ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Murin kalplerde sinoatriyal nod (SAN) ve atriyoventriküler nodun (AVN) tam montajlı immünofloresan boyaması için adım adım bir protokol sağlıyoruz.
Abstract
Sinoatriyal düğümdeki (SAN) kalp pili hücreleri tarafından fizyolojik olarak üretilen elektrik sinyali, tüm kalbin uyarılmasına ve kasılmasına izin vermek için atriyoventriküler düğümü (AVN) içeren iletim sistemi aracılığıyla iletilir. SAN veya AVN'nin herhangi bir disfonksiyonu, elektrofizyoloji ve aritmogenezdeki temel rollerini gösteren aritmilere neden olur. Fare modelleri aritmi araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak SAN ve AVN'nin spesifik araştırması zor olmaya devam etmektedir.
SAN, crista terminalinin superior vena kava ile birleştiği noktada bulunur ve AVN, koroner sinüs, triküspid annulus ve Todaro tendonunun deliğinden oluşan Koch üçgeninin tepesinde bulunur. Bununla birlikte, küçük boyut nedeniyle, geleneksel histoloji ile görselleştirme zor olmaya devam etmektedir ve SAN ve AVN'nin 3D ortamlarında incelenmesine izin vermemektedir.
Burada, etiketli fare SAN ve AVN'nin yerel olarak görselleştirilmesine izin veren tam montajlı bir immünofloresan yaklaşımını açıklıyoruz. Bu amaçla, fare kalbi disseke edilir, istenmeyen doku çıkarılır, ardından fiksasyon, geçirgenlik ve bloke edilir. SAN ve AVN içindeki iletim sisteminin hücreleri daha sonra bir anti-HCN4 antikoru ile boyanır. Konfokal lazer tarama mikroskobu ve görüntü işleme, düğüm hücreleri ve çalışan kardiyomiyositler arasında ayrım yapılmasına ve SAN ve AVN'nin net bir şekilde lokalize edilmesine izin verir. Ayrıca, sinir lifleri gibi diğer hücre tiplerini de etiketlemek için ek antikorlar birleştirilebilir.
Konvansiyonel immünohistoloji ile karşılaştırıldığında, tam montajlı immünofloresan boyama, kardiyak iletim sisteminin anatomik bütünlüğünü korur, böylece AVN'nin araştırılmasına izin verir; özellikle anatomilerine ve çevredeki çalışan miyokard ve miyosit olmayan hücrelerle etkileşimlerine girer.
Introduction
Aritmiler milyonlarca insanı etkileyen yaygın hastalıklardır ve dünya çapında önemli morbidite ve mortalite nedenidir. Kardiyak kalp pillerinin geliştirilmesi gibi tedavi ve önlemedeki muazzam ilerlemelere rağmen, aritmilerin tedavisi, esas olarak altta yatan hastalık mekanizmaları hakkındaki çok sınırlı bilgi birikimi nedeniyle zor olmaya devam etmektedir 1,2,3. Aritmilerin hem normal elektrofizyolojisinin hem de patofizyolojisinin daha iyi anlaşılması, gelecekte yeni, yenilikçi ve nedensel tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Ek olarak, aritmogenezi kapsamlı bir şekilde incelemek için, fareler elektrofizyoloji araştırmalarında yaygın olarak kullanıldığından, fare gibi hayvan modellerinde spesifik kardiyak iletim sistemini lokalize etmek ve görselleştirmek önemlidir.
Kardiyak iletim sisteminin ana parçaları, elektriksel impulsun özel kalp pili hücrelerinde üretildiği sinoatriyal düğüm (SAN) ve atriyum ile ventriküller arasındaki tek elektriksel bağlantı olan atriyoventriküler düğümdür (AVN)4. SAN ve AVN'nin elektrofizyolojik özellikleri her değiştiğinde, hemodinamik bozulmaya, senkopa ve hatta ölüme yol açabilecek hasta sinüs sendromu veya atriyoventriküler blok gibi aritmiler ortaya çıkabilir ve böylece hem SAN hem de AVN'nin elektrofizyoloji ve aritmiyogenezdeki temel rolünün altını çizer5.
SAN veya AVN ile ilgili kapsamlı çalışmalar, her iki yapının da ideal olarak fizyolojik ortamlarında hassas bir lokalizasyonunu ve görselleştirilmesini gerektirir. Bununla birlikte, çalışan miyokard içindeki küçük boyutları ve konumları nedeniyle, makroskopik olarak görülebilen net bir yapı oluşturmadan, SAN ve AVN'nin anatomisini ve elektrofizyolojisini incelemek zordur. Anatomik yer işaretleri, SAN ve AVN 6,7,8'i içeren bölgeyi kabaca tanımlamak için kullanılabilir. Kısaca SAN, sağ atriyumun kas krista terminalisine (BT) bitişik kaval bölgesinde, AVN, triküspid kapak, koroner sinüsün ostiumu ve Todaro tendonu tarafından kurulan Koch üçgeni içinde yer almaktadır. Şimdiye kadar, bu anatomik işaretler esas olarak SAN ve AVN'yi bireysel yapılar olarak lokalize etmek, kaldırmak ve daha sonra incelemek için kullanıldı (örneğin, geleneksel histoloji ile). Bununla birlikte, SAN ve AVN'nin karmaşık elektrofizyolojisini (örneğin, çalışan miyokardın bitişik hücrelerinin düzenleyici etkileri) daha iyi anlamak için, fizyolojik 3D ortamdaki iletim sistemlerini incelemek gereklidir.
Tam montajlı immünofloresan boyama, çevreleyen dokunun bütünlüğünü korurken anatomik yapıları in situ olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir9. Konfokal mikroskopi ve görüntü analiz yazılımından yararlanan SAN ve AVN, özellikle bu bölgelerde ifade edilen iyon kanallarını hedefleyen floresan etiketli antikorlarla görselleştirilebilir.
Aşağıdaki protokol, SAN ve AVN mikroskop lokalizasyonu ve görselleştirmesi için iyi kurulmuş bir bütüne monte boyama yöntemi gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklamaktadır. Spesifik olarak, bu protokol (1) SAN ve AVN'nin anatomik işaretlerle anatomik işaretlerle nasıl lokalize edileceğini ve bu numunelerin boyama ve mikroskopi analizi için nasıl lokalize edileceğini (2) HCN4 ve Cx43 (3) referans belirteçlerinin tam montajlı immünofloresan boyamasını gerçekleştirmek için SAN ve AVN örneklerini konfokal mikroskopi için hazırlamak (4) SAN ve AVN'nin konfokal görüntülemesini gerçekleştirmek için açıklamaktadır. Ayrıca, bu protokolün, çevredeki çalışan miyokard veya otonom sinir lifleri gibi miyosit olmayan hücrelerin ilave boyanmasını içerecek şekilde nasıl değiştirilebileceğini de açıklıyoruz, bu da kalp içindeki kardiyak iletim sisteminin kapsamlı bir şekilde araştırılmasını sağlıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan bakımı ve tüm deneysel prosedürler, Münih Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve fareler üzerinde yapılan tüm prosedürler Bavyera, Münih, Almanya Hükümeti tarafından onaylanmıştır (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J fareleri Jackson Laboratuvarı'ndan satın alındı.
NOT: Şekil 1 , deney için gerekli aletleri göstermektedir. Şekil 2 , brüt kardiyak anatominin bir örneğini göstermektedir. Şekil 3 , SAN ve AVN'nin yetişkin bir fare kalbindeki konumunu göstermektedir. Şekil 4'te konfokal mikroskopiye yüklenen hazırlanmış örnek gösterilmektedir.
1. Hazırlıklar
- 30 mL PBS'de 10 mL% 16 formaldehit çözeltisini seyrelterek% 4'lük bir formaldehit çözeltisi (% 4 PFA) hazırlayın.
- Sırasıyla 15 g ve 30 g sakkaroz tozunu 100 mL PBS'ye çözerek% 15 sakkaroz çözeltisi ve% 30 sakkaroz çözeltisi hazırlayın. Sakkaroz tozu tamamen çözüldükten sonra, 4 ° C'de saklamadan önce çözeltiyi 0.2 μm şırınga filtresi kullanarak süzün.
- Bir beherin içine %3-%4'lük bir agaroz jeli hazırlayın, 3 g veya 4 g agaroz tozu ve 100 mL 1x TAE (50x TAE stok çözeltisinden seyreltilmiş) ekleyin. Beheri manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin ve agaroz tamamen çözülene kadar kaynatın.
- Diseksiyon kabını, 100 mm çapında bir Petri kabına 30 mL agaroz jeli (% 3-4) hafifçe dökerek hazırlayın. Petri kabını soğuması ve sertleşmesi için oda sıcaklığında tezgahta bırakın.
- Tablo 1'de verilen tariflere göre blokaj çözeltisi ve yıkama çözeltisi hazırlayın. Kullanım gününde hazırlanan tüm çözümleri hazırlayın. Uzun süreli depolama önerilmez.
- Antikor çözeltilerini soğuk (4 ° C) 1x PBS'de seyrelterek hazırlayın, seyreltmeyi ışıktan koruyun (örneğin, alüminyum folyoyu etrafına sararak) ve seyreltmeleri kullanılana kadar buz üzerinde tutun. Kuluçkadan kısa bir süre önce antikorları seyreltin. Seyreltilmiş antikorları oda sıcaklığında bırakmaktan kaçının.
NOT: Uygun antikor seyreltmesi, konvansiyonel immünofloresan boyama işlemi gerçekleştirilerek karşılaştırılabilir doku örnekleri ile test edilmelidir. Burada, antikorları 10 μm kalınlığında kesilmiş donmuş bölümleri boyayarak test ettik.
2. Organ toplama ve doku hazırlama
- Fareyi bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı bir inkübasyon odasına yerleştirerek anestezi yapın. Buharlaştırıcıyı% 4-5 izofluran (sırasıyla% 96-95 oksijen) verecek şekilde ayarlayın.
NOT: Tam anestezi, fare sırtına yerleştirilene kadar odayı hafifçe yuvarlayarak postüral reaksiyonun ve sağ refleksin kaybıyla doğrulanır. - Fareyi ameliyat masasında sırtüstü pozisyona getirin. Fare burnunu, izofluran buharlaştırıcıya bağlı iç tüpü ile modifiye edilmiş bir Bain devresine bağlı bir anestezi maskesine yerleştirin. Anesteziyi sürdürmek için, 1 L / dak akış hızında oksijende% 1-2 izofluran kullanın. Fazla anestezik buharı maskenin dış tüpünden fareden temizleyin ve fazla anestezik gazı emen bir aktif kömür kutusundan çekin.
- Tam anestezi sağlandığında, analjezi için fentanil enjekte edin (0.1 μg / 25 g vücut ağırlığı i.p.).
- Ayak parmağını sıkıştırma refleksi tespit edilemediğinde, kürk ve cildi çıkarmak için iris makası kullanarak jugulumdan simfize kadar net bir kesim yapın. Karnı dikkatlice açmak için iris makası kullanarak kaburgaların altında soldan sağa doğru başka bir kesim yapın.
- Herhangi bir organa zarar vermeden diyaframın soldan sağa kesilmesine izin vermek için kavisli forseps kullanarak ksifoid biraz hayat verin. Göğüs kafesini her iki tarafta medial aksiller bir çizgide kesin, iris makası kullanarak kraniyal olarak çevirin ve kalbe erişime izin verin.
- İnferior vena kavayı ve inen torasik aortu iris makası kullanarak diyafram seviyesinde kesin. Kalbi tepe bölgesinde 27 G'lik bir iğne ile delin ve ardından iğneyi dikkatlice sol ventriküle (LV) itin. Kalbi delmek için LV'ye yavaşça 5-10 mL buz gibi soğuk PBS enjekte edin.
NOT: Kalbin rengi, PBS ile başarılı perfüzyonu gösteren kırmızıdan griye dönmelidir. - Büyük damarları kesmeye ve kalbi çıkarmaya izin veren bir cımbız kullanarak kalbin tepesini dikkatlice kaldırın.
- Superior vena kava'ya (SVC) zarar gelmesini önlemek için büyük arterleri ve damarları kalpten mümkün olduğunca uzağa keserek kalbi tüketin. Daha sonraki işlemler sırasında önemli bir dönüm noktası olarak hizmet edeceğinden SVC'yi koruyun.
- Kalbin çıkarılmasından sonra, izofluran buharlaştırıcısını kapatın.
- Kalbi, diseksiyon mikroskobu altında buz gibi soğuk PBS ile dolu bir diseksiyon kabına koyun. Kalbin solu/sağı ve önü/arkası belirlendikten sonra, kalbi kabın dibinde kalbin önü olacak şekilde çevirin (arkada bulunan büyük damarları ortaya çıkarmak için).
- Diseksiyon kabının altındaki agaroza tepeden ve sol atriyal apendikstan (LAA) küçük iğneler koyarak kalbi hareketsiz hale getirin (Şekil 2A). İnce cımbız ve makas kullanarak, kavaller arası bölgeyi açığa çıkarmak için SVC ve inferior vena kava (IVC) (örneğin akciğerler, yağ, perikard) etrafındaki kalp dışı dokuyu dikkatlice çıkarın (Şekil 3A).
- Ventriküller ve atriyum arasındaki oluğu mikro makasla paralel keserek ventriküllerin çoğunu çıkarın. Pleksiglas halkasına daha sonra yüklenmek üzere ventriküler dokunun küçük bir bölümünü koruyun.
- Fiksasyon ve dehidrasyon için, numuneyi (atriyum, SVC ve IVC içeren) 4 ° C'de gece boyunca% 4 PFA'ya koyun.
- Ertesi gün, kalbi 4 ° C'de 24 saat boyunca% 15 sakkaroz çözeltisine aktarın.
- Ertesi gün, kalbi 4 ° C'de 24 saat boyunca% 30 sakkaroz çözeltisine aktarın.
NOT: Adım 2.13, 2.14 ve 2.15'teki sabitleme ve dehidrasyon için, numuneler daha fazla karışmadan veya sallanmadan 4 ° C'de bırakılır.
3. Tam montajlı immünofloresan boyama
- Kalbi PBS'de seyreltilmiş %1 Triton X-100 ile yıkayın ve 4 °C'de gece boyunca bloke edici çözeltiyi (Tablo 1) bloke edin ve geçirgenleştirin.
- Kalbi 1.5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve 4 ° C'de 7 gün boyunca bloke edici çözelti ile seyreltilmiş tavşan anti-fare konneksin-43 (1:200 seyreltme) ve sıçan anti-fare HCN4 (1:200 seyreltme) antikorları ile inkübe edin.
NOT: Veri sayfalarını oryantasyon olarak kullanmadan önce optimal primer antikor konsantrasyonu test edilmelidir. İlgilenilen diğer antijenler de, birincil antijenin konakçı türleri diğerlerinden farklı olduğu sürece, bu adımda boyanabilir. Daha yüksek bir Triton X-100 konsantrasyonu,10'dan önce gösterildiği gibi daha etkili antikor boyaması elde edilmesine yardımcı olabilir, ancak konsantrasyon ayrı ayrı belirlenebilir. - 7 gün sonra, bir pipet kullanarak birincil antikorları içeren çözeltiyi çıkarın ve kalbi% 1 Triton X-100 çözeltisi ile 3 kez yıkayın (her seferinde orbital çalkalayıcıdaki oda sıcaklığında 1 saat boyunca).
- Yıkadıktan sonra, kalbi = Alexa Fluor 488 keçi anti-sıçan IgG (1:200 seyreltme) ve Alexa Fluor 647 keçi tavşan karşıtı IgG (1:200 seyreltme) ile 4 ° C'de 7 gün boyunca kuluçkaya yatırın.
- 7 gün sonra, ikincil antikorları içeren tüm çözeltiyi bir pipet kullanarak çıkarın. Daha sonra yıkama solüsyonunu kullanarak kalbi (Tablo 1) 3 kez yıkayın (yörüngesel çalkalayıcıdaki oda sıcaklığında her seferinde 1 saat boyunca).
- Çekirdekleri boyamak için, kalbi 4 ° C'de gece boyunca DAPI çözeltisinde (10 μg / mL) inkübe edin.
- Ertesi gün, kalbi 3 kez yıkama çözeltisiyle yıkayın (yörüngesel çalkalayıcıdaki oda sıcaklığında her seferinde 1 saat boyunca).
NOT: Adım 3.1, 3.2, 3.4 ve 3.6'da blokaj, geçirgenlik, antikor inkübasyonu ve DAPI boyama için, numuneleri 4 ° C'de sabit durumda bırakın, karıştırmaya gerek yoktur. Lekeli doku, 4 ° C'de yıkama çözeltisi ile tamamen örtülmüş olarak korunabilir ve konfokal mikroskopta görüntülenene kadar birkaç gün boyunca ışıktan korunabilir.
4. Konfokal mikroskopi
- Pleksiglas halkaları hazırlayın ve hamuru ile doldurun (Şekil 1). Hamurun merkezinde, kalbin yüklenmesi için merkezde küçük bir oluk oluşur. Düz bir görüntüleme düzlemi elde etmek ve alanı ayarlamak ve 4.4. adımda numune ile kapak kaymaları arasındaki hava kabarcıklarını önlemek için sığ bir oluk açın.
- Hem SAN hem de AVN'nin sırayla görüntülenmesi için aynı kalp örneğini kullanın. SAN görüntüleme için doğrudan kalbe yüklenirken, AVN görüntüleme için daha önce mikrodiseksiyon yapın.
- SAN görüntüleme
- SAN'ı anatomik yer işaretleriyle tanımlayın: kalbin dorsal tarafında, kavaller arası bölgede (üst ve alt vena kava arasındaki bölge) bulunur. Crista terminalis (BT), SAN ve RAA arasındaki kas çizgisidir.
- Kalbi, kalbin arkası yukarı bakacak şekilde hamuru oluğuna yerleştirin. Kalp PBS ile tamamen kaplanana kadar boşluktaki tüm havayı yerinden etmek için kalbe PBS ekleyin (genellikle birkaç damla PBS yeterlidir).
- Diseksiyon mikroskobu altında, kalbi sabitlemek için RAA, LAA ve sol ventrikülün kalan kısımlarını hamuru içine hafifçe bastırın. Tüm kavaller arası bölgenin ve crista terminalinin açıkça görülebildiğinden emin olun (hamuru ile kaplı değildir). Görüntülenecek alan Şekil 3A'da gösterilmiştir.
- AVN görüntüleme
- SAN'ın görüntülenmesini bitirdikten sonra, aynı örneği hatırlayın ve ardından AVN görüntüleme için kullanın. AVN mikrodiseksiyonu için, kalbi = diseksiyon mikroskobunun altındaki bir diseksiyon kabına yerleştirin.
- Kalbi sağ taraf yukarı bakacak şekilde yönlendirin (sağ ventrikülün kalan kısımları dahil). Dokuyu hareketsiz hale getirmek için AG serbest duvarının kalan kısmından (şimdi altta olan) pimler yerleştirin (Şekil 2B).
- Kalan RV serbest duvarını triküspid valf ve superior vena kava boyunca yukarı doğru kesin. Daha sonra interventriküler ve interatriyal septumu ortaya çıkarmak için RV ve RA'yı çevirin. (Şekil 3B)
NOT: Koroner sinüse (CS) zarar vermemeye dikkat edin, çünkü daha sonra AVN'yi lokalize etmeye izin veren Koch üçgenini bulmak önemli bir anatomik dönüm noktasıdır. CS, kalbin arka tarafındaki sol atriyoventriküler olukta enine olarak çalışır ve CS deliği açıklığı, interatriyal septumun alt kısmındaki IVC ile triküspid kapak arasında bulunur (Şekil 3A ve B). - Sağ atriyumun endokardiyal yüzeyinde bulunabilen, triküspid kapağın (TV) septal broşürünün menteşe çizgisi ile ön tarafta ve arkada Todaro tendonu ile sınırlanmış Koch üçgenini tanımlayın. Taban, koroner sinüsün deliğinden oluşur (Şekil 3B). AVN görüntüleme için hedef bölge burası olduğundan, açıkça görülebilmesi gerekir.
- Kalbi, Pleksiglas halkası içindeki hamuru oluğuna, Koch üçgeni açıkça açığa çıkarılarak (yani hamuru ile kaplanmamış) aktarın. Numuneyi sabitlemek için Koch üçgeninin etrafındaki dokuyu hamuru yavaşça bastırın. Kalp PBS ile tamamen kaplanana kadar boşluktaki tüm havayı yerinden etmek için kalbe PBS ekleyin (genellikle birkaç damla PBS yeterlidir).
- SAN görüntüleme
- Pleksiglas halkaların kenarlarına, hamuru dolgulu Pleksiglas halkaların içine yüklenen kalplerin kapak kaymalarıyla kaplanmasını sağlamak için silikon uygulayın.
- PBS'nin parçalarını sıkmak ve görüntüleme alanında herhangi bir hava kabarcığından kaçınırken kalbi kapak kaymasına takmak için hamurunun arka tarafına hafifçe bastırın.
NOT: Hamurunun arka tarafına bastırılırken ilgilenilen bölgelerin katlanmadığından ve örtülmediğinden emin olun. Anatominin korunması ve örneklerin uygun konfokal görüntülenmesi için numune aşırı kompresyonu olmayan düz bir görüntüleme düzlemi gereklidir. SAN için, kavaller arası bölgenin açıkça açığa çıktığından emin olmak önemlidir. AVN için, Koch üçgeni tamamen açığa çıkarılmalıdır. - Tüm montajlı boyama örneklerini konfokal mikroskop platformuna baş aşağı yerleştirin. Kapak kaymasına takılı açıkta kalan SAN/AVN artık mikroskop platformunun dibindedir (Şekil 4).
NOT: Görüntü çekmek için Airyscan Ünitesine sahip Carl Zeiss LSM800 ve ZEN 2.3 SP1 siyah yazılımını kullanıyoruz. - Alexa Fluor 420 konjuge anti-HCN4'ün uyarılması için "BP420-480 + LP605" plakasını seçin. Ana kazancı 650-750 arasında değiştirin.
- Döşeme Tarama işlevini kullanarak tüm SAN ve AVN bölgesinin genel bir görüntüsünü alın. Ardından, taranacak ilgi alanının etrafındaki genel bakış görüntüsüne tıklayıp bir kare ekleyerek HCN4 pozitif bölgesini seçin.
- Konfokal mikroskobun kalan kanalları (Alexa Fluor 488 ve DAPI) için plakalar ve ana kazanç dahil olmak üzere parametreleri kontrol edin ve adım 4.6'da açıklandığı gibi ayarlayın.
- Tüm numuneyi önizlemek ve Z-stack aralığı için İlk ve Son'u ayarlamak üzere odağı numunenin yukarıdan aşağıya doğru yavaşça ayarlayın. Optik numunenin kalınlığına bağlı olarak Z-yığını için en uygun aralığı ayarlayın. Z-yığını için aralık olarak 20x hedefi ve 0,8-1 μm kullanıyoruz.
- Tüm parametreler düzgün bir şekilde ayarlandıktan sonra, SAN ve AVN'nin tüm alanını tarayın.
- Yazılım kullanarak görüntülerin 3B rekonstrüksiyonunu gerçekleştirin (örneğin, Imaris sürüm 8.4.2).
- Görüntü İşleme'yi seçin | Arka plan lekelemesini kaldırmak için Temel Çıkarma Özelliği.
- Seçilen kanal ve işlenecek ilgili bölge için ayara yüzey oluşturmayı seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda özetlenen protokolü kullanarak, hem SAN hem de AVN'nin konfokal mikroskopi görüntülemesi güvenilir bir şekilde gerçekleştirilebilir. HCN4'ü hedef alan floresan antikorları kullanarak iletim sisteminin spesifik boyanması ve Cx43'ü hedefleyen floresan antikorları kullanarak çalışan miyokardın boyanması, sağlam anatomi içinde SAN (Şekil 5, Video 1) ve AVN'nin (Şekil 6, Video 2) net bir şekilde tanımlanmasını sağlar.
Resim 1: Diseksiyon aletleri ve Pleksiglas halka tutucu. A. Hamuru ile doldurulmuş pleksiglas halka (kırmızı ok, kalbin yüklenmesi için merkezde oluşan oluğu gösterir). B. Agaroz jeli ile Petri kabının diseksiyonu. C. Yaylı makas. D. İris makas. E. Kavisli forseps. F. İnce forseps. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Brüt kardiyak anatominin gösterimi. A. SAN mikrodiseksiyonunun şematik gösterimi. Pimler tepe noktası ve sol atriyal apendiks (LAA) üzerinden uygulanır. SAN kırmızı kesikli daire ile gösterilir. B. AVN mikrodiseksiyonunun şematik gösterimi. Pimler, AG serbest duvarının kalan kısmından (şimdi altta) konur. AVN kırmızı kesikli bir daire ile gösterilir. SVC, Superior vena kava; IVC, inferior vena kava; CS, koroner sinüs; LAA, sol atriyal apendiks; RAA, sağ atriyal apendiks; PA, pulmoner arter; PV, pulmoner ven; LV, sol ventrikül; IVS, interventriküler septum; IAS, interatriyal septum; OF, oval fossa. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: SAN ve AVN'nin yetişkin bir fare kalbindeki konumu. Yetişkin bir fare kalbindeki sinoatriyal düğümün (SAN) konumu. Kalbin arkasından bakın. SAN'ın konumu, kavaller arası bölge içindeki kırmızı kesikli çizgi (siyah kesikli çizgiler) ile gösterilir. SVC, Superior vena kava; IVC, inferior vena kava; CS, koroner sinüs; LAA, sol atriyal apendiks; RAA, sağ atriyal apendiks; PV, pulmoner ven; BT, Crista terminalleri; LV, sol ventrikül; RV, sağ ventrikül. B. Yetişkin bir fare kalbindeki atriyoventriküler düğümün (AVN) yeri. Sağdan görüntüleyin. AVN (kırmızı kesikli daire), membranöz septumun dibine yakın Koch üçgeninin (beyaz kesikli üçgen) tepesinde bulunur. Koch üçgeni, Todaro tendonu (TT, yeşil kesikli çizgi), triküspid kapak (TV, mavi kesikli çizgi) ve koroner sinüsün deliğinden (CS, sarı kesikli çizgi) oluşur. SVC, superior vena cava; IVC, inferior vena kava; IVS, interventriküler septum; OF, oval fossa. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Konfokal mikroskopiye yüklenen hazırlanmış örnek. Konfokal mikroskopi için hazırlanan örnek (kırmızı ok), Pleksiglas halkasına hamuru (siyah ok) ile monte edilmiştir. Alttan görünüm. B. Pleksiglas halkası, konfokal mikroskop platformuna (ters mikroskop) yukarıdan aşağıya yüklenmiş monte edilmiş numune ile halkalanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. Anti-HCN4 (kırmızı) ve Cx43 (beyaz) antikorlarla boyanmış bir C57BL6/J farede SAN'ın konfokal mikroskopi görüntülemesinin rekonstrüksiyonu. Bir. Kesikli alan, üst ve alt vena kava arasındaki kavaller arası bölge boyunca yönlendirilen SAN'ı tanımlar. B. Kakma panelinin büyütülmesi A. C. Panel B. RAA'nın 3D rekonstrüksiyonu, sağ atriyal ek; RA, sağ atriyum; SAN, sinoatriyal düğüm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. AVN'nin konfokal mikroskopi görüntülemesinin anti-HCN4 (kırmızı) ve Cx43 (beyaz) antikorlarla boyanmış bir C57BL6/J farede rekonstrüksiyonu. Bir. Kesikli alan AVN'yi gösterir . Kakma panelinden büyütülmesi A. C. Panel B. IVS, interventriküler septumun 3D rekonstrüksiyonu; IAS, interatriyal septum; AVN, atriyoventriküler düğüm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7. Negatif kontrol görüntüsü. Bir. SAN için negatif kontrollü tam montajlı boyama. Kesikli daire, anatomi yer işaretleri tarafından onaylanan SAN bölgesini gösterdi. B. SAN için negatif kontrol boyama sadece ikinci antikorlarla boyanır. C. SAN için DAPI boyama. D . AVN için negatif kontrollü tam montajlı boyama. Kesikli daire, anatomi yer işaretleri tarafından onaylanan AVN bölgesini gösterdi. E . AVN için negatif kontrol boyama sadece ikinci antikorlarla. F. AVN. RAA için DAPI boyaması, sağ atriyal apendiks; RA, sağ atriyum; SVC, superior vena cava; IVS, interventriküler septum; IAS, interatriyal septum; Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: SAN'ın 3D Yeniden Yapılandırılması Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 2: AVN'nin 3D Yeniden Yapılandırılması Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
| Bileşik | Son konsantrasyon | g veya mL/100 mL gereklidir | |
| Sabitleme çözümü | |||
| Formaldehit (%16) | 4% | 25 mL | |
| PBS (1x) | 75 mL | ||
| % 1 Triton çözeltisi | |||
| Triton X100 | 1% | 1 mL | |
| PBS | 99 mL | ||
| Engelleme çözümü | |||
| Triton X-100 | 1% | 1 mL | |
| BSA | 0.50% | 0.5 gr | |
| Normal keçi serumu | 20% | 20 mL | |
| PBS (1x) | 89 mL | ||
| Yıkama çözeltisi | |||
| Ara 20 | 0.10% | 0,1 mL | |
| BSA | 0.50% | 0.5 gr | |
| PBS (1x) | 99,9 milyon L | ||
| TAE (50x) | |||
| Tris-taban | 24.20% | 24.2 gr | |
| %100 asetik asit | 5.71% | 5,71 milyon TL | |
| 0,5 milyon EDTA | 0.05 milyon | 10 mL | |
| dH2O | 100 mL'ye kadar ekleyin | ||
Tablo 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kardiyak anatomi geleneksel olarak ince histolojik kesitler11 kullanılarak incelenmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemler iletim sisteminin üç boyutlu yapısını korumaz ve bu nedenle sadece 2D bilgi sağlar. Burada açıklanan tam montajlı immünofloresan boyama protokolü bu sınırlamaların üstesinden gelmeye izin verir ve SAN ve AVN görüntüleme için rutin olarak kullanılabilir.
Parafin gömme, kesitleme ve antijen alımı gerektiren geleneksel immünohistokimya gibi standart yöntemlerle karşılaştırıldığında, tüm montaj metodolojisi, SAN ve AVN'nin tam 3D lokalizasyonunu ve morfolojisini ele almak ve doku morfolojisi sadece minimum doku dehidrasyonu ve fiziksel rüptür ile önemli ölçüde korunduğundan, çevreleyen doku ile ilişkiyi incelemek için avantajlıdır. Ayrıca, immünoreaktivite (yani, antikorların doku antijenlerine bağlanması) da oldukça korunur.
Hamuru12,13 ile doldurulmuş plastik halkaya monte edilmiş bir tutucu kullanarak konfokal mikroskopi için pratik bir numune alma yöntemi oluşturduk. Hamuru idealdir, çünkü dokunun boyutuna göre ayrı ayrı ayarlanabilir, dokunun aşırı basıncı olmadan dokuyu güvenilir bir şekilde tutmak yeterince zordur. En önemlisi, floresan değildir, otomatik floresan arka plandan kaçınır ve bu nedenle kullanılan antikorların floresan sinyaline müdahale etmez.
Konfokal lazer tarama mikroskobunu (LSM-Zeiss) Airyscan dedektörü ile birlikte kullandık, bu da yüksek kalitede görüntüler elde etmede belirgin bir avantaj sağlayabilir. Geniş alan görüntüleme mikroskobu kullanmak sadece doku düzeyinde bilgi sunabilir, ancak hücresel çözünürlükten yoksundur. Ek olarak, geniş alan mikroskobu yüksek arka plan riski taşır14. Konfokal LSM için bir Airyscan dedektörü kullanılarak, geleneksel bir iğne deliği ve dedektör konfokal görüntüleme sistemi15'e kıyasla gelişmiş çözünürlük ve sinyal-gürültü oranı (SNR) elde edilebilir.
SAN ve AVN'nin şekilleri ve konumu 3D rekonstrüksiyon olarak sunulur ve 3D rekonstrüksiyondan türetilen ek sanal kesit düzlemleri histolojik kesitlerin yorumlanmasını artırabilirken, geleneksel histoloji, anatominin yalnızca küçük ama ilgili yapıların tespit edilmemesi riski ile 2D değerlendirmesine izin verir. Dahası, 3D rekonstrüksiyon, ilgilenilen anatomik yapıları transmural olarak ve bozulmamış mikro çevre içinde, örneğin kalbi innerve eden içsel otonom sinir pleksi16 içinde inceleme fırsatı sunar. Tüm montaj in situ boyama ve 3D rekonstrüksiyon, hücresel ortamın yanı sıra spesifik hücre tiplerinin ve oryantasyonlarının araştırılmasına izin verir. Ayrıca, bölgesel ve hücre tipine özgü protein ekspresyonu görselleştirilebilir ve batı leke ve proteomik analizlerini daha da destekleyebilir17.
SAN ve AVN, güvenilir tanımlama için kullanılabilecek iyon kanallarının ve konneksinlerin farklı bir ekspresyon paternine sahip kalp içindeki özel yapılardır10,18. Hiperpolarizasyonla aktive olan siklik nükleotid kapılı katyon kanalları (HCN), kalp pili hücrelerinde diyastolik depolarizasyonu oluşturur ve bu nedenle HCN4'ün farede baskın izoform olduğu iletim sistemi içinde spesifik olarak eksprese edilir19. Çalışmalar, HCN4'ün SAN ve AVN11,20 boyunca tespit edilebilir ve kararlı bir şekilde ifade edilen HCN izoformlarından biri olduğunu göstermiştir. Konneksinler komşu hücreleri doğrudan bağlar ve iyonların hücreden hücreye geçişine izin verir; bu nedenle elektriksel impulsun kalpten iletilmesi için gereklidirler21. Konneksin ekspresyon paternleri kalpteki farklı bölgeler arasında değişir ve Cx43, SAN ve AVN22 hariç kalbin hemen hemen tüm bölgelerinde bulunan en bol izoformdur. Belirli ilgi alanlarının anti-HCN4 ve anti-CX43 antikorları ile maruziyetine izin vermek için mikrodiseksiyonun yanı sıra konfokal görüntülerin üç boyutlu rekonstrüksiyonu için in siliko yaklaşımların birleştirilmesi, SAN ve AVN'nin güvenilir bir şekilde tanımlanmasına ve SAN / AVN morfolojisinin yanı sıra çevre doku ile etkileşimlerinin kapsamlı bir şekilde araştırılmasına olanak tanır.
SAN ve AVN'nin spesifik bir antikor ile boyandıktan sonra ayırt edilmesi kolay olabilir. Bununla birlikte, SAN ve AVN'yi anatomik yer işaretlerine göre lokalize etmek için, doğru mikrodiseksiyon yapılmadan önce bazı uygulamalara ihtiyaç vardır.
Yukarıdaki protokolü kullanarak, bir dizi başka antijen de uygulanabilir. Protokol ayrıca hem perfüzyon sabit hem de daldırma sabit doku üzerinde iyi çalışır. Bununla birlikte, inkübasyon süresi optimal fiksasyon için ayarlanabilir, çünkü antijen aşırı sabitlendiğinde bazı antikorlar azalmış immünoreaktivite gösterir. Birincil ve ikincil antikor inkübasyonu için tam montajlı boyama yaklaşımının 7 güne ihtiyacı olduğundan, numunelerin yeterli miktarda antikor içeren çözeltilere tamamen batırılması önemlidir. Her antikorun seyreltme oranı deneyden önce test edilmelidir. Optimal boyama için, alakasız herhangi bir doku çıkarılmalıdır. Protokol için, ventriküllerin sadece küçük kısımlarını daha iyi oryantasyon için koruduk ve çevredeki tüm yağ dokusunu ve pulmoner damarları çıkardık, çünkü çevreleyen (alakasız) doku, özellikle hedef antijenler küresel olarak ifade edildiğinde, antikorları da bağlayabilir.
Tam montajlı in situ boyama, konfokal görüntüleme ve 3D rekonstrüksiyon, çeşitli alanlardan araştırmacılar için paha biçilmez ve güçlü bir tekniktir. Bununla birlikte, yöntemin bazı sınırlamaları da vardır. (i) Her kurumda yaygın olarak bulunmayan konfokal mikroskop gibi özel ekipman gerektirir. (ii) Yukarıda belirtildiği gibi, SAN veya AVN gibi uzmanlaşmış anatomik yapıların mikrodiseksiyonu, aynı zamanda konfokal görüntüleme ve görüntüleme sonrası işlem yoğun pratik ve deneyimli personel gerektirir. (iii) Yöntemin başarısı büyük ölçüde kullanılan antikorların kalitesine bağlıdır ve bu nedenle bazı durumlarda çok zor olabilir. Ayrıca (iv) 3D rekonstrüksiyonun elde edilmesi zor olabilir ve prosedürü optimize etmek için yoğun sorun giderme gerektirebilir. Örneğin, görüntü elde etme sırasında optimum aralıklar ayarlanmalıdır, çünkü birbirinden çok uzak aralıklı bölümler boşluklar bırakacak ve anatominin yeterli bir 3D rekonstrüksiyonuna izin vermeyebilir. Çok yakın olan bölümler, aşırı aydınlatma nedeniyle aşırı örnekleme ve ağartmaya neden olabilir ve bir görüntünün tamamlanması uzun zaman alacaktır. Son olarak (v) konfokal mikroskopinin en büyük sınırlaması görüntüleme derinliğidir, yani numune kalınlığı konfokal mikroskobun maksimum çalışma derinliğinin ötesindeyse, başka florofor tespit edilemez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Burs Konseyi (CSC, R. Xia'ya), Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi (DZHK; 81X2600255'ten S. Clauss'a, 81Z0600206'dan S. Kääb'a), Corona Vakfı (S199/10079/2019'dan S. Clauss'a), SFB 914 (H. Ishikawa-Ankerhold ve S. Massberg'e Z01 projesi ve A10'dan C. Schulz'a), Kardiyovasküler Hastalıklar üzerine ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910'dan S. Clauss'a) ve Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss'a) tarafından desteklenmiştir. Fon verenlerin el yazması hazırlamada hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglass ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |
References
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al.
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L.
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
- Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
Tags
Tıp Sayı 166 Sinoatriyal düğüm Atriyoventriküler düğüm Kardiyoloji elektrofizyoloji kardiyak iletim sistemi Mikrodiseksiyon İmmünofloresan Konfokal mikroskopiErratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
