофизиологии и аритмогенезе5.
Комплексные исследования SAN или AVN требуют точной локализации и визуализации обеих структур, в идеале в их физиологической среде. Однако из-за их небольших размеров и расположения в пределах рабочего миокарда, без установления четкой макроскопически видимой структуры, изучение анатомии и электрофизиологии SAN и AVN является сложной задачей. Анатомические ориентиры могут быть использованы для приблизительной идентификации области, содержащей SAN и AVN 6,7,8. Короче говоря, SAN расположен в межкавалевой области правого предсердия, прилегающей к мышечной crista terminalis (CT), AVN расположен в треугольнике Коха, установленном трикуспидальным клапаном, остиумом коронарного синуса и сухожилием Тодаро. До сих пор эти анатомические ориентиры в основном использовались для локализации, удаления, а затем изучения SAN и AVN как отдельных структур (например, с помощью обычной гистологии). Однако для лучшего понимания сложной электрофизиологии SAN и AVN (например, регуляторных эффектов соседних клеток рабочего миокарда) необходимо изучение проводящих систем в физиологической 3D-среде.
Полноуровневое иммунофлуоресцентное окрашивание представляет собой метод, который используется для изучения анатомических структур in situ при сохранении целостности окружающих тканей9. Используя преимущества конфокальной микроскопии и программного обеспечения для анализа изображений, SAN и AVN могут быть визуализированы с флуоресцентно мечеными антителами, нацеленными на ионные каналы, специально выраженные в этих областях.
Этот следующий протокол объясняет необходимые шаги для выполнения хорошо зарекомендовавшего себя метода окрашивания цельным креплением для локализации и визуализации микроскопов SAN и AVN. В частности, этот протокол описывает, как (1) локализовать SAN и AVN анатомическими ориентирами для подготовки этих образцов к окрашиванию и микроскопическому анализу (2) выполнить полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание эталонных маркеров HCN4 и Cx43 (3) для подготовки образцов SAN и AVN для конфокальной микроскопии (4) для выполнения конфокальной визуализации SAN и AVN. Мы также описываем, как этот протокол может быть модифицирован, чтобы включить дополнительное окрашивание окружающего рабочего миокарда или немиоцитарных клеток, таких как автономные нервные волокна, что позволяет тщательно исследовать систему сердечной проводимости в сердце.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за животными и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными и этике Мюнхенского университета, а все процедуры, проводимые на мышах, были одобрены правительством Баварии, Мюнхен, Германия (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Мыши C57BL6/J были приобретены в лаборатории Джексона.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показаны инструменты, необходимые для эксперимента. На рисунке 2 показана иллюстрация грубой анатомии сердца. На рисунке 3 показано расположение SAN и AVN в сердце взрослой мыши. На рисунке 4 показан подготовленный образец, загруженный на конфокальную микроскопию.
1. Препараты
- Готовят 4% раствор формальдегида (4% PFA) путем разбавления 10 мл 16% раствора формальдегида в 30 мл PBS.
- Готовят 15% раствор сахарозы и 30% раствор сахарозы, растворяя 15 г и 30 г порошка сахарозы в 100 мл PBS соответственно. После того, как порошок сахарозы полностью растворен, процедите раствор с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм перед хранением при 4 °C.
- Приготовьте 3%-4% агарозный гель, добавьте 3 г или 4 г порошка агарозы и 100 мл 1x TAE (разбавленного из 50x TAE стокового раствора) в стакан. Поместите стакан на магнитную мешалку и кипятите до полного растворения агарозы.
- Приготовить форму для рассечения, аккуратно влив 30 мл агарозного геля (3%-4%) в чашку Петри диаметром 100 мм. Оставьте чашку Петри на скамейке при комнатной температуре, чтобы она остыла и затвердела.
- Готовят блокирующий раствор и моющий раствор по рецептам, приведенным в таблице 1. Подготовьте все растворы, приготовленные в день использования. Длительное хранение не рекомендуется.
- Подготовьте растворы антител, разбавляя их в холодном (4 °C) 1x PBS, защитите разбавление от света (например, обернув алюминиевую фольгу вокруг) и держите разведения на льду до использования. Разбавляют антитела незадолго до инкубации. Избегайте оставления разбавленных антител при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующее разведение антител должно быть протестировано с сопоставимыми образцами тканей путем выполнения обычного иммунофлуоресцентного окрашивания. Здесь мы проверили антитела, окрашивая замороженные участки, разрезанные толщиной 10 мкм.
2. Извлечение органов и подготовка тканей
- Обезболивают мышь, помещая ее в инкубационную камеру, подключенную к испарителюру изофлурана. Установите испаритель для подачи 4-5% изофлурана (96-95% кислорода соответственно).
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная анестезия подтверждается потерей постуральной реакции и корректирующего рефлекса путем осторожного перекатывания камеры до тех пор, пока мышь не будет помещена на спину. - Поставьте мышь в лежачее положение на хирургическом столе. Поместите нос мыши в анестезиологическую маску, соединенную с модифицированной цепью Bain с внутренней трубкой, соединенной с испарителем изофлурана. Для поддержания анестезии используют 1-2% изофлуран в кислороде со скоростью потока 1 л/мин. Удалите лишние пары анестетика от мыши через внешнюю трубку маски и вытяните через канистру активированного угля, который поглощает избыток анестезирующего газа.
- При достижении полной анестезии вводят фентанил для обезболивания (0,1 μг/25 г массы тела в/.).
- Когда рефлекс защемления пальца ноги не обнаруживается, сделайте четкий разрез от югула до симфиза, используя ножницы для радужной оболочки для удаления меха и кожи. Сделайте еще один разрез слева направо под ребрами, используя ножницы радужной оболочки, чтобы осторожно открыть живот.
- Оживить меченого немного с помощью изогнутых щипцов, позволяющих разрезать диафрагму слева направо, не травмируя никаких органов. Разрежьте грудную клетку медиальной подмышечной линией с обеих сторон, используя ножницы для радужной оболочки глаза, чтобы перевернуть ее краниально и обеспечить доступ к сердцу.
- Разрезать нижнюю полую вену и нисходящую грудную аорту на уровне диафрагмы с помощью ножниц радужной оболочки. Проколите сердце иглой 27 G в области вершины, а затем осторожно протолкните иглу в левый желудочек (LV). Осторожно введите 5-10 мл ледяного PBS в LV для перфузии сердца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет сердца должен превратиться из красного в серый, что указывает на успешную перфузию PBS. - Осторожно поднимите верхушку сердца с помощью пинцета, позволяющего перерезать крупные сосуды и удалить сердце.
- Иссекайте сердце, разрезая крупные артерии и вены как можно дальше от сердца, чтобы избежать любого повреждения верхней полой вены (SVC). Сохраните SVC, так как он будет служить важным ориентиром во время последующей обработки.
- После удаления сердца выключите испаритель изофлурана.
- Поместите сердце в тарелку для рассечения, наполненную ледяным холодом PBS под рассекающим микроскопом. После определения левой/правой и передней/задней части сердца поверните сердце передней частью сердца на дне тарелки (обнажите крупные сосуды, расположенные сзади).
- Обездвижить сердце, вставив маленькую зажимку верхушки и придатка левого предсердия (LAA) в агарозу в нижней части тарелки для рассечения (рисунок 2A). Используя тонкий пинцет и ножницы, осторожно удалите несердечную ткань вокруг SVC и нижней полой вены (IVC) (например, легкие, жир, перикард), чтобы обнажить межкаваловую область (рисунок 3A).
- Удалите большинство желудочков, разрезав параллельно канавку между желудочками и предсердиями с помощью микроножек. Сохранить небольшую часть желудочковой ткани для последующей нагрузки на оргстекловое кольцо.
- Для фиксации и обезвоживания поместите образец (содержащий предсердия, SVC и IVC) в 4% PFA на ночь при 4 °C.
- На следующий день переводят сердце на 15% раствор сахарозы в течение 24 часов при 4 °C.
- На следующий день переводят сердце на 30% раствор сахарозы в течение 24 часов при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиксации и обезвоживания на этапах 2.13, 2.14 и 2.15 образцы оставляют при 4°С без дальнейшего перемешивания или раскачивания.
3. Полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание
- Промыть сердце в 1% Тритоне Х-100, разведенном в PBS и блокировать и пермеабилизировать в блокирующем растворе (таблица 1) на ночь при 4 °C.
- Поместите сердце в пробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте с антимышевым коннексином-43 кролика (разведение 1:200) и крысиным антимышевым HCN4 (разведение 1:200) антителами, разбавленными блокирующим раствором в течение 7 дней при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация первичных антител должна быть проверена перед использованием технических описаний в качестве ориентира. Другие антигены, представляющие интерес, также могут быть окрашены на этом этапе, если вид хозяина первичного антигена отличается от других. Более высокая концентрация тритона X-100 может помочь получить более эффективное окрашивание антителами, как это было продемонстрировано до10, но концентрация может быть определена индивидуально. - Через 7 дней удаляют раствор, содержащий первичные антитела, с помощью пипетки и промывают сердце 1%-ным раствором Тритона Х-100 3 раза (каждый раз в течение 1 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере).
- После промывания инкубируйте сердце = с Alexa Fluor 488 козьим анти-крысиным IgG (разведение 1:200) и Alexa Fluor 647 козьим анти-кроликом IgG (разведение 1:200) в течение 7 дней при 4 °C.
- Через 7 дней удалите весь раствор, содержащий вторичные антитела, с помощью пипетки. Затем промыть сердце с помощью промывочного раствора (табл. 1) 3 раза (каждый раз в течение 1 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере).
- Для окрашивания ядер инкубируют сердце в растворе DAPI (10 мкг/мл) в течение ночи при 4 °C.
- На следующий день промыть сердце моющим раствором 3 раза (каждый раз в течение 1 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для блокирования, пермеабилизации, инкубации антител и окрашивания DAPI на этапах 3.1, 3.2, 3.4 и 3.6 оставьте образцы в установившемся состоянии при температуре 4°C, перемешивание не требуется. Окрашенная ткань может быть сохранена полностью покрыта моющим раствором при 4 °C и защищена от света в течение нескольких дней до визуализации в конфокальном микроскопе.
4. Конфокальная микроскопия
- Подготовьте кольца из оргстекла и заполните пластилином (рисунок 1). В центре пластилина образуется небольшая канавка для нагрузки на сердце. Сделайте неглубокую канавку, так как для этого было бы легче получить плоскую плоскость визуализации, а также отрегулировать пространство и избежать пузырьков воздуха между образцом и крышками на этапе 4.4.
- Используйте один и тот же образец сердца для визуализации как SAN, так и AVN последовательно. Для визуализации SAN непосредственно нагружайте сердце, тогда как для визуализации AVN выполняйте микродиссекцию раньше.
- Создание образов SAN
- Идентифицируют SAN по анатомическим ориентирам: он расположен на спинной стороне сердца в пределах межкавалесной области (область между верхней и нижней полой веной). Crista terminalis (CT) - это мышечная полоса между SAN и RAA.
- Поместите сердце в пластилиновую бороздку спинкой сердца вверх. Добавьте PBS на сердце, чтобы вытеснить весь воздух в полости, пока сердце не будет полностью покрыто PBS (обычно достаточно нескольких капель PBS).
- Под рассеченным микроскопом осторожно вдавите RAA, LAA и оставшиеся части левого желудочка в пластилин, чтобы зафиксировать сердце. Убедитесь, что вся межкваковая область и crista terminalis хорошо видны (не покрыты пластилином). Область, которая будет изображена, показана на рисунке 3A.
- AvN-визуализация
- После завершения визуализации SAN вспомните тот же образец и впоследствии используйте для визуализации AVN. Для микродиссекции AVN поместите сердце = на диссекционную чашку под рассеченным микроскопом.
- Ориентируйте сердце правой стороной вверх (включая оставшиеся части правого желудочка). Пропустите штифты через оставшуюся часть свободной стенки LV (которая теперь находится внизу), чтобы обездвижить ткань (рисунок 2B).
- Отрежьте оставшуюся свободную стенку RV вверх через трикуспидальный клапан и верхнюю полую вену. Затем отбросьте RV и RA, чтобы обнажить межжелудочковую и межатриальную перегородку. (Рисунок 3B)
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на то, чтобы не повредить коронарный синус (CS), так как это важный анатомический ориентир, чтобы найти треугольник Коха, который затем позволяет локализовать AVN. CS проходит поперечно в левой атриовентрикулярной бороздке на задней стороне сердца, а отверстие отверстия CS расположено между IVC и трехстворчатым клапаном в нижней части межпредсердной перегородки (рисунок 3A и B). - Определите треугольник Коха, который можно найти на эндокардиальной поверхности правого предсердия, окаймленный спереди шарнирной линией перегородчатого листка трикуспидального клапана (ТВ), а сзади сухожилием Тодаро. Основание образовано отверстием коронарного синуса (рисунок 3В). Поскольку это целевая область для визуализации AVN, она должна быть четко видна.
- Переместите сердце в пластилиновую канавку внутри плексигласового кольца с треугольником Коха, четко обнаженным (т.е. не покрытым пластилином). Осторожно вдавите ткань вокруг треугольника Коха в пластилин, чтобы зафиксировать образец. Добавьте PBS на сердце, чтобы вытеснить весь воздух в полости, пока сердце не будет полностью покрыто PBS (обычно достаточно нескольких капель PBS).
- Создание образов SAN
- Нанесите силикон на края колец из оргстекла, чтобы можно было покрыть сердца, загруженные в заполненные пластилином кольца из плексигласа, крышками.
- Осторожно надавите на заднюю сторону пластилина, чтобы выдавить части PBS и прикрепить сердце к крышке, избегая при этом пузырьков воздуха в области визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что интересующие области не сложены и закрыты во время нажатия на заднюю сторону пластилина. Плоская плоскость визуализации без избыточного сжатия образца необходима для сохранения анатомии и для правильной конфокальной визуализации образцов. Для SAN важно убедиться, что межкавалическая область четко открыта. Для AVN треугольник Коха должен быть полностью открыт. - Поместите образцы окрашивания всего крепления вверх ногами на платформу конфокального микроскопа. Открытый SAN/AVN, прикрепленный к крышке, теперь находится на нижней части платформы микроскопа (рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения снимков мы используем Carl Zeiss LSM800 с airyscan Unit и программным обеспечением ZEN 2.3 SP1 черного цвета. - Выбирайте пластину "BP420-480 + LP605" для возбуждения Alexa Fluor 647 конъюгированного анти-HCN4. Варьируйте коэффициент усиления мастера от 650-750.
- Сделайте обзорное изображение всей области SAN и AVN с помощью функции сканирования плитки . Затем выберите HCN4-положительную область, щелкнув и добавив квадрат на обзорное изображение вокруг интересующей области, которая будет сканироваться.
- Проверьте параметры, включая пластины и коэффициент усиления для остальных каналов (Alexa Fluor 488 и DAPI) конфокального микроскопа и установите, как описано в шаге 4.6.
- Медленно настройте фокус сверху вниз образца, чтобы просмотреть весь образец и установить Первый и Последний для диапазона Z-стека. Установите оптимальный интервал для Z-стека на основе толщины оптического образца. Мы используем объектив 20x и 0,8-1 мкм в качестве интервала для Z-стека.
- После того, как все параметры правильно установлены, просканируйте всю область SAN и AVN.
- Выполняйте 3D-реконструкцию изображений с помощью программного обеспечения (например, Imaris версии 8.4.2).
- Выберите обработку изображений | Базовое вычитание для удаления фонового окрашивания.
- Выберите создание поверхности в настройках для выбранного канала и области, представляющей интерес для обработки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя протокол, описанный выше, можно надежно выполнить конфокальную микроскопическую визуализацию как SAN, так и AVN. Специфическое окрашивание проводящей системы с использованием флуоресцентных антител, нацеленных на HCN4, и окрашивание рабочего миокарда с использованием флуоресцентных антител, нацеленных на Cx43, позволяет четко идентифицировать SAN (Рисунок 5, Видео 1) и AVN (Рисунок 6, Видео 2) в пределах интактной анатомии.
Рисунок 1: Инструменты для рассечения и держатель кольца из оргстекла. А. Кольцо из оргстекла заполнено пластилином (красной стрелкой показана канавка, образованная в центре для загрузки сердца). Б. Рассечение чашки Петри с агарозным гелем. С. Весенние ножницы. Д. Ножницы для радужной оболочки глаза. Е. Изогнутые щипцы. F. Тонкие щипцы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Иллюстрация грубой анатомии сердца. А. Схематическая иллюстрация микродиссекции SAN. Штифты наносятся через верхушку и придаток левого предсердия (LAA). SAN обозначается красным пунктирным кругом. В. Схематическая иллюстрация микродиссекции AVN. Штифты проходят через оставшуюся часть свободной стенки LV (которая теперь находится внизу). AVN обозначается красным пунктирным кругом. SVC, Верхняя полая вена; IVC, нижняя полая вена; КС, коронарный синус; LAA, придаток левого предсердия; RAA, придаток правого предсердия; ПА, легочная артерия; ПВ, легочная вена; ЛЖ, левый желудочек; ИВС, межжелудочковая перегородка; ИАС, межпредсердная перегородка; ОФ, овальная ямка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Расположение SAN и AVN в сердце взрослой мыши. А. Расположение синоатриального узла (SAN) в сердце взрослой мыши. Вид с задней части сердца. Местоположение SAN обозначается красной пунктирной линией в межколесной области (черные пунктирные линии). SVC, Верхняя полая вена; IVC, нижняя полая вена; КС, коронарный синус; LAA, придаток левого предсердия; RAA, придаток правого предсердия; ПВ, легочная вена; КТ, Криста терминалис; ЛЖ, левый желудочек; RV, правый желудочек. В. Расположение атриовентрикулярного узла (AVN) в сердце взрослой мыши. Вид справа. AVN (красный пунктирный круг) расположен на вершине треугольника Коха (белый пунктирный треугольник) у дна перепончатой перегородки. Треугольник Коха образован сухожилием Тодаро (TT, зеленая пунктирная линия), трехстворчатым клапаном (TV, синяя пунктирная линия) и отверстием коронарного синуса (CS, желтая пунктирная линия). SVC, верхняя полая вена; IVC, нижняя полая вена; ИВС, межжелудочковая перегородка; ОФ, овальная ямка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Подготовленный образец, загруженный на конфокальную микроскопию. А. Подготовленный образец (красная стрелка) для конфокальной микроскопии вмонтирован в кольцо из оргстекла с пластилином (черная стрелка). Вид снизу. В. Кольцо из оргстекла с установленным образцом, загруженным вверх-ногами на платформу конфокального микроскопа (обратного микроскопа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Реконструкция конфокальной микроскопической визуализации SAN у мыши C57BL6/J, окрашенной антителами против HCN4 (красный) и Cx43 (белый). A. Пунктирная область очерчивает SAN, которая ориентирована вдоль межколесной области между верхней и нижней полой веной. В. Увеличение инкрустации от панели A.C. 3D реконструкция панели Б. РАА, придатка правого предсердия; РА, правое предсердие; SAN, синоатриальный узел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6. Реконструкция конфокальной микроскопической визуализации AVN у мыши C57BL6/J, окрашенной антителами против HCN4 (красный) и Cx43 (белый). A. Пунктирная область указывает на AVN. B. Увеличение инкрустации с панели A. C. 3D реконструкция панели B. IVS, межжелудочковой перегородки; ИАС, межпредсердная перегородка; AVN, атриовентрикулярный узел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7. Отрицательное контрольное изображение. A. отрицательный контроль окрашивания всего крепления для SAN. Пунктирный круг показывал область SAN, подтвержденную анатомическими ориентирами. В. отрицательное контрольное окрашивание для SAN только вторыми антителами. С. Окрашивание DAPI для SAN. D. отрицательный контроль окрашивания цельным креплением для AVN. Пунктирный круг показывал область AVN, подтвержденную анатомическими ориентирами. E. отрицательное контрольное окрашивание для AVN только вторыми антителами. Ф. Окрашивание DAPI для AVN. RAA, придатка правого предсердия; РА, правое предсердие; SVC, верхняя полая вена; ИВС, межжелудочковая перегородка; ИАС, межпредсердная перегородка; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: 3D-реконструкция SAN Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: 3D-реконструкция AVN Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
| Соединение | Конечная концентрация | требуется г или мл/100 мл | |
| Решение для фиксации | |||
| Формальдегид (16%) | 4% | 25 мл | |
| ПБС (1x) | 75 мл | ||
| 1% раствор Тритона | |||
| Тритон X100 | 1% | 1 мл | |
| ПБС | 99 мл | ||
| Блокирующее решение | |||
| Тритон Х-100 | 1% | 1 мл | |
| БСА | 0.50% | 0.5 г | |
| Обычная козья сыворотка | 20% | 20 мл | |
| ПБС (1x) | 89 мл | ||
| Моющий раствор | |||
| Анимация движения 20 | 0.10% | 0.1 мл | |
| БСА | 0.50% | 0.5 г | |
| ПБС (1x) | 99.9 мл | ||
| ТАЭ (50x) | |||
| Трис-база | 24.20% | 24.2 г | |
| 100% уксусная кислота | 5.71% | 5.71 мл | |
| 0,5 МЛН ЭДТА | 0.05 млн | 10 мл | |
| dH2O | Добавьте до 100 мл | ||
Таблица 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анатомия сердца традиционно изучается с использованием тонких гистологических срезов11. Однако эти методы не сохраняют трехмерную структуру проводящей системы и, таким образом, предоставляют только 2D-информацию. Описанный здесь протокол иммунофлуоресцентного окрашивания позволяет преодолеть эти ограничения и может регулярно использоваться для визуализации SAN и AVN.
По сравнению со стандартными методами, такими как традиционная иммуногистохимия, которые требуют встраивания парафина, сечения и извлечения антигена, методология whole-mount выгодна для рассмотрения точной 3D-локализации и морфологии SAN и AVN, а также для изучения отношений с окружающей тканью, поскольку морфология ткани значительно сохраняется только с минимальным обезвоживанием тканей и физическим разрывом. Кроме того, иммунореактивность (то есть связывание антител с тканевыми антигенами) также высоко поддерживается.
Мы разработали практический метод обработки образцов для конфокальной микроскопии с использованием пластикового кольцевого держателя, заполненного пластилином12,13. Пластилин идеален, так как его можно индивидуально подстраивать под размер ткани, ему достаточно тяжело надежно удерживать ткань без чрезмерного давления ткани. Самое главное, что он не флуоресцентный, избегая аутофлуоресцентного фона и, следовательно, не мешая флуоресцентному сигналу используемых антител.
Мы использовали конфокальный лазерно-сканирующий микроскоп (LSM-Zeiss) с детектором Airyscan, который может предложить явное преимущество в получении изображений с высоким качеством. Использование широкоугольного микроскопа может предложить только информацию на тканевом уровне, но не имеет клеточного разрешения. Кроме того, широкоугольный микроскоп несет риск высокого фона14. Используя детектор Airyscan для конфокального LSM, можно получить улучшенное разрешение и отношение сигнал/шум (SNR) по сравнению с традиционной конфокальной системой15 с одним точечным отверстием и детектором.
Формы и положение SAN и AVN представлены в виде 3D-реконструкции, а дополнительные виртуальные плоскости сечения, полученные из 3D-реконструкции, могут улучшить интерпретацию гистологических срезов, тогда как обычная гистология допускает только 2D-оценку анатомии с присущим риском необнаружения небольших, но релевантных структур. Кроме того, 3D-реконструкция дает возможность исследовать анатомические структуры, представляющие интерес трансмурально и в пределах интактной микросреды, например, внутренний вегетативный нервный комплекс, иннервирующий сердце16. Окрашивание и 3D-реконструкция позволяет исследовать клеточную среду, а также конкретные типы клеток и их ориентацию. Кроме того, региональная и клеточная специфическая экспрессия белка может быть визуализирована и может дополнительно поддерживать анализы вестерн-блоттинга и протеомики17.
SAN и AVN являются специализированными структурами в сердце с различной картиной экспрессии ионных каналов и коннексинов, которые могут быть использованы для надежной идентификации10,18. Гиперполяризационно-активированные циклические нуклеотидные катионные каналы (HCN) устанавливают диастолическую деполяризацию в клетках кардиостимулятора и, следовательно, специфически экспрессируются в проводящей системе, причем HCN4 является преобладающей изоформой у мыши19. Исследования показали, что HCN4 является одной из обнаруживаемых и стабильно экспрессируемых изоформ HCN во всех SAN и AVN 11,20. Коннексины напрямую соединяют соседние клетки и позволяют проходить ионам из клетки в клетку; поэтому они необходимы для проведения электрического импульса через сердце21. Паттерны экспрессии коннексина варьируются между различными областями сердца, причем Cx43 является наиболее распространенной изоформой, которая была обнаружена почти во всех частях сердца, за исключением SAN и AVN22. Сочетание микродиссекции для обеспечения экспозиции конкретных областей, представляющих интерес, антителами против HCN4 и CX43, а также подходы in silico для трехмерной реконструкции конфокальных изображений позволяют надежно идентифицировать SAN и AVN и всесторонне исследовать морфологию SAN/AVN, а также их взаимодействие с окружающими тканями.
SAN и AVN могут быть легко различимы после окрашивания специфическим антителом. Однако, чтобы локализовать SAN и AVN по их анатомическим ориентирам, необходима некоторая практика, прежде чем можно будет выполнить правильную микродиссекции.
Используя вышеуказанный протокол, также может быть применен ряд других антигенов. Протокол также хорошо работает как на перфузионно-фиксированной, так и на фиксированной погружением ткани. Тем не менее, время инкубации может быть скорректировано для оптимальной фиксации, поскольку некоторые антитела показывают пониженную иммунореактивность, когда антиген чрезмерно фиксирован. Поскольку для инкубации первичных и вторичных антител требуется 7 дней, важно полностью погрузить образцы в адекватные объемы растворов, содержащих антитела. Соотношение разведения каждого антитела должно быть проверено перед экспериментом. Для оптимального окрашивания любая неактуальная ткань должна быть удалена. Для протокола мы сохранили только небольшие части желудочков для лучшей ориентации и удаления всей окружающей жировой ткани и легочных вен, поскольку окружающая (нерелевантная) ткань также может связывать антитела, особенно когда целевые антигены экспрессируются глобально.
Окрашивание на месте, конфокальная визуализация и 3D-реконструкция являются бесценным и мощным методом для исследователей из различных областей. Однако метод также имеет некоторые ограничения. i) для этого требуется специализированное оборудование, такое, как конфокальный микроскоп, который обычно не имеется в каждом учреждении. ii) как упоминалось выше, микродиссекции специализированных анатомических структур, таких как SAN или AVN, а также конфокальная визуализация и поствизуальная обработка требуют интенсивного практикующего и опытного персонала. (iii) Успех метода в значительной степени зависит от качества используемых антител и поэтому может быть очень сложным в некоторых случаях. Кроме того, (iv) 3D-реконструкция может быть труднодостижимой и может потребовать интенсивного устранения неполадок для оптимизации процедуры. Например, оптимальные интервалы должны быть установлены во время получения изображения, поскольку участки, расположенные слишком далеко друг от друга, оставят пробелы и могут не позволить адекватную 3D-реконструкцию анатомии. Участки, которые находятся слишком близко, могут вызвать чрезмерную выборку и отбеливание из-за чрезмерного освещения и потребуют много времени для завершения одного изображения. Наконец, (v) основным ограничением конфокальной микроскопии является глубина визуализации, которая означает, что если толщина образца превышает максимальную рабочую глубину конфокального микроскопа, дальнейший флуорофор не может быть обнаружен.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Китайским стипендиальным советом (CSC, R. Xia), Немецким центром сердечно-сосудистых исследований (DZHK; 81X2600255 для S. Clauss, 81Z0600206 для S. Kääb), Фондом Короны (S199/10079/2019 для S. Clauss), SFB 914 (проект Z01 для H. Ishikawa-Ankerhold и S. Massberg и проект A10 для C. Schulz), ERA-NET по сердечно-сосудистым заболеваниям (ERA-CVD; 01KL1910 для S. Clauss) и Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (для S. Clauss). Спонсоры не играли никакой роли в подготовке рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglass ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |
References
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al.
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L.
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
- Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
Tags
Медицина Выпуск 166 Синоатриальный узел Атриовентрикулярный узел Кардиология Электрофизиология Система сердечной проводимости Микродиссекция Иммунофлуоресценция Конфокальная микроскопияErratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
