Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Helmonteret immunfluorescensfarvning, konfokal billeddannelse og 3D-rekonstruktion af den sinoatriale og atrioventrikulære knude i musen

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/62058
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2,3, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

ERRATUM NOTICE

Summary

Vi leverer en trin-for-trin protokol til helmonteret immunfluorescensfarvning af sinoatriale knude (SAN) og atrioventrikulær knude (AVN) i murine hjerter.

Abstract

Det elektriske signal, der fysiologisk genereres af pacemakerceller i sinoatriale knude (SAN), ledes gennem ledningssystemet, som omfatter den atrioventrikulære knude (AVN), for at tillade excitation og sammentrækning af hele hjertet. Enhver dysfunktion af enten SAN eller AVN resulterer i arytmier, hvilket indikerer deres grundlæggende rolle i elektrofysiologi og arytmogenese. Musemodeller anvendes i vid udstrækning i arytmiforskning, men den specifikke undersøgelse af SAN og AVN er fortsat udfordrende.

SAN er placeret ved krydset mellem crista terminalis og den overlegne vena cava, og AVN er placeret ved toppen af Koch-trekanten, dannet af åbningen af koronar sinus, tricuspid annulus og senen af Todaro. På grund af den lille størrelse forbliver visualisering ved konventionel histologi imidlertid udfordrende, og det tillader ikke undersøgelse af SAN og AVN inden for deres 3D-miljø.

Her beskriver vi en helmonteret immunfluorescenstilgang, der muliggør lokal visualisering af mærket mus SAN og AVN. Helmonteret immunfluorescensfarvning er beregnet til mindre sektioner af væv uden behov for manuel sektionering. Til dette formål dissekeres musehjertet, med uønsket væv fjernet, efterfulgt af fiksering, permeabilisering og blokering. Celler i ledningssystemet i SAN og AVN farves derefter med et anti-HCN4-antistof. Konfokal laserscanningsmikroskopi og billedbehandling tillader differentiering mellem nodalceller og fungerende kardiomyocytter og klart lokaliserer SAN og AVN. Desuden kan yderligere antistoffer kombineres for også at mærke andre celletyper, såsom nervefibre.

Sammenlignet med konventionel immunohistologi bevarer helmonteret immunofluorescensfarvning den anatomiske integritet af hjerteledningssystemet, hvilket muliggør undersøgelse af AVN; Især så i deres anatomi og interaktioner med de omgivende arbejdende myokardium og ikke-myocytceller.

Introduction

Arytmier er almindelige sygdomme, der rammer millioner af mennesker, og er årsagen til betydelig sygelighed og dødelighed over hele verden. På trods af enorme fremskridt inden for behandling og forebyggelse, såsom udvikling af hjertepacemakere, er behandling af arytmier fortsat udfordrende, primært på grund af den meget begrænsede viden om underliggende sygdomsmekanismer 1,2,3. En bedre forståelse af både den normale elektrofysiologi og patofysiologien af arytmier kan bidrage til at udvikle nye, innovative og kausale behandlingsstrategier i fremtiden. For at omfattende studere arytmogenese er det desuden vigtigt at lokalisere og visualisere det specifikke hjerteledningssystem i dyremodeller som musen, da mus er meget udbredt i elektrofysiologiforskning.

De vigtigste dele af hjerteledningssystemet er sinoatriale knude (SAN), hvor den elektriske impuls genereres i specialiserede pacemakerceller, og den atrioventrikulære knude (AVN), som er den eneste elektriske forbindelse mellem atrierne og ventriklerne4. Når de elektrofysiologiske egenskaber af SAN og AVN ændres, kan arytmier såsom syg sinussyndrom eller atrioventrikulær blok forekomme, hvilket kan føre til hæmodynamisk forringelse, synkope og endda død og dermed understrege den væsentlige rolle af både SAN og AVN i elektrofysiologi og arytmogenese5.

Omfattende undersøgelser af SAN eller AVN kræver en præcis lokalisering og visualisering af begge strukturer, ideelt set inden for deres fysiologiske miljø. På grund af deres lille størrelse og placering inden for det arbejdende myokardium, uden at etablere en klar makroskopisk synlig struktur, er det imidlertid udfordrende at studere anatomi og elektrofysiologi af SAN og AVN. Anatomiske landemærker kan bruges til groft at identificere regionen, der indeholder SAN og AVN 6,7,8. Kort sagt er SAN placeret i inter-caval-regionen i højre atrium ved siden af den muskulære crista terminalis (CT), AVN er placeret inden for Koch-trekanten etableret af tricuspidventilen, ostium i koronar sinus og senen af Todaro. Indtil videre blev disse anatomiske landemærker hovedsageligt brugt til at lokalisere, fjerne og derefter studere SAN og AVN som individuelle strukturer (f.eks. Ved konventionel histologi). For bedre at forstå den komplekse elektrofysiologi af SAN og AVN (fx regulatoriske virkninger af tilstødende celler i det arbejdende myokardium) er det imidlertid nødvendigt at studere ledningssystemerne inden for det fysiologiske 3D-miljø.

Helmonteret immunfluorescensfarvning er en metode, der bruges til at studere anatomiske strukturer in situ , samtidig med at integriteten af det omgivende vævbevares 9. Ved at udnytte konfokal mikroskopi og billedanalysesoftware kan SAN og AVN visualiseres med fluorescerende mærkede antistoffer rettet mod ionkanaler, der specifikt udtrykkes i disse regioner.

Følgende protokol forklarer de nødvendige trin for at udføre en veletableret helmonteret farvningsmetode til lokalisering og visualisering af SAN- og AVN-mikroskoper. Specifikt beskriver denne protokol, hvordan (1) at lokalisere SAN og AVN ved anatomiske landemærker for at forberede disse prøver til farvning og mikroskopianalyse, (2) at udføre helmonteret immunfluorescensfarvning af referencemarkørerne HCN4 og Cx43 (3) for at forberede SAN- og AVN-prøver til konfokalmikroskopi (4) for at udføre konfokal billeddannelse af SAN og AVN. Vi beskriver også, hvordan denne protokol kan ændres til at omfatte yderligere farvning af omgivende arbejdende myokardium eller ikke-myocytceller, såsom autonome nervefibre, hvilket muliggør en grundig undersøgelse af hjerteledningssystemet i hjertet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrepleje og alle forsøgsforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Animal Care and Ethics Committee ved universitetet i München, og alle de procedurer, der blev udført på mus, blev godkendt af regeringen i Bayern, München, Tyskland (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J mus blev købt fra Jackson Laboratory.

BEMÆRK: Figur 1 viser de instrumenter, der er nødvendige for eksperimentet. Figur 2 viser en illustration af den grove hjerteanatomi. Figur 3 viser placeringen af SAN og AVN i et voksent musehjerte. Figur 4 viser den forberedte prøve belastet på den konfokale mikroskopi.

1. Forberedelser

  1. Der fremstilles en 4% formaldehydopløsning (4% PFA) ved at fortynde 10 ml 16% formaldehydopløsning i 30 ml PBS.
  2. Der fremstilles en 15% saccharoseopløsning og 30% saccharoseopløsning ved at opløse henholdsvis 15 g og 30 g saccharosepulver i 100 ml PBS. Når saccharosepulveret er helt opløst, filtreres opløsningen med 0,2 μm sprøjtefilter inden opbevaring ved 4 °C.
  3. Forbered en 3% -4% agarosegel, tilsæt 3 g eller 4 g agarosepulver og 100 ml 1x TAE (fortyndet fra 50x TAE-stamopløsning) i et bægerglas. Bægerglasset anbringes på en magnetisk omrører og koges, indtil agarosen er helt opløst.
  4. Forbered dissektionsskålen ved forsigtigt at hælde 30 ml agarosegel (3% -4%) i en petriskål med en diameter på 100 mm. Lad petriskålen stå på bænken ved stuetemperatur for at køle ned og hærde.
  5. Forbered blokeringsopløsning og vaskeopløsning i henhold til opskrifterne i tabel 1. Forbered alle de opløsninger, der er forberedt på brugsdagen. Langtidsopbevaring anbefales ikke.
  6. Antistofopløsningerne fremstilles ved at fortynde dem i kold (4 °C) 1x PBS, beskyt fortyndingen mod lys (f.eks. ved at vikle aluminiumsfolie rundt) og opbevar fortyndingerne på is, indtil de bruges. Fortynd antistofferne kort før inkubation. Undgå at efterlade de fortyndede antistoffer ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Den passende antistoffortynding bør testes med sammenlignelige vævsprøver ved at udføre en konventionel immunfluorescerende farvning. Her testede vi antistofferne ved at farve frosne sektioner skåret i en tykkelse på 10 μm.

2. Organhøst og vævsforberedelse

  1. Bedøv musen ved at placere den i et inkubationskammer forbundet med en isofluranfordamper. Indstil vaporizeren til at levere 4-5% isofluran (henholdsvis 96-95% oxygen).
    BEMÆRK: Fuld anæstesi bekræftes ved tabet af posturalreaktionen og den oprettende refleks ved forsigtigt at rulle kammeret, indtil musen er placeret på ryggen.
  2. Sæt musen i liggende stilling på operationsbordet. Placer musens næse i en anæstesimaske, der er forbundet til et modificeret Bain-kredsløb med dets indre rør forbundet til isofluranfordamperen. For at opretholde anæstesi skal du bruge 1-2% isofluran i ilt ved en strømningshastighed på 1 l / min. Fjern overskydende bedøvelsesdamp fra musen via maskens ydre rør og træk gennem en beholder med aktivt kul, som absorberer den overskydende bedøvelsesgas.
  3. Når fuld anæstesi er opnået, injiceres fentanyl til analgesi (0,1 μg / 25 g legemsvægt i.p.).
  4. Når tåklemmerefleksen ikke kan detekteres, skal du lave et klart snit fra jugulum til symfysen ved hjælp af irissaks for at fjerne pels og hud. Lav et andet snit fra venstre mod højre under ribbenene ved hjælp af irissaks for forsigtigt at åbne maven.
  5. Liv xiphoiden lidt ved hjælp af buede tang for at gøre det muligt at skære membranen fra venstre mod højre uden at skade nogen organer. Skær brystkassen i en medial aksillær linje på begge sider ved hjælp af irissaks for at vende den kranielt og give adgang til hjertet.
  6. Skær den ringere vena cava og faldende thorax aorta på membranniveauet ved hjælp af irissaks. Punktering af hjertet med en 27 G nåli området af toppen og skub derefter forsigtigt nålen ind i venstre ventrikel (LV). Injicer forsigtigt 5-10 ml iskold PBS i LV for at perfusere hjertet.
    BEMÆRK: Hjertets farve skal skifte fra rød til grå, hvilket indikerer vellykket perfusion med PBS.
  7. Løft forsigtigt toppen af hjertet ved hjælp af en pincet, der gør det muligt at skære de store kar og fjerne hjertet.
  8. Punktafgifter hjertet ved at skære de store arterier og vener så langt væk fra hjertet som muligt for at undgå skader på den overlegne vena cava (SVC). Bevar SVC, da det vil fungere som et vigtigt vartegn under senere behandling.
  9. Efter fjernelse af hjertet skal du slukke for isofluranfordamperen.
  10. Sæt hjertet i en dissektionsskål fyldt med iskold PBS under dissekeringsmikroskopet. Efter bestemmelse af venstre / højre og forsiden / bagsiden af hjertet skal du dreje hjertet rundt med forsiden af hjertet i bunden af skålen (for at udsætte de store kar, der er placeret bagved).
  11. Immobiliser hjertet ved at sætte små stifter gennem toppen og venstre atriale vedhæng (LAA) i agarosen i bunden af dissektionsskålen (figur 2A). Brug en fin pincet og saks til forsigtigt at fjerne ikke-hjertevæv omkring SVC og ringere vena cava (IVC) (f.eks. lunger, fedt, perikardium) for at udsætte inter-kavalregionen (figur 3A).
  12. Fjern størstedelen af ventriklerne ved at skære parallelt rillen mellem ventriklerne og atrierne med mikrosaksen. Bevar en lille del af ventrikulært væv til den senere belastning på plexiglasringen.
  13. For fiksering og dehydrering anbringes prøven (indeholdende atrierne, SVC og IVC) i 4% PFA natten over ved 4 °C.
  14. Den næste dag overføres hjertet til 15% saccharoseopløsning i 24 timer ved 4 °C.
  15. Den næste dag overføres hjertet til 30% saccharoseopløsning i 24 timer ved 4 °C.
    BEMÆRK: Ved fiksering og dehydrering i trin 2.13, 2.14 og 2.15 efterlades prøverne ved 4 °C uden yderligere omrøring eller rokkning.

3. Helmonteret immunofluorescensfarvning

  1. Hjertet vaskes i 1% Triton X-100 fortyndet i PBS og blokeres og permeabiliseres i blokerende opløsning (tabel 1) natten over ved 4 °C.
  2. Hjertet anbringes i et 1,5 ml rør og inkuberes med kaninantimusekonnexin-43 (fortynding på 1:200) og rotteanti-mus HCN4-antistoffer (fortynding på 1:200) fortyndet med blokerende opløsning i 7 dage ved 4 °C.
    BEMÆRK: Den optimale koncentration af primære antistoffer bør testes, før databladene anvendes som orientering. Andre antigener af interesse kan også farves i dette trin, så længe værtsarten for det primære antigen er forskellig fra de andre. En højere koncentration af Triton X-100 kan hjælpe med at opnå mere effektiv antistoffarvning som vist før10, men koncentrationen kan bestemmes individuelt.
  3. Efter 7 dage fjernes opløsningen indeholdende primære antistoffer ved hjælp af en pipetteog vask hjertet med 1% Triton X-100-opløsning 3 gange (hver gang i 1 time ved stuetemperatur på orbitalrysteren).
  4. Efter vask inkuberes hjertet = med Alexa Fluor 488 ged anti-rotte IgG (fortynding på 1:200) og Alexa Fluor 647 ged anti-kanin IgG (fortynding på 1:200) i 7 dage ved 4 °C.
  5. Efter 7 dage fjernes al opløsningen indeholdende de sekundære antistoffer ved hjælp af en pipette. Vask derefter hjertet ved hjælp af vaskeopløsning (tabel 1) 3 gange (hver gang i 1 time ved stuetemperatur på orbitalrysteren).
  6. For at plette kerner inkuberes hjertet i DAPI-opløsning (10 μg/ml) natten over ved 4 °C.
  7. Den næste dag vaskes hjertet med vaskeopløsning 3 gange (hver gang i 1 time ved stuetemperatur på orbitalrysteren).
    BEMÆRK: Til blokering, permeabilisering, antistofinkubation og DAPI-farvning i trin 3.1, 3.2, 3.4 og 3.6 efterlades prøverne i steady state ved 4 °C, omrøring er ikke nødvendig. Det farvede væv kunne bevares fuldt dækket med vaskeopløsning ved 4 °C og beskyttet mod lys i nogle få dage, indtil det blev afbildet ved konfokalmikroskopet.

4. Konfokal mikroskopi

  1. Forbered plexiglasringe og fyld med plasticin (figur 1). I midten af plasticinen dannes en lille rille i midten til indlæsning af hjertet. Lav en lav rille, da det ville være lettere at erhverve et fladt billedplan og justere rummet og undgå luftbobler mellem prøven og dækslerne i trin 4.4.
  2. Brug den samme hjerteprøve til billeddannelse af både SAN og AVN sekventielt. For SAN-billeddannelse skal du indlæse hjertet direkte, mens du for AVN-billeddannelse skal udføre mikrodissektion før.
    1. SAN-billedbehandling
      1. Identificer SAN ved anatomiske vartegn: den er placeret på den dorsale side af hjertet inden for inter-caval-regionen (regionen mellem den overlegne og ringere vena cava). Crista terminalis (CT) er muskelstriben mellem SAN og RAA.
      2. Placer hjertet i plasticinrillen med bagsiden af hjertet opad. Tilføj PBS på hjertet for at fortrænge al luft i hulrummet, indtil hjertet er fuldt dækket af PBS (normalt er et par dråber PBS tilstrækkelige).
      3. Under dissektionsmikroskopet skal du forsigtigt trykke RAA, LAA og de resterende dele af venstre ventrikel ind i plasticinen for at fikse hjertet. Sørg for, at hele inter-caval-regionen og crista terminalis kunne ses tydeligt (ikke dækket af plasticin). Det område, der vil blive afbildet, er vist i figur 3A.
    2. AVN-billedbehandling
      1. Når billeddannelsen af SAN er afsluttet, skal du huske den samme prøve og derefter bruge den til AVN-billeddannelsen. For AVN-mikrodissektion placeres hjertet = på en dissektionsskål under dissektionsmikroskopet.
      2. Orienter hjertet med højre side opad (inklusive de resterende dele af højre ventrikel). Sæt stifter gennem den resterende del af LV-frivæggen (som nu er i bunden) for at immobilisere vævet (figur 2B).
      3. Skær den resterende RV-fri væg opad gennem tricuspidventilen og overlegen vena cava. Vend derefter RV og RA væk for at udsætte interventrikulær og interatriel septum. (figur 3B)
        BEMÆRK: Vær opmærksom på ikke at beskadige koronar sinus (CS), da det er et vigtigt anatomisk vartegn at finde Koch-trekanten, som derefter gør det muligt at lokalisere AVN. CS løber på tværs i venstre atrioventrikulære rille på den bageste side af hjertet, og CS-åbningsåbningen er placeret mellem IVC og tricuspidventilen i den ringere del af det interatriale septum (figur 3A og B).
      4. Identificer Koch-trekanten, der kan findes på endokardieoverfladen af højre atrium, afgrænset anteriort af hængsellinjen i tricuspidventilens septalfolder (TV) og bagud af Todaros sener. Basen er dannet af åbningen af koronar sinus (figur 3B). Da dette er målområdet for AVN-billeddannelse, skal det være tydeligt synligt.
      5. Overfør hjertet ind i plasticinrillen inden for plexiglasringen, hvor Koch-trekanten tydeligt er eksponeret (dvs. ikke dækket af plasticin). Tryk forsigtigt vævet omkring Koch-trekanten ind i plasticinen for at fastgøre prøven. Tilføj PBS på hjertet for at fortrænge al luft i hulrummet, indtil hjertet er fuldt dækket af PBS (normalt er et par dråber PBS tilstrækkelige).
  3. Påfør silikone på kanterne af plexiglasringene for at gøre det muligt at dække hjerterne, der er belastet i de plastinfyldte plexiglasringe, med dæksedler.
  4. Tryk forsigtigt på bagsiden af plasticinen for at presse dele af PBS ud og fastgøre hjertet til dækslet, samtidig med at du undgår luftbobler i billeddannelsesområdet.
    BEMÆRK: Sørg for, at de interessante områder ikke foldes og dækkes, når du trykker på bagsiden af plasticinen. Et fladt billeddannelsesplan uden prøveoverkompression er nødvendigt for at bevare anatomien og for korrekt konfokal billeddannelse af prøverne. For SAN er det vigtigt at sikre, at inter-caval-regionen er tydeligt eksponeret. For AVN bør Koch-trekanten være fuldt eksponeret.
  5. Sæt helmonterede farvningsprøver på hovedet på platformen af det konfokale mikroskop. Det eksponerede SAN / AVN, der er fastgjort til dæksedlen, er nu i bunden af mikroskopplatformen (figur 4).
    BEMÆRK: For at tage billeder bruger vi Carl Zeiss LSM800 med Airyscan Unit og softwaren ZEN 2.3 SP1 sort.
  6. Vælg plade "BP420-480 + LP605" til excitation af Alexa Fluor 647 konjugeret anti-HCN4. Varier masterforstærkningen fra 650-750.
  7. Tag et oversigtsbillede af hele SAN- og AVN-området ved hjælp af flisescanningsfunktionen . Vælg derefter det HCN4-positive område ved at klikke og tilføje en firkant på oversigtsbilledet omkring det interesseområde, der skal scannes.
  8. Kontroller parametrene, herunder plader og masterforstærkning for de resterende kanaler (Alexa Fluor 488 og DAPI) i det konfokale mikroskop og indstil som beskrevet i trin 4.6.
  9. Juster langsomt fokus fra top til bund af eksemplet for at få vist hele prøven og indstille første og sidste for Z-stakområdet. Indstil et optimalt interval for Z-stakken baseret på tykkelsen af den optiske prøve. Vi bruger et 20x mål og 0,8-1 μm som interval for Z-stack.
  10. Når alle parametre er korrekt indstillet, skal du scanne hele området af SAN og AVN.
  11. Udfør 3D-rekonstruktion af billederne ved hjælp af software (f.eks. Imaris version 8.4.2).
    1. Vælg billedbehandling | Baseline Subtraktion for at fjerne baggrundsfarvning.
    2. Vælg overfladeoprettelse på indstilling for valgt kanal og område af interesse for behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved at bruge protokollen skitseret ovenfor kan konfokal mikroskopibilleddannelse af både SAN og AVN udføres pålideligt. Specifik farvning af ledningssystemet ved hjælp af fluorescerende antistoffer rettet mod HCN4 og farvning af det arbejdende myokardium ved hjælp af fluorescerende antistoffer rettet mod Cx43 muliggør klar identifikation af SAN (figur 5, video 1) og AVN (figur 6, video 2) inden for den intakte anatomi.

Figure 1
Figur 1: Instrumenter til dissektion og plexiglasringholder. A. Plexiglasring fyldt med plasticin (rød pil viser rillen dannet i midten for at indlæse hjertet). B. Dissektion petriskål med agarosegel. C. Fjedersaks. D. Iris saks. E. Buet tang. F. Fine pincet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Illustration af den grove hjerteanatomi. A. Skematisk illustration af SAN-mikrodissektionen. Stifter påføres gennem toppen og venstre atriale vedhæng (LAA). SAN er angivet med rød stiplet cirkel. B. Skematisk illustration af AVN-mikrodissektionen. Stifter sættes gennem den resterende del af LV-frivæggen (som nu er i bunden). AVN er angivet med en rød stiplet cirkel. SVC, Overlegen vena cava; IVC, ringere vena cava; CS, koronar sinus; LAA, venstre atriale vedhæng; RAA, højre atriale vedhæng; PA, lungearterie; PV, lungevene; LV, venstre ventrikel; IVS, interventrikulær septum; IAS, interatriel septum; OF, oval fossa. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Placering af SAN og AVN i et voksent musehjerte. A. Placering af sinoatriale knude (SAN) i et voksent musehjerte. Udsigt fra bagsiden af hjertet. Placeringen af SAN er angivet med rød stiplet linje inden for inter-caval-regionen (sorte stiplede linjer). SVC, Overlegen vena cava; IVC, ringere vena cava; CS, koronar sinus; LAA, venstre atriale vedhæng; RAA, højre atriale vedhæng; PV, lungevene; CT, Crista terminalis; LV, venstre ventrikel; RV, højre ventrikel. B. Placering af den atrioventrikulære knude (AVN) i et voksent musehjerte. Udsigt fra højre. AVN (rød stiplet cirkel) er placeret øverst på Koch-trekanten (hvid stiplet trekant) nær bunden af det membranøse septum. Kochs trekant er dannet af senen af Todaro (TT, grøn stiplet linje), tricuspidventil (TV, blå stiplet linje) og åbningen af koronar sinus (CS, gul stiplet linje). SVC, overlegen vena cava; IVC, ringere vena cava; IVS, interventrikulær septum; OF, oval fossa. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Forberedt prøve indlæst på konfokalmikroskopi. A. Den forberedte prøve (rød pil) til konfokal mikroskopi monteret i plexiglasringen med plasticin (sort pil). Udsigt fra bunden. B. Plexiglasring med monteret prøve lastet på hovedet på platformen af det konfokale mikroskop (inverst mikroskop). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5. Rekonstruktion af konfokal mikroskopibilleddannelse af SAN i en C57BL6/J mus farvet med anti-HCN4 (rød) og Cx43 (hvid) antistoffer. En. Det stiplede område afgrænser SAN, som er orienteret langs inter-caval-regionen mellem den overlegne og ringere vena cava. B. Forstørrelse af indlægget fra panel A. C. 3D rekonstruktion af panel B. RAA, højre atriale vedhæng; RA, højre atrium; SAN, sinoatriale knude. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6. Rekonstruktion af konfokal mikroskopi billeddannelse af AVN i en C57BL6/J mus farvet med anti-HCN4 (rød) og Cx43 (hvid) antistoffer. En. Stiplede område angiver AVN. B. Forstørrelse af indlægget fra panel A. C. 3D rekonstruktion af panel B. IVS, interventrikulær septum; IAS, interatriel septum; AVN, atrioventrikulær knude. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7. Negativt kontrolbillede. En. negativ kontrol helmonteret farvning til SAN. Den stiplede cirkel viste SAN-regionen bekræftet af anatomiens vartegn. B. negativ kontrolfarvning for SAN kun med andet antistof. C. DAPI-farvning til SAN. D . negativ kontrol helmonteret farvning til AVN. Den stiplede cirkel viste AVN-regionen bekræftet af anatomiens vartegn. E . negativ kontrolfarvning for AVN kun med andet antistof. F. DAPI-farvning til AVN. RAA, højre atriale vedhæng; RA, højre atrium; SVC, overlegen vena cava; IVS, interventrikulær septum; IAS, interatriel septum; Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1: 3D-rekonstruktion af SAN Klik her for at downloade denne video.

Video 2: 3D-rekonstruktion af AVN Klik her for at downloade denne video.

Forbindelse Endelig koncentration g eller ml/100 ml påkrævet
Fastgørelse løsning
Formaldehyd (16%) 4% 25 ml
PBS (1x) 75 ml
1% Triton-opløsning
Triton X100 1% 1 ml
PBS 99 ml
Blokering løsning
Triton X-100 1% 1 ml
BSA 0.50% 0,5 g
Normalt gedeserum 20% 20 ml
PBS (1x) 89 ml
Vaskeopløsning
Mellem 20 0.10% 0,1 ml
BSA 0.50% 0,5 g
PBS (1x) 99,9 ml
TAE (50x)
Tris-base 24.20% 24,2 g
100% eddikesyre 5.71% 5,71 ml
0,5 m EDTA 0,05 m 10 ml
dH2O Tilføj op til 100 ml

Tabel 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hjertets anatomi er traditionelt blevet undersøgt ved hjælp af tynde histologiske sektioner11. Disse metoder bevarer imidlertid ikke ledningssystemets tredimensionelle struktur og giver således kun 2D-information. Den helmonterede immunfluorescensfarvningsprotokol, der er beskrevet her, gør det muligt at overvinde disse begrænsninger og kan rutinemæssigt bruges til SAN- og AVN-billeddannelse.

I sammenligning med standardmetoder såsom konventionel immunhistokemi, der kræver paraffinindlejring, sektionering og antigenhentning, er helmonteringsmetoden fordelagtig til at adressere den nøjagtige 3D-lokalisering og morfologi af SAN og AVN og til at undersøge forholdet til det omgivende væv, da vævsmorfologien er betydeligt bevaret med kun minimal vævsdehydrering og fysisk brud. Også immunoreaktiviteten (dvs. bindingen af antistoffer til vævsantigener) opretholdes også stærkt.

Vi etablerede en praktisk prøveprocessionsmetode til konfokal mikroskopi ved hjælp af en plastringmonteret holder fyldt med plasticine12,13. Plasticin er ideel, da den kan justeres individuelt til vævets størrelse, det er svært nok til pålideligt at holde vævet uden for stort tryk på vævet. Vigtigst er det, at det ikke er fluorescerende, undgår autofluorescerende baggrund og derfor ikke forstyrrer det fluorescerende signal fra de anvendte antistoffer.

Vi brugte det konfokale laserscanningsmikroskop (LSM-Zeiss) med Airyscan-detektoren, som kan tilbyde en klar fordel ved at opnå billeder med høj kvalitet. Brug af et widefield billedmikroskop kan kun tilbyde information på vævsniveau, men mangler cellulær opløsning. Derudover indebærer widefieldmikroskopet en risiko for høj baggrund14. Ved at bruge en Airyscan-detektor til konfokal LSM kan der opnås forbedret opløsning og signal-støj-forhold (SNR) sammenlignet med det traditionelle et pinhole-and-detector konfokale billeddannelsessystem15.

Formerne og placeringen af SAN og AVN præsenteres som 3D-rekonstruktion, og yderligere virtuelle sektionsplaner afledt af 3D-rekonstruktion kan forbedre fortolkningen af histologiske sektioner, mens konventionel histologi kun tillader en 2D-vurdering af anatomien med den iboende risiko for ikke-detektion af små, men relevante strukturer. Desuden giver 3D-rekonstruktion mulighed for at undersøge anatomiske strukturer af interesse transmuralt og inden for det intakte mikromiljø, for eksempel iboende autonom nerveplex, der inderverer hjertet16. Helmonteret in situ-farvning og 3D-rekonstruktion muliggør undersøgelse af det cellulære miljø såvel som de specifikke celletyper og deres orientering. Desuden kan regional og celletypespecifik proteinekspression visualiseres og kan yderligere understøtte western blot- og proteomics-analyser17.

SAN og AVN er specialiserede strukturer i hjertet med et andet ekspressionsmønster af ionkanaler og forbindelser, der kan bruges til pålidelig identifikation10,18. Hyperpolariseringsaktiverede cykliske nukleotid-gated kationkanaler (HCN) etablerer den diastoliske depolarisering i pacemakerceller og udtrykkes derfor specifikt inden for ledningssystemet, hvor HCN4 er den dominerende isoform i musen19. Undersøgelser har vist, at HCN4 er en af de påviselige og stabilt udtrykte HCN-isoformer i hele SAN og AVN11,20. Connexiner forbinder direkte naboceller og tillader passage af ioner fra celle til celle; De er derfor afgørende for ledningen af den elektriske impuls gennem hjertet21. Connexin-ekspressionsmønstre varierer mellem forskellige regioner i hjertet, hvor Cx43 er den mest rigelige isoform, der er fundet i næsten alle dele af hjertet undtagen SAN og AVN22. Ved at kombinere mikrodissektion for at muliggøre eksponering af specifikke interesseområder med anti-HCN4- og anti-CX43-antistoffer samt in silico-tilgange til tredimensionel rekonstruktion af konfokale billeder muliggør pålidelig identifikation af SAN og AVN og omfattende undersøgelse af SAN/AVN-morfologien samt deres interaktion med det omgivende væv.

SAN og AVN kan være lette at skelne efter farvning med et specifikt antistof. For at lokalisere SAN og AVN ved deres anatomiske vartegn er der dog behov for en vis praksis, før den korrekte mikrodissektion kan udføres.

Ved hjælp af ovenstående protokol kan en række andre antigener også anvendes. Protokollen fungerer også godt på både perfusionsfikseret og nedsænkningsfast væv. Inkubationstiden kan dog justeres for optimal fiksering, da visse antistoffer viser nedsat immunreaktivitet, når antigenet er overfikseret. Da helmonteret farvningsmetode har brug for 7 dage til primær og sekundær antistofinkubation, er det vigtigt at nedsænke prøverne fuldstændigt i tilstrækkelige mængder antistofholdige opløsninger. Fortyndingsforholdet for hvert antistof bør testes før forsøget. For optimal farvning skal ethvert irrelevant væv fjernes. Til protokollen bevarede vi kun små dele af ventriklerne for bedre orientering og fjernede alt omgivende fedtvæv og lungevener, da omgivende (irrelevant) væv også kan binde antistoffer, især når målantigenerne udtrykkes globalt.

Helmonteret in situ-farvning, konfokal billeddannelse og 3D-rekonstruktion er en uvurderlig og kraftfuld teknik for forskere fra forskellige områder. Metoden har dog også nogle begrænsninger. (i) Det kræver specialudstyr såsom et konfokalmikroskop, der ikke er almindeligt tilgængeligt på alle institutioner. (ii) Som nævnt ovenfor kræver mikrodissektion af specialiserede anatomiske strukturer såsom SAN eller AVN, men også konfokal billeddannelse og behandling efter billeddannelse intensivt praktiserende og erfarent personale. iii) Metodens succes afhænger i høj grad af kvaliteten af de anvendte antistoffer og kan derfor i nogle tilfælde være meget udfordrende. Også (iv) 3D-rekonstruktion kan være vanskelig at opnå og kan kræve intensiv fejlfinding for at optimere proceduren. For eksempel skal optimale intervaller indstilles under billedoptagelse, da sektioner, der er placeret for langt fra hinanden, efterlader huller og muligvis ikke tillader en tilstrækkelig 3D-rekonstruktion af anatomien. Sektioner, der er for tætte, kan forårsage oversampling og blegning på grund af overdreven belysning og vil tage lang tid at færdiggøre et billede. Endelig (v) er den største begrænsning af konfokalmikroskopi billeddybden, hvilket betyder, at hvis prøvetykkelsen er ud over den maksimale driftsdybde for det konfokale mikroskop, kan den yderligere fluorofor ikke detekteres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af China Scholarship Council (CSC, til R. Xia), det tyske center for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X2600255 til S. Clauss, 81Z0600206 til S. Kääb), Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. Clauss), SFB 914 (projekt Z01 til H. Ishikawa-Ankerhold og S. Massberg og projekt A10 til C. Schulz), ERA-NET om hjerte-kar-sygdomme (ERA-CVD; 01KL1910 til S. Clauss) og Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (til S. Clauss). Bidragyderne havde ingen rolle i udarbejdelsen af manuskripter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system  Hugo Sachs Elektronik 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit Hugo Sachs Elektronik 73-4860 Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform Kent Scientific SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps Fine Science Tools 11295-51
Iris scissors Fine Science Tools 14084-08
Spring scissors Fine Science Tools 91500-09
Tissue forceps Fine Science Tools 11051-10
Tissue pins Fine Science Tools 26007-01 Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker Sunlab D-8040
Magnetic stirrer IKA  RH basic
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL Eppendorf Z683884-1EA
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope  VWR 10836-004
Laser Scanning Confocal microscope Zeiss LSM 800
Software
Imaris 8.4.2 Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 black Zeiss
General Lab Material
0.2 µm syringe filter Sartorius 17597
100 mm petri dish Falcon 351029
27G needle BD Microlance 3 300635
50 ml Polypropylene conical Tube Falcon 352070
5ml Syringe Braun 4606108V
Cover slips Thermo Scientific 7632160
Eppendorf Tubes Eppendorf 30121872
Chemicals
0.5 M EDTA Sigma 20-158 Components of TEA
16% Formaldehyde Solution Thermo Scientific  28908 use as a 4% solution 
Acetic acid Merck 100063 Components of TEA
Agarose Biozym 850070
Bovine Serum Albumin Sigma A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 14190-094
Normal goat serum Sigma NS02L
Sucrose Sigma S1888-1kg
Tris-base Roche TRIS-RO Components of TEA
Triton X-100 Sigma T8787-250ml Diluted to 1% in PBS
Tween 20 Sigma P2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 mL Braun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mL Cp-pharma 31303
Oxygen 5 L Linde 2020175 Includes a pressure regulator
Antibodies
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488  Cell Signaling Technology #4412 diluted to 1:200
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 Invitrogen #A-21247 diluted to 1:200
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) Invitrogen H3570 diluted to 1:1000
Rabbit Anti-Connexin-43 Sigma C6219 diluted to 1:200
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) Invitrogen MA3-903 diluted to 1:200
Other
Plexiglass ring Self-designed and 3D printed
Plasticine Cernit 49655005
Silikonpasten, Baysilone VWR 291-1220
Animals
Mouse, C57BL/6 The Jackson Laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  2. Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
  3. Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
  4. van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
  5. Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
  6. Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
  7. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
  8. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
  9. Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
  10. Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  11. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
  12. Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
  13. Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
  14. Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
  15. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
  16. Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
  17. Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
  18. Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
  19. Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
  20. Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
  21. Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
  22. van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).

Tags

Medicin udgave 166 sinoatriale knude atrioventrikulær knude kardiologi elektrofysiologi hjerteledningssystem mikrodissektion immunofluorescens konfokal mikroskopi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

to:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

Helmonteret immunfluorescensfarvning, konfokal billeddannelse og 3D-rekonstruktion af den sinoatriale og atrioventrikulære knude i musen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xia, R., Vlcek, J., Bauer, J.,… More

Xia, R., Vlcek, J., Bauer, J., Kääb, S., Ishikawa-Ankerhold, H., van den Heuvel, D. A., Schulz, C., Massberg, S., Clauss, S. Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. J. Vis. Exp. (166), e62058, doi:10.3791/62058 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter