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Summary
Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung des Sinusknotens (SAN) und des atrioventrikulären Knotens (AVN) in murinen Herzen.
Abstract
Das elektrische Signal, das physiologisch von Schrittmacherzellen im Sinusknoten (SAN) erzeugt wird, wird durch das Reizleitungssystem geleitet, zu dem auch der atrioventrikuläre Knoten (AVN) gehört, um die Erregung und Kontraktion des gesamten Herzens zu ermöglichen. Jede Dysfunktion von SAN oder AVN führt zu Arrhythmien, was auf ihre grundlegende Rolle in der Elektrophysiologie und Arrhythmogenese hinweist. Mausmodelle werden häufig in der Arrhythmieforschung eingesetzt, aber die spezifische Untersuchung von SAN und AVN bleibt eine Herausforderung.
Das SAN befindet sich an der Kreuzung der Crista terminalis mit der oberen Hohlvene und AVN befindet sich an der Spitze des Koch-Dreiecks, das von der Öffnung des Koronarsinus, dem Trikuspidalring und der Sehne von Todaro gebildet wird. Aufgrund der geringen Größe bleibt die Visualisierung durch konventionelle Histologie jedoch eine Herausforderung und ermöglicht nicht die Untersuchung von SAN und AVN in ihrer 3D-Umgebung.
Hier beschreiben wir einen Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Ansatz, der die lokale Visualisierung von markierten Maus-SAN und AVN ermöglicht. Die Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Färbung ist für kleinere Gewebeabschnitte vorgesehen, ohne dass ein manuelles Schneiden erforderlich ist. Zu diesem Zweck wird das Mausherz präpariert, unerwünschtes Gewebe entfernt, gefolgt von Fixierung, Permeabilisierung und Blockierung. Zellen des Leitungssystems innerhalb von SAN und AVN werden dann mit einem Anti-HCN4-Antikörper gefärbt. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie und Bildverarbeitung ermöglichen die Differenzierung zwischen Knotenzellen und arbeitenden Kardiomyozyten sowie die eindeutige Lokalisierung von SAN und AVN. Darüber hinaus können zusätzliche Antikörper kombiniert werden, um auch andere Zelltypen, wie z.B. Nervenfasern, zu markieren.
Im Vergleich zur konventionellen Immunhistologie bewahrt die Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung die anatomische Integrität des Herzleitungssystems und ermöglicht so die Untersuchung von AVN; Dies gilt insbesondere für ihre Anatomie und die Wechselwirkungen mit den umgebenden Myokard- und Nicht-Myozytenzellen.
Introduction
Arrhythmien sind häufige Erkrankungen, von denen Millionen von Menschen betroffen sind, und sie sind weltweit die Ursache für eine signifikante Morbidität und Mortalität. Trotz enormer Fortschritte in der Behandlung und Prävention, wie z.B. der Entwicklung von Herzschrittmachern, bleibt die Behandlung von Herzrhythmusstörungen eine Herausforderung, vor allem aufgrund des sehr begrenzten Wissens über die zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen 1,2,3. Ein besseres Verständnis sowohl der normalen Elektrophysiologie als auch der Pathophysiologie von Arrhythmien könnte helfen, in Zukunft neuartige, innovative und kausale Behandlungsstrategien zu entwickeln. Um die Arrhythmogenese umfassend zu untersuchen, ist es außerdem wichtig, das spezifische Herzleitungssystem in Tiermodellen wie der Maus zu lokalisieren und zu visualisieren, da Mäuse in der elektrophysiologischen Forschung weit verbreitet sind.
Die Hauptbestandteile des Herzleitungssystems sind der Sinusknoten (SAN), in dem der elektrische Impuls in spezialisierten Schrittmacherzellen erzeugt wird, und der atrioventrikuläre Knoten (AVN), der die einzige elektrische Verbindung zwischen den Vorhöfen und den Ventrikeln darstellt4. Wann immer die elektrophysiologischen Eigenschaften von SAN und AVN verändert werden, können Arrhythmien wie das Sick-Sinus-Syndrom oder die atrioventrikuläre Blockade auftreten, die zu einer hämodynamischen Verschlechterung, Synkope und sogar zum Tod führen können und somit die wesentliche Rolle von SAN und AVN in der Elektrophysiologie und Arrhythmogenese unterstreichen5.
Umfassende Untersuchungen zu SAN oder AVN erfordern eine präzise Lokalisierung und Visualisierung beider Strukturen, idealerweise innerhalb ihrer physiologischen Umgebung. Aufgrund ihrer geringen Größe und Lage innerhalb des Arbeitsmyokards, ohne eine klare, makroskopisch sichtbare Struktur zu etablieren, ist es jedoch schwierig, die Anatomie und Elektrophysiologie von SAN und AVN zu untersuchen. Anatomische Landmarken können verwendet werden, um die Region, die SAN und AVN 6,7,8 enthält, grob zu identifizieren. Kurz gesagt, SAN befindet sich in der Kavallregion des rechten Vorhofs neben der Muskulatur Crista terminalis (CT), AVN befindet sich innerhalb des Dreiecks von Koch, das durch die Trikuspidalklappe, das Ostium der Koronarhöhle und die Sehne von Todaro gebildet wird. Bisher wurden diese anatomischen Orientierungspunkte hauptsächlich verwendet, um SAN und AVN als einzelne Strukturen zu lokalisieren, zu entfernen und dann zu untersuchen (z.B. durch konventionelle Histologie). Um die komplexe Elektrophysiologie von SAN und AVN besser zu verstehen (z.B. regulatorische Effekte benachbarter Zellen des arbeitenden Myokards), ist es jedoch notwendig, die Leitungssysteme innerhalb der physiologischen 3D-Umgebung zu untersuchen.
Die Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung ist eine Methode, die verwendet wird, um anatomische Strukturen in situ zu untersuchen und gleichzeitig die Integrität des umgebenden Gewebes zu erhalten9. Mit Hilfe von konfokaler Mikroskopie und Bildanalysesoftware können SAN und AVN mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern visualisiert werden, die auf Ionenkanäle abzielen, die spezifisch in diesen Regionen exprimiert werden.
In diesem Protokoll werden die notwendigen Schritte erläutert, um eine etablierte Whole-Mount-Färbemethode für die Lokalisierung und Visualisierung von SAN- und AVN-Mikroskopen durchzuführen. Insbesondere beschreibt dieses Protokoll, wie (1) SAN und AVN durch anatomische Orientierungspunkte lokalisiert werden, um diese Proben für die Färbung und Mikroskopieanalyse vorzubereiten, (2) eine Immunfluoreszenzfärbung der Referenzmarker HCN4 und Cx43 durchzuführen (3) SAN- und AVN-Proben für die konfokale Mikroskopie vorzubereiten (4) eine konfokale Bildgebung von SAN und AVN durchzuführen. Wir beschreiben auch, wie dieses Protokoll modifiziert werden kann, um eine zusätzliche Färbung von umgebenden Myokard- oder Nicht-Myozytenzellen wie autonomen Nervenfasern einzuschließen, was eine gründliche Untersuchung des Herzleitungssystems im Herzen ermöglicht.
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Protocol
Die Tierpflege und alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierschutz- und Ethikkommission der Universität München durchgeführt, und alle an Mäusen durchgeführten Verfahren wurden von der Bayerischen Staatsregierung, München, Deutschland genehmigt (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft.
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die für das Experiment benötigten Instrumente. Abbildung 2 zeigt eine Darstellung der groben Herzanatomie. Abbildung 3 zeigt die Position von SAN und AVN in einem erwachsenen Mausherz. Abbildung 4 zeigt die vorbereitete Probe, die auf die konfokale Mikroskopie geladen wurde.
1. Vorbereitungen
- Bereiten Sie eine 4%ige Formaldehydlösung (4% PFA) vor, indem Sie 10 ml 16%ige Formaldehydlösung in 30 mL PBS verdünnen.
- Bereiten Sie eine 15%ige Saccharoselösung und eine 30%ige Saccharoselösung vor, indem Sie 15 g bzw. 30 g Saccharosepulver in 100 ml PBS auflösen. Nachdem sich das Saccharosepulver vollständig aufgelöst hat, wird die Lösung vor der Lagerung bei 4 °C mit einem 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter filtriert.
- Bereiten Sie ein 3%-4% Agarose-Gel vor, geben Sie 3 g oder 4 g Agarosepulver und 100 ml 1x TAE (verdünnt aus 50x TAE-Stammlösung) in ein Becherglas. Stellen Sie das Becherglas auf einen Magnetrührer und kochen Sie es, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat.
- Bereiten Sie die Sezierschale vor, indem Sie vorsichtig 30 ml Agarosegel (3%-4%) in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 100 mm gießen. Lassen Sie die Petrischale bei Raumtemperatur auf der Bank abkühlen und aushärten.
- Bereiten Sie Blocklösung und Waschlösung nach den in Tabelle 1 angegebenen Rezepten vor. Bereiten Sie alle Lösungen vor, die am Tag der Anwendung vorbereitet wurden. Eine Langzeitlagerung wird nicht empfohlen.
- Bereiten Sie die Antikörperlösungen vor, indem Sie sie 1x PBS in kalter (4 °C) verdünnen, die Verdünnung vor Licht schützen (z. B. durch Umwickeln von Aluminiumfolie) und die Verdünnungen bis zur Verwendung auf Eis halten. Verdünnen Sie die Antikörper kurz vor der Inkubation. Vermeiden Sie es, die verdünnten Antikörper bei Raumtemperatur zu belassen.
HINWEIS: Die geeignete Antikörperverdünnung sollte mit vergleichbaren Gewebeproben durch eine konventionelle Immunfluoreszenzfärbung getestet werden. Hier haben wir die Antikörper getestet, indem wir gefrorene Abschnitte mit einer Dicke von 10 μm gefärbt haben.
2. Organentnahme und Gewebepräparation
- Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie in eine Inkubationskammer legen, die mit einem Isofluran-Verdampfer verbunden ist. Stellen Sie den Vaporizer so ein, dass er 4-5% Isofluran (96-95% Sauerstoff) liefert.
HINWEIS: Eine Vollnarkose wird durch den Verlust der Haltungsreaktion und des Aufrichtungsreflexes bestätigt, indem die Kammer vorsichtig gerollt wird, bis die Maus auf den Rücken gelegt wird. - Legen Sie die Maus in Rückenlage auf den OP-Tisch. Stecken Sie die Mausnase in eine Anästhesiemaske, die mit einem modifizierten Bain-Kreislauf verbunden ist, wobei der innere Schlauch mit dem Isofluran-Verdampfer verbunden ist. Um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, verwenden Sie 1-2% Isofluran in Sauerstoff bei einer Flussrate von 1 l / min. Entfernen Sie überschüssigen Anästhesiedampf von der Maus über den äußeren Schlauch der Maske und ziehen Sie durch einen Kanister Aktivkohle, der das überschüssige Anästhesiegas absorbiert.
- Wenn eine Vollnarkose erreicht ist, injizieren Sie Fentanyl zur Analgesie (0,1 μg / 25 g Körpergewicht i.p.).
- Wenn der Zehenklemmreflex nicht nachweisbar ist, machen Sie mit einer Irisschere einen deutlichen Schnitt vom Jugulum zur Symphyse, um Fell und Haut zu entfernen. Machen Sie einen weiteren Schnitt von links nach rechts unter den Rippen mit einer Irisschere, um den Bauch vorsichtig zu öffnen.
- Leben Sie das Xiphoid ein wenig mit einer gekrümmten Pinzette, um das Zwerchfell von links nach rechts schneiden zu können, ohne Organe zu verletzen. Schneiden Sie den Brustkorb in einer medialen Achsellinie auf beiden Seiten mit einer Irisschere, um ihn in den Schädel zu drehen und den Zugang zum Herzen zu ermöglichen.
- Schneiden Sie die Vena cava inferior und die absteigende thorakale Aorta mit einer Irisschere auf Höhe des Zwerchfells ab. Punktieren Sie das Herz mit einer 27 G Nadel im Bereich der Spitze und schieben Sie dann die Nadel vorsichtig in die linke Herzkammer (LV). Injizieren Sie vorsichtig 5-10 ml eiskaltes PBS in den LV, um das Herz zu durchbluten.
HINWEIS: Die Farbe des Herzens sollte sich von Rot zu Grau verfärben, was auf eine erfolgreiche Durchblutung mit PBS hinweist. - Heben Sie vorsichtig die Spitze des Herzens mit einer Pinzette an, um die großen Gefäße zu schneiden und das Herz zu entfernen.
- Schneiden Sie das Herz aus, indem Sie die großen Arterien und Venen so weit wie möglich vom Herzen wegschneiden, um eine Schädigung der oberen Hohlvene (SVC) zu vermeiden. Bewahren Sie das SVC auf, da es bei der späteren Verarbeitung als wichtiger Meilenstein dient.
- Schalten Sie nach der Entfernung des Herzens den Isofluran-Vaporizer aus.
- Legen Sie das Herz unter dem Präpariermikroskop in eine mit eiskaltem PBS gefüllte Sezierschale. Nach der Bestimmung der linken / rechten und der Vorder- / Rückseite des Herzens drehen Sie das Herz mit der Vorderseite des Herzens am Boden der Schale um (um die großen Gefäße freizulegen, die sich hinten befinden).
- Immobilisieren Sie das Herz, indem Sie kleine Nadeln durch die Spitze und das linke Vorhofohr (LAA) in die Agarose am Boden der Sezierschale einführen (Abbildung 2A). Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette und einer Schere vorsichtig nicht-kardiales Gewebe um die SVC und die Vena cava inferior (IVC) (z. B. Lunge, Fett, Perikard), um die Kavallzone freizulegen (Abbildung 3A).
- Entfernen Sie den Großteil der Ventrikel, indem Sie die Rille zwischen den Ventrikeln und den Vorhöfen mit der Mikroschere parallel schneiden. Bewahren Sie einen kleinen Teil des Ventrikelgewebes für die spätere Belastung des Plexiglasrings auf.
- Zur Fixierung und Dehydratisierung wird die Probe (mit den Vorhöfen, SVC und IVC) über Nacht bei 4 °C in 4 % PFA gegeben.
- Am nächsten Tag wird das Herz für 24 Stunden bei 4 °C auf 15%ige Saccharoselösung umgefüllt.
- Am nächsten Tag wird das Herz für 24 Stunden bei 4 °C auf 30%ige Saccharoselösung umgefüllt.
HINWEIS: Für die Fixierung und Dehydratisierung in Schritt 2.13, 2.14 und 2.15 werden die Proben bei 4 °C belassen, ohne dass sie weiter gerührt oder geschaukelt werden.
3. Immunfluoreszenz-Färbung im Ganzbett
- Das Herz wird in 1 % Triton X-100, verdünnt in PBS, gewaschen und über Nacht bei 4 °C blockiert und in Blocklösung (Tabelle 1) permeabilisiert.
- Das Herz wird in ein 1,5-ml-Röhrchen gegeben und mit Kaninchen-Anti-Maus-Antikörpern Connexin-43 (Verdünnung von 1:200) und Anti-Maus-HCN4-Antikörpern (Verdünnung von 1:200) an Ratten, verdünnt mit Blocklösung, 7 Tage lang bei 4 °C inkubiert.
HINWEIS: Die optimale Konzentration der primären Antikörper sollte getestet werden, bevor die Datenblätter als Orientierung verwendet werden. Andere Antigene von Interesse könnten in diesem Schritt ebenfalls angefärbt werden, solange sich die Wirtsspezies des primären Antigens von den anderen unterscheidet. Eine höhere Konzentration von Triton X-100 kann dazu beitragen, eine effizientere Antikörperfärbung zu erhalten, wie vor10 gezeigt, aber die Konzentration kann individuell bestimmt werden. - Entfernen Sie nach 7 Tagen die Lösung mit den primären Antikörpern mit einer Pipette und waschen Sie das Herz 3 Mal mit 1% Triton X-100-Lösung (jeweils 1 Stunde bei Raumtemperatur auf dem Orbitalschüttler).
- Nach dem Waschen das Herz = mit Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Ratten-IgG (Verdünnung von 1:200) und Alexa Fluor 647 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Verdünnung von 1:200) für 7 Tage bei 4 °C inkubieren.
- Entfernen Sie nach 7 Tagen die gesamte Lösung, die die sekundären Antikörper enthält, mit einer Pipette. Dann waschen Sie das Herz 3 Mal mit Waschlösung (Tabelle 1) (jeweils 1 h bei Raumtemperatur auf dem Orbitalschüttler).
- Um die Zellkerne zu färben, wird das Herz über Nacht bei 4 °C in DAPI-Lösung (10 μg/ml) inkubiert.
- Am nächsten Tag waschen Sie das Herz 3 Mal mit Waschlösung (jedes Mal für 1 h bei Raumtemperatur auf dem Orbitalschüttler).
ANMERKUNG: Für die Blockierung, Permeabilisierung, Antikörperinkubation und DAPI-Färbung in Schritt 3.1, 3.2, 3.4 und 3.6 lassen Sie die Proben im stationären Zustand bei 4 °C, kein Rühren ist erforderlich. Das gefärbte Gewebe konnte vollständig mit Waschlösung bei 4 °C konserviert und bis zur Bildgebung am Konfokalmikroskop einige Tage vor Licht geschützt werden.
4. Konfokale Mikroskopie
- Bereiten Sie die Plexiglasringe vor und füllen Sie sie mit Plastilin (Abbildung 1). In der Mitte des Plastilins bildet sich in der Mitte eine kleine Rille zur Belastung des Herzens. Machen Sie eine flache Rille, da dies einfacher wäre, eine flache Abbildungsebene zu erhalten, und passen Sie den Abstand an und vermeiden Sie Luftblasen zwischen der Probe und den Deckgläsern in Schritt 4.4.
- Verwenden Sie dieselbe Herzprobe für die sequenzielle Bildgebung von SAN und AVN. Bei der SAN-Bildgebung wird das Herz direkt belastet, während bei der AVN-Bildgebung zuvor eine Mikrodissektion durchgeführt werden muss.
- SAN-Imaging
- Identifizieren Sie das SAN anhand anatomischer Orientierungspunkte: Es befindet sich auf der dorsalen Seite des Herzens in der Intercaval-Region (der Region zwischen der oberen und unteren Hohlvene). Die Crista terminalis (CT) ist die Muskelsträhne zwischen SAN und RAA.
- Legen Sie das Herz mit der Rückseite des Herzens nach oben in die Plastilinnut. Fügen Sie PBS auf das Herz hinzu, um die gesamte Luft in der Höhle zu verdrängen, bis das Herz vollständig mit PBS bedeckt ist (normalerweise sind ein paar Tropfen PBS ausreichend).
- Drücken Sie unter dem Dissektionsmikroskop vorsichtig die RAA, LAA und die restlichen Teile des linken Ventrikels in das Plastilin, um das Herz zu fixieren. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Kavallzone und die Crista terminalis deutlich zu sehen sind (nicht von Plastilin bedeckt). Der Bereich, der abgebildet wird, ist in Abbildung 3A dargestellt.
- AVN-Bildgebung
- Nachdem Sie das Imaging von SAN abgeschlossen haben, entnehmen Sie das gleiche Sample und verwenden es anschließend für das AVN-Imaging. Für die AVN-Mikrodissektion legen Sie das Herz = auf eine Sezierschale unter dem Dissektionsmikroskop.
- Richten Sie das Herz mit der rechten Seite nach oben aus (einschließlich der restlichen Teile des rechten Ventrikels). Stecken Sie Stifte durch den verbleibenden Teil der LV-freien Wand (die sich jetzt unten befindet), um das Gewebe zu immobilisieren (Abbildung 2B).
- Schneiden Sie die verbleibende RV-freie Wand durch die Trikuspidalklappe und die obere Hohlvene nach oben. Dann drehen Sie das RV und RA weg, um interventrikuläres und interatriales Septum freizulegen. (Abbildung 3B)
HINWEIS: Achten Sie darauf, den Koronarsinus (CS) nicht zu beschädigen, da es ein wichtiger anatomischer Orientierungspunkt ist, um das Dreieck von Koch zu finden, das dann die Lokalisierung des AVN ermöglicht. Das CS verläuft quer in der linken atrioventrikulären Rinne auf der hinteren Seite des Herzens, und die CS-Öffnungsöffnung befindet sich zwischen IVC und der Trikuspidalklappe im unteren Teil des interatrialen Septums (Abbildung 3A und B). - Identifizieren Sie das Koch-Dreieck, das sich auf der endokardialen Oberfläche des rechten Vorhofs befindet, das vorn von der Scharnierlinie des Septumsegels der Trikuspidalklappe (TV) und posterior von der Sehne von Todaro begrenzt wird. Die Basis wird durch die Öffnung der Koronarhöhle gebildet (Abbildung 3B). Da dies die Zielregion für die AVN-Bildgebung ist, muss sie deutlich sichtbar sein.
- Übertragen Sie das Herz in die Plastilinnut innerhalb des Plexiglasrings, wobei das Koch-Dreieck deutlich freigelegt wird (d.h. nicht von Plastilin bedeckt ist). Drücken Sie das Gewebe um das Koch-Dreieck vorsichtig in das Plastilin, um die Probe zu fixieren. Fügen Sie PBS auf das Herz hinzu, um die gesamte Luft in der Höhle zu verdrängen, bis das Herz vollständig mit PBS bedeckt ist (normalerweise sind ein paar Tropfen PBS ausreichend).
- SAN-Imaging
- Tragen Sie Silikon auf die Kanten der Plexiglasringe auf, damit die Herzen, die in den mit Plastilin gefüllten Plexiglasringen geladen sind, mit Deckgläsern abgedeckt werden können.
- Drücken Sie vorsichtig auf die Rückseite des Plastilins, um Teile des PBS herauszudrücken und das Herz am Deckglas zu befestigen, während Sie Luftblasen im Bildbereich vermeiden.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die interessierenden Bereiche beim Drücken der Rückseite des Plastilins nicht gefaltet und verdeckt werden. Eine flache Bildgebungsebene ohne Überkompression der Probe ist notwendig, um die Anatomie zu erhalten und eine korrekte konfokale Bildgebung der Proben zu gewährleisten. Für SAN ist es wichtig, sicherzustellen, dass der Bereich zwischen den Kavals deutlich sichtbar ist. Für AVN sollte das Dreieck von Koch vollständig freigelegt werden. - Legen Sie die Färbeproben kopfüber auf die Plattform des konfokalen Mikroskops. Das exponierte SAN/AVN, das am Deckglas befestigt ist, befindet sich nun auf der Unterseite der Mikroskopplattform (Abbildung 4).
HINWEIS: Zum Fotografieren verwenden wir den Carl Zeiss LSM800 mit Airyscan Unit und der Software ZEN 2.3 SP1 schwarz. - Wählen Sie die Platte "BP420-480 + LP605" für die Anregung von Alexa Fluor 647 konjugiertem Anti-HCN4. Variieren Sie die Master-Verstärkung von 650-750.
- Erstellen Sie ein Übersichtsbild der gesamten SAN- und AVN-Region, indem Sie die Kachel-Scan-Funktion verwenden. Wählen Sie dann den HCN4-positiven Bereich aus, indem Sie auf das Übersichtsbild klicken und ein Quadrat um den zu scannenden Bereich hinzufügen.
- Überprüfen Sie die Parameter, einschließlich der Platten und der Hauptverstärkung für die verbleibenden Kanäle (Alexa Fluor 488 und DAPI) des konfokalen Mikroskops und stellen Sie sie wie in Schritt 4.6 beschrieben ein.
- Passen Sie den Fokus langsam vom oberen zum unteren Rand der Stichprobe an, um eine Vorschau der gesamten Stichprobe anzuzeigen und den ersten und letzten für den Z-Stapelbereich festzulegen. Legen Sie ein optimales Intervall für den Z-Stack fest, das auf der Dicke der optischen Probe basiert. Wir verwenden ein 20-faches Objektiv und 0,8-1 μm als Intervall für den Z-Stack.
- Nachdem alle Parameter richtig eingestellt sind, scannen Sie den gesamten Bereich des SAN und des AVN.
- Führen Sie eine 3D-Rekonstruktion der Bilder mit einer Software (z. B. Imaris Version 8.4.2) durch.
- Wählen Sie Bildverarbeitung | Basislinie Subtraktion , um Hintergrundflecken zu entfernen.
- Wählen Sie die Flächenerzeugung auf der Einstellung für den ausgewählten Kanal und den Bereich aus, der für die Verarbeitung von Interesse ist.
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Representative Results
Durch die Verwendung des oben beschriebenen Protokolls kann die konfokale Mikroskopie-Bildgebung sowohl von SAN als auch von AVN zuverlässig durchgeführt werden. Die spezifische Färbung des Leitungssystems mit fluoreszierenden Antikörpern, die auf HCN4 abzielen, und die Färbung des funktionierenden Myokards mit fluoreszierenden Antikörpern, die auf Cx43 abzielen, ermöglicht die eindeutige Identifizierung von SAN (Abbildung 5, Video 1) und AVN (Abbildung 6, Video 2) innerhalb der intakten Anatomie.
Abbildung 1: Instrumente zur Dissektion und Plexiglas-Ringhalter. A. Plexiglasring gefüllt mit Plastilin (roter Pfeil zeigt die Rille, die in der Mitte für die Belastung des Herzens gebildet wird). B. Zerlegen Sie Petrischale mit Agarose-Gel. C. Federschere. D. Iris-Schere. E. Gekrümmte Pinzette. F. Feine Pinzette. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Darstellung der groben Herzanatomie. A. Schematische Darstellung der SAN-Mikrodissektion. Stifte werden durch die Spitze und das linke Vorhofohr (LAA) angelegt. SAN wird durch einen rot gestrichelten Kreis angezeigt. Hrsg. Schematische Darstellung der AVN-Mikrodissektion. Die Stifte werden durch den verbleibenden Teil der LV-freien Wand (die sich jetzt unten befindet) gesteckt. AVN wird durch einen rot gestrichelten Kreis angezeigt. SVC, Vena cava superior; IVC, Vena cava inferior; CS, Koronarsinus; LAA, linkes Vorhofohr; RAA, rechtes Vorhofohr; PA, Lungenarterie; PV, Lungenvene; LV, linker Ventrikel; IVS, interventrikuläres Septum; IAS, interatriales Septum; OF, ovale Fossa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Position von SAN und AVN in einem erwachsenen Mausherz. Lokalisation des Sinusknotens (SAN) in einem erwachsenen Mausherz. Blick aus dem hinteren Teil des Herzens. Die Position des SAN wird durch eine rote gestrichelte Linie innerhalb des Kavalierungsbereichs (schwarz gestrichelte Linien) angezeigt. SVC, Vena cava superior; IVC, Vena cava inferior; CS, Koronarsinus; LAA, linkes Vorhofohr; RAA, rechtes Vorhofohr; PV, Lungenvene; CT, Crista terminalis; LV, linker Ventrikel; RV, rechter Ventrikel. Hrsg. Lokalisation des atrioventrikulären Knotens (AVN) in einem erwachsenen Mausherz. Ansicht von rechts. Der AVN (rot gestrichelter Kreis) befindet sich an der Spitze des Koch-Dreiecks (weißes gestricheltes Dreieck) nahe der Unterseite des membranösen Septums. Das Koch-Dreieck wird von der Sehne von Todaro (TT, grün gestrichelte Linie), der Trikuspidalklappe (TV, blaue gestrichelte Linie) und der Öffnung der Koronarhöhle (CS, gelbe gestrichelte Linie) gebildet. SVC, Vena cava superior; IVC, Vena cava inferior; IVS, interventrikuläres Septum; OF, ovale Fossa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Vorbereitete Probe, die auf die konfokale Mikroskopie geladen wurde. Die präparierte Probe (roter Pfeil) für die konfokale Mikroskopie mit Plastilin (schwarzer Pfeil) in den Plexiglasring eingelassen. Ansicht von unten. Hrsg. Plexiglasring mit montierter Probe, die kopfüber auf die Plattform des konfokalen Mikroskops (inverses Mikroskop) geladen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5. Rekonstruktion der konfokalen Mikroskopie-Bildgebung von SAN in einer C57BL6/J-Maus, die mit Anti-HCN4 (rot) und Cx43 (weiß) Antikörpern gefärbt war. Ein. Der gestrichelte Bereich umreißt das SAN, das sich entlang der Kavalsregion zwischen der oberen und unteren Hohlvene orientiert. Hrsg. Vergrößerung der Einlage von Tafel A. C. 3D-Rekonstruktion der Tafel B. RAA, rechtes Vorhofohr; RA, rechtes Atrium; SAN, sinoatrialer Knoten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6. Rekonstruktion der konfokalen Mikroskopie-Bildgebung von AVN in einer C57BL6/J-Maus, die mit Anti-HCN4 (rot) und Cx43 (weiß) Antikörpern gefärbt war. Ein. Der gestrichelte Bereich zeigt die AVN an. Vergrößerung des Inlays von Tafel A. C. 3D-Rekonstruktion von Panel B. IVS, interventrikuläres Septum; IAS, interatriales Septum; AVN, atrioventrikulärer Knoten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7. Negatives Kontrollbild. Ein. Negativkontroll-Whole-Mount-Färbung für SAN. Der gestrichelte Kreis zeigte die SAN-Region, die durch die anatomischen Orientierungspunkte bestätigt wurde. Hrsg. Negativkontrollfärbung für SAN nur mit zweiten Antikörpern. Hrsg. DAPI-Färbung für SAN. D . Negativkontrolle der Ganzkörperfärbung für AVN. Der gestrichelte Kreis zeigte die AVN-Region, die durch die anatomischen Orientierungspunkte bestätigt wurde. E . Negativkontrollfärbung für AVN nur mit zweiten Antikörpern. Hrsg. DAPI-Färbung für AVN. RAA, rechtes Vorhofohr; RA, rechtes Atrium; SVC, Vena cava superior; IVS, interventrikuläres Septum; IAS, interatriales Septum; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: 3D-Rekonstruktion des SAN Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: 3D-Rekonstruktion des AVNBitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
| Verbindung | Endkonzentration | g oder ml/100 ml erforderlich | |
| Befestigungslösung | |||
| Formaldehyd (16%) | 4% | 25 ml | |
| PBS (1x) | 75 ml | ||
| 1% Triton-Lösung | |||
| Triton X100 | 1% | 1 ml | |
| PBS | 99 ml | ||
| Blockierende Lösung | |||
| Triton X-100 | 1% | 1 ml | |
| BSA | 0.50% | 0,5 g | |
| Normales Ziegenserum | 20% | 20 ml | |
| PBS (1x) | 89 ml | ||
| Waschlösung | |||
| Tween 20 | 0.10% | 0,1 ml | |
| BSA | 0.50% | 0,5 g | |
| PBS (1x) | 99,9 ml | ||
| TAE (50x) | |||
| Tris-Basis | 24.20% | 24,2 g | |
| 100% Essigsäure | 5.71% | 5,71 ml | |
| 0,5 M EDTA | 0,05 m | 10 ml | |
| dH2O | Fügen Sie bis zu 100 ml hinzu | ||
Tabelle 1.
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Discussion
Die Anatomie des Herzens wird traditionell anhand dünner histologischer Schnitte untersucht11. Diese Methoden bewahren jedoch nicht die dreidimensionale Struktur des Leitungssystems und liefern somit nur 2D-Informationen. Das hier beschriebene Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll ermöglicht es, diese Einschränkungen zu überwinden und kann routinemäßig für die SAN- und AVN-Bildgebung verwendet werden.
Im Vergleich zu Standardmethoden wie der konventionellen Immunhistochemie, die Paraffin-Einbettung, Schnitte und Antigen-Retrieval erfordern, ist die Whole-Mount-Methodik vorteilhaft, um die genaue 3D-Lokalisation und Morphologie von SAN und AVN zu erfassen und die Beziehung zum umgebenden Gewebe zu untersuchen, da die Gewebemorphologie mit nur minimaler Gewebedehydratation und physischem Bruch erheblich erhalten bleibt. Auch die Immunreaktivität (d.h. die Bindung von Antikörpern an Gewebeantigene) wird in hohem Maße aufrechterhalten.
Wir haben eine praktische Probenprozessionsmethode für die konfokale Mikroskopie etabliert, indem wir einen mit Plastilin12,13 gefüllten Ringhalter aus Kunststoff verwendet haben. Plastilin ist ideal, da es individuell an die Größe des Gewebes angepasst werden kann, es ist hart genug, um das Gewebe ohne übermäßigen Druck des Gewebes zuverlässig zu halten. Am wichtigsten ist, dass es nicht fluoreszierend ist, einen selbstfluoreszierenden Hintergrund vermeidet und daher das Fluoreszenzsignal der verwendeten Antikörper nicht stört.
Wir haben das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (LSM-Zeiss) mit dem Airyscan-Detektor verwendet, der einen deutlichen Vorteil bei der Gewinnung von Bildern mit hoher Qualität bieten kann. Die Verwendung eines Weitfeld-Bildgebungsmikroskops kann nur Informationen auf Gewebeebene liefern, aber es fehlt die zelluläre Auflösung. Darüber hinaus birgt das Weitfeldmikroskop das Risiko eines hohen Hintergrunds14. Durch die Verwendung eines Airyscan-Detektors für konfokales LSM kann eine verbesserte Auflösung und ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Vergleich zu dem herkömmlichen konfokalen Bildgebungssystem mit einer Lochblende und einem Detektorerreicht werden 15.
Die Formen und Positionen von SAN und AVN werden als 3D-Rekonstruktion dargestellt, und zusätzliche virtuelle Schnittebenen, die aus der 3D-Rekonstruktion abgeleitet werden, können die Interpretation histologischer Schnitte verbessern, während die konventionelle Histologie nur eine 2D-Beurteilung der Anatomie mit dem inhärenten Risiko der Nichterkennung kleiner, aber relevanter Strukturen ermöglicht. Darüber hinaus bietet die 3D-Rekonstruktion die Möglichkeit, anatomische Strukturen von Interesse transmural und innerhalb der intakten Mikroumgebung zu untersuchen, zum Beispiel den intrinsischen autonomen Nervenplex, der das Herz innerviert16. Die In-situ-Färbung und 3D-Rekonstruktion ermöglicht die Untersuchung der zellulären Umgebung sowie der spezifischen Zelltypen und deren Orientierung. Darüber hinaus kann die regionale und zelltypspezifische Proteinexpression visualisiert werden, was die Western-Blot- und Proteomik-Analysen weiter unterstützenkann 17.
SAN und AVN sind spezialisierte Strukturen innerhalb des Herzens mit einem unterschiedlichen Expressionsmuster von Ionenkanälen und Connexinen, die zur zuverlässigen Identifizierung verwendet werden können10,18. Hyperpolarisationsaktivierte zyklische Nukleotid-gesteuerte Kationenkanäle (HCN) etablieren die diastolische Depolarisation in Schrittmacherzellen und werden daher spezifisch innerhalb des Leitungssystems exprimiert, wobei HCN4 die vorherrschende Isoform in der Mausist 19. Studien haben gezeigt, dass HCN4 eine der nachweisbaren und stabil exprimierten HCN-Isoformen im gesamten SAN und AVN11,20 ist. Connexine verbinden direkt benachbarte Zellen und ermöglichen den Durchgang von Ionen von Zelle zu Zelle. Sie sind daher essentiell für die Weiterleitung des elektrischen Impulses durch das Herz21. Die Expressionsmuster von Connexin variieren zwischen verschiedenen Regionen des Herzens, wobei Cx43 die am häufigsten vorkommende Isoform ist, die in fast allen Teilen des Herzens mit Ausnahme von SAN und AVN22 gefunden wurde. Die Kombination von Mikrodissektion mit Anti-HCN4- und Anti-CX43-Antikörpern sowie In-silico-Ansätze zur dreidimensionalen Rekonstruktion konfokaler Bilder ermöglichen eine zuverlässige Identifizierung von SAN und AVN und eine umfassende Untersuchung der SAN/AVN-Morphologie sowie deren Interaktion mit dem umgebenden Gewebe.
SAN und AVN sind nach der Färbung mit einem spezifischen Antikörper leicht zu unterscheiden. Um das SAN und das AVN anhand ihrer anatomischen Orientierungspunkte zu lokalisieren, ist jedoch etwas Übung erforderlich, bevor die korrekte Mikrodissektion durchgeführt werden kann.
Unter Verwendung des obigen Protokolls können auch eine Reihe anderer Antigene angewendet werden. Das Protokoll funktioniert auch gut sowohl bei perfusionsfixiertem als auch bei immersionsfixiertem Gewebe. Die Inkubationszeit kann jedoch für eine optimale Fixierung angepasst werden, da bestimmte Antikörper eine verminderte Immunreaktivität aufweisen, wenn das Antigen überfixiert ist. Da die Whole-Mount-Färbung 7 Tage für die primäre und sekundäre Antikörperinkubation benötigt, ist es wichtig, die Proben vollständig in ausreichende Mengen antikörperhaltiger Lösungen einzutauchen. Das Verdünnungsverhältnis jedes Antikörpers sollte vor dem Versuch getestet werden. Für eine optimale Färbung sollte irrelevantes Gewebe entfernt werden. Für das Protokoll haben wir nur kleine Teile der Ventrikel zur besseren Orientierung konserviert und das gesamte umgebende Fettgewebe und die Lungenvenen entfernt, da umliegendes (irrelevantes) Gewebe ebenfalls Antikörper binden kann, insbesondere wenn die Zielantigene global exprimiert werden.
Die In-situ-Färbung, die konfokale Bildgebung und die 3D-Rekonstruktion sind eine unschätzbare und leistungsstarke Technik für Forscher aus verschiedenen Bereichen. Die Methode hat jedoch auch einige Einschränkungen. (i) Es erfordert spezielle Geräte wie ein konfokales Mikroskop, das nicht in jeder Einrichtung allgemein verfügbar ist. (ii) Wie oben erwähnt, erfordert die Mikrodissektion von spezialisierten anatomischen Strukturen wie SAN oder AVN, aber auch die konfokale Bildgebung und die post-imaginäre Verarbeitung intensives Üben und erfahrenes Personal. (iii) Der Erfolg der Methode hängt in hohem Maße von der Qualität der verwendeten Antikörper ab und kann daher in einigen Fällen eine große Herausforderung darstellen. Auch (iv) 3D-Rekonstruktion kann schwierig zu erreichen sein und kann eine intensive Fehlersuche erfordern, um das Verfahren zu optimieren. Zum Beispiel müssen bei der Bildaufnahme optimale Intervalle eingestellt werden, da zu weit voneinander entfernte Abschnitte Lücken hinterlassen und möglicherweise keine adäquate 3D-Rekonstruktion der Anatomie ermöglichen. Bereiche, die zu nahe beieinander liegen, können aufgrund der übermäßigen Beleuchtung zu Überabtastung und Ausbleichen führen und es dauert lange, bis ein Bild fertiggestellt ist. Schließlich (v) ist die Haupteinschränkung der konfokalen Mikroskopie die Abbildungstiefe, was bedeutet, dass, wenn die Probendicke über der maximalen Arbeitstiefe des konfokalen Mikroskops liegt, das weitere Fluorophor nicht nachgewiesen werden kann.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt vom China Scholarship Council (CSC, an R. Xia), dem Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK; 81X2600255 an S. Clauss, 81Z0600206 an S. Kääb), der Corona-Stiftung (S199/10079/2019 an S. Clauss), dem SFB 914 (Projekt Z01 an H. Ishikawa-Ankerhold und S. Massberg und Projekt A10 an C. Schulz), dem ERA-NET für kardiovaskuläre Erkrankungen (ERA-CVD; 01KL1910 an S. Clauss) und der Heinrich-und-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (an S. Clauss). Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglass ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |
References
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Tags
Medizin Ausgabe 166 Sinusknoten Atrioventrikulärer Knoten Kardiologie Elektrophysiologie Herzreizleitungssystem Mikrodissektion Immunfluoreszenz KonfokalmikroskopieErratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
