ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
We bieden een stapsgewijs protocol voor immunofluorescentiekleuring van de sinoatriale knoop (SAN) en atrioventriculaire knoop (AVN) in muizenharten.
Abstract
Het elektrische signaal dat fysiologisch wordt gegenereerd door pacemakercellen in de sinoatriale knoop (SAN) wordt geleid door het geleidingssysteem, dat de atrioventriculaire knoop (AVN) omvat, om excitatie en contractie van het hele hart mogelijk te maken. Elke disfunctie van SAN of AVN resulteert in aritmieën, wat wijst op hun fundamentele rol in elektrofysiologie en aritmogenese. Muismodellen worden veel gebruikt in aritmieonderzoek, maar het specifieke onderzoek naar SAN en AVN blijft een uitdaging.
Het SAN bevindt zich op de kruising van de crista terminalis met de superieure vena cava en AVN bevindt zich aan de top van de driehoek van Koch, gevormd door de opening van de coronaire sinus, de tricuspidalis annulus en de pees van Todaro. Vanwege het kleine formaat blijft visualisatie door conventionele histologie echter een uitdaging en het maakt de studie van SAN en AVN binnen hun 3D-omgeving niet mogelijk.
Hier beschrijven we een immunofluorescentiebenadering met volledige mount die de lokale visualisatie van gelabelde muis SAN en AVN mogelijk maakt. Whole-mount immunofluorescentiekleuring is bedoeld voor kleinere delen van weefsel zonder de noodzaak van handmatige secties. Daartoe wordt het muizenhart ontleed, waarbij ongewenst weefsel wordt verwijderd, gevolgd door fixatie, permeabilisatie en blokkering. Cellen van het geleidingssysteem binnen SAN en AVN worden vervolgens gekleurd met een anti-HCN4-antilichaam. Confocale laserscanmicroscopie en beeldverwerking maken differentiatie mogelijk tussen knooppuntcellen en werkende cardiomyocyten en kunnen SAN en AVN duidelijk lokaliseren. Bovendien kunnen extra antilichamen worden gecombineerd om ook andere celtypen te labelen, zoals zenuwvezels.
In vergelijking met conventionele immunohistologie behoudt immunofluorescentiekleuring van de hele montering de anatomische integriteit van het hartgeleidingssysteem, waardoor het onderzoek van AVN mogelijk is; vooral in hun anatomie en interacties met de omringende werkende myocardium en niet-myocytencellen.
Introduction
Aritmieën zijn veel voorkomende ziekten die miljoenen mensen treffen en zijn de oorzaak van aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Ondanks enorme vooruitgang in behandeling en preventie, zoals de ontwikkeling van pacemakers, blijft de behandeling van aritmieën een uitdaging, voornamelijk vanwege de zeer beperkte kennis over onderliggende ziektemechanismen 1,2,3. Een beter begrip van zowel de normale elektrofysiologie als de pathofysiologie van aritmieën kan helpen om in de toekomst nieuwe, innovatieve en causale behandelingsstrategieën te ontwikkelen. Om aritmogenese uitgebreid te bestuderen, is het bovendien belangrijk om het specifieke hartgeleidingssysteem in diermodellen zoals de muis te lokaliseren en te visualiseren, omdat muizen veel worden gebruikt in elektrofysiologisch onderzoek.
De belangrijkste onderdelen van het hartgeleidingssysteem zijn de sinoatriale knoop (SAN), waar de elektrische impuls wordt gegenereerd in gespecialiseerde pacemakercellen, en de atrioventriculaire knoop (AVN), de enige elektrische verbinding tussen de boezems en de ventrikels4. Wanneer de elektrofysiologische eigenschappen van SAN en AVN worden gewijzigd, kunnen aritmieën zoals sick sinus syndroom of atrioventriculaire blok optreden die kunnen leiden tot hemodynamische achteruitgang, syncope en zelfs de dood, en zo de essentiële rol van zowel SAN als AVN in elektrofysiologie en aritmogenese onderstrepen5.
Uitgebreide studies over SAN of AVN vereisen een nauwkeurige lokalisatie en visualisatie van beide structuren, idealiter binnen hun fysiologische omgeving. Vanwege hun kleine omvang en locatie binnen het werkende myocardium, zonder een duidelijke macroscopisch zichtbare structuur vast te stellen, is het bestuderen van de anatomie en elektrofysiologie van SAN en AVN echter een uitdaging. Anatomische oriëntatiepunten kunnen worden gebruikt om ruwweg het gebied te identificeren dat SAN en AVN 6,7,8 bevat. Kortom, SAN bevindt zich in het inter-cavalgebied van het rechter atrium naast de musculaire crista terminalis (CT), AVN bevindt zich in de driehoek van Koch die wordt gevormd door de tricuspidalisklep, het ostium van de coronaire sinus en de pees van Todaro. Tot nu toe werden deze anatomische oriëntatiepunten voornamelijk gebruikt om SAN en AVN als individuele structuren te lokaliseren, te verwijderen en vervolgens te bestuderen (bijvoorbeeld door conventionele histologie). Om de complexe elektrofysiologie van SAN en AVN (bijv. Regulerende effecten van aangrenzende cellen van het werkende myocardium) beter te begrijpen, is het echter noodzakelijk om de geleidingssystemen binnen de fysiologische 3D-omgeving te bestuderen.
Immunofluorescentiekleuring met volledige mount is een methode die wordt gebruikt om anatomische structuren in situ te bestuderen met behoud van de integriteit van het omliggende weefsel9. Gebruikmakend van confocale microscopie- en beeldanalysesoftware, kunnen SAN en AVN worden gevisualiseerd met fluorescerend gelabelde antilichamen die gericht zijn op ionkanalen die specifiek in deze regio's tot expressie komen.
In dit volgende protocol worden de noodzakelijke stappen uitgelegd om een gevestigde kleuringsmethode voor de hele montage uit te voeren voor SAN- en AVN-microscooplokalisatie en -visualisatie. In het bijzonder beschrijft dit protocol hoe (1) SAN en AVN moeten worden gelokaliseerd door anatomische oriëntatiepunten om deze monsters voor te bereiden op kleuring en microscopieanalyse (2) om immunofluorescentiekleuring van de referentiemarkers HCN4 en Cx43 uit te voeren (3) om SAN- en AVN-monsters voor te bereiden voor confocale microscopie (4) om confocale beeldvorming van SAN en AVN uit te voeren. We beschrijven ook hoe dit protocol kan worden aangepast om extra kleuring van omringend werkend myocardium of niet-myocytencellen zoals autonome zenuwvezels op te nemen, wat een grondig onderzoek van het hartgeleidingssysteem in het hart mogelijk maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierverzorging en alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Care and Ethics-commissie van de Universiteit van München, en alle procedures die op muizen werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door de regering van Beieren, München, Duitsland (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J muizen werden gekocht bij Jackson Laboratory.
OPMERKING: Figuur 1 toont de instrumenten die nodig zijn voor het experiment. Figuur 2 toont een illustratie van de grove hartanatomie. Figuur 3 toont de locatie van SAN en AVN in een volwassen muizenhart. Figuur 4 toont het voorbereide monster dat op de confocale microscopie is geladen.
1. Voorbereidingen
- Bereid een 4% formaldehyde-oplossing (4% PFA) door 10 ml 16% formaldehyde-oplossing in 30 ml PBS te verdunnen.
- Bereid een 15% sucrose-oplossing en 30% sucrose-oplossing door respectievelijk 15 g en 30 g sucrosepoeder op te lossen in 100 ml PBS. Nadat het sucrosepoeder volledig is opgelost, filteert u de oplossing met een spuitfilter van 0,2 μm voordat u deze bij 4 °C bewaart.
- Bereid een 3% -4% agarose gel, voeg 3 g of 4 g agarose poeder en 100 ml 1x TAE (verdund uit 50x TAE stock oplossing) toe aan een bekerglas. Plaats het bekerglas op een magneetroerder en kook het tot de agarose volledig is opgelost.
- Bereid de snijschaal door voorzichtig 30 ml agarosegel (3%-4%) in een petrischaal met een diameter van 100 mm te gieten. Laat de petrischaal op de bank op kamertemperatuur liggen om af te koelen en uit te harden.
- Bereid de blokoplossing en de wasoplossing volgens de recepten in tabel 1. Bereid alle oplossingen voor die op de dag van gebruik zijn bereid. Langdurige opslag wordt niet aanbevolen.
- Bereid de antilichaamoplossingen door ze te verdunnen in koude (4 °C) 1x PBS, bescherm de verdunning tegen licht (bijvoorbeeld door aluminiumfolie rond te wikkelen) en bewaar verdunningen op ijs totdat ze worden gebruikt. Verdun de antilichamen kort voor incubatie. Vermijd het achterlaten van de verdunde antilichamen bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De juiste antilichaamverdunning moet worden getest met vergelijkbare weefselmonsters door een conventionele immunofluorescente kleuring uit te voeren. Hier hebben we de antilichamen getest door bevroren secties te kleuren die met een dikte van 10 μm zijn gesneden.
2. Orgaanoogst en weefselvoorbereiding
- Verdoof de muis door hem in een incubatiekamer te plaatsen die is aangesloten op een isofluraanverdamper. Stel de vaporizer in om 4-5% isofluraan (respectievelijk 96-95% zuurstof) te leveren.
OPMERKING: Volledige anesthesie wordt bevestigd door het verlies van de houdingsreactie en de rechtzettingsreflex door de kamer voorzichtig te rollen totdat de muis op zijn rug wordt geplaatst. - Leg de muis in rugligging op de operatietafel. Plaats de muizenneus in een anesthesiemasker dat is aangesloten op een aangepast Bain-circuit met de binnenband aangesloten op de isofluraanverdamper. Om de anesthesie te behouden, gebruikt u 1-2% isofluraan in zuurstof bij een stroomsnelheid van 1 L / min. Ruim overtollige verdovingsdamp van de muis op via de buitenste buis van het masker en trek door een bus actieve kool, die het overtollige verdovingsgas absorbeert.
- Wanneer volledige anesthesie is bereikt, injecteert u fentanyl voor analgesie (0,1 μg/25 g lichaamsgewicht i.p.).
- Wanneer de teen-knijpreflex niet detecteerbaar is, maak dan een duidelijke snede van het jugulum naar de symfyse met behulp van een irisschaar om vacht en huid te verwijderen. Maak nog een snede van links naar rechts onder de ribben met behulp van een irisschaar om de buik voorzichtig te openen.
- Leven de xiphoid een beetje met behulp van gebogen tangen om het diafragma van links naar rechts te snijden zonder organen te verwonden. Knip de ribbenkast aan beide zijden in een mediale oksellijn met een irisschaar om hem craniaal om te draaien en toegang tot het hart mogelijk te maken.
- Knip de inferieure vena cava en dalende thoracale aorta ter hoogte van het diafragma met behulp van een irisschaar. Prik het hart door met een naald van 27 G in het gebied van de top en duw de naald vervolgens voorzichtig in de linker ventrikel (LV). Injecteer voorzichtig 5-10 ml ijskoude PBS in de LV om het hart te doordringen.
OPMERKING: De kleur van het hart moet van rood naar grijs veranderen, wat wijst op een succesvolle perfusie met PBS. - Til de top van het hart voorzichtig op met behulp van een pincet waardoor de grote vaten kunnen worden doorgesneden en het hart kan worden verwijderd.
- Snijd het hart weg door de grote slagaders en aderen zo ver mogelijk van het hart af te snijden om schade aan de superieure vena cava (SVC) te voorkomen. Bewaar de SVC omdat deze tijdens de latere verwerking als belangrijk oriëntatiepunt zal dienen.
- Schakel na het verwijderen van het hart de isofluraanverdamper uit.
- Leg het hart in een dissectieschaal gevuld met ijskoude PBS onder de ontleedmicroscoop. Na bepaling van de linker/rechter en voor/achterkant van het hart, draait u het hart om met de voorkant van het hart aan de onderkant van de schaal (om de grote vaten bloot te leggen die zich achteraan bevinden).
- Immobiliseer het hart door kleine pinnen door de top en het linker atriale aanhangsel (LAA) in de agarose aan de onderkant van de dissectieschaal te plaatsen (figuur 2A). Verwijder met behulp van een fijn pincet en een schaar voorzichtig niet-hartweefsel rond de SVC en inferieure vena cava (IVC) (bijv. Longen, vet, pericardium) om het inter-cavaleriegebied bloot te leggen (figuur 3A).
- Verwijder het grootste deel van de ventrikels door de groef tussen de ventrikels en de boezems parallel te snijden met de microschaar. Bewaar een klein deel van het ventriculaire weefsel voor de latere belasting van de plexiglas ring.
- Voor fixatie en dehydratie, breng het monster (met de atria, SVC en IVC) in 4% PFA 's nachts bij 4 °C.
- Breng de volgende dag het hart over op 15% sucrose-oplossing gedurende 24 uur bij 4 °C.
- Breng de volgende dag het hart over op 30% sucrose-oplossing gedurende 24 uur bij 4 °C.
OPMERKING: Voor de fixatie en dehydratatie in stap 2.13, 2.14 en 2.15 worden de monsters bij 4°C gelaten zonder verder te roeren of te schommelen.
3. Immunofluorescentiekleuring met volledige montering
- Was het hart in 1% Triton X-100 verdund in PBS en blok en permeabiliseer in blokoplossing (tabel 1) 's nachts bij 4 °C.
- Plaats het hart in een buis van 1,5 ml en incubeer met konijnen-antimuis connexine-43 (verdunning van 1:200) en rat anti-muis HCN4 (verdunning van 1:200) antilichamen verdund met blokkerende oplossing gedurende 7 dagen bij 4 °C.
OPMERKING: De optimale concentratie van primaire antilichamen moet worden getest voordat de datasheets als oriëntatie worden gebruikt. Andere antigenen van belang kunnen ook in deze stap worden gekleurd, zolang de gastheersoort van het primaire antigeen anders is dan de andere. Een hogere concentratie Triton X-100 kan helpen bij het verkrijgen van efficiëntere antilichaamkleuring zoals aangetoond vóór10, maar de concentratie kan individueel worden bepaald. - Verwijder na 7 dagen de oplossing met primaire antilichamen met behulp van een pipet en was het hart 3 keer met 1% Triton X-100-oplossing (telkens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op de orbitale shaker).
- Incubeer na het wassen het hart = met Alexa Fluor 488 geitenanti-rat IgG (verdunning van 1:200) en Alexa Fluor 647 geiten anti-konijn IgG (verdunning van 1:200) gedurende 7 dagen bij 4 °C.
- Verwijder na 7 dagen alle oplossing die de secundaire antilichamen bevat met behulp van een pipet. Was vervolgens het hart met een wasoplossing (tabel 1) 3 keer (telkens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op de orbitale shaker).
- Om kernen te kleuren, incubeer het hart in DAPI-oplossing (10 μg / ml) 's nachts bij 4 °C.
- Was het hart de volgende dag 3 keer met wasoplossing (telkens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op de orbitale shaker).
OPMERKING: Voor de blokkering, permeabilisatie, incubatie van antilichamen en DAPI-kleuring in stap 3.1, 3.2, 3.4 en 3.6, laat de monsters op steady state in de 4 °C, er hoeft niet te worden geroerd. Het gekleurde weefsel kon volledig worden bewaard met wasoplossing bij 4 °C en gedurende enkele dagen worden beschermd tegen licht totdat het in beeld werd gebracht met de confocale microscoop.
4. Confocale microscopie
- Plexiglas ringen bereiden en vullen met plasticine (figuur 1). In het midden van de plasticine wordt een kleine groef gevormd in het midden voor het laden van het hart. Maak een ondiepe groef, omdat dit gemakkelijker zou zijn om een plat beeldvlak te verkrijgen, en om de ruimte aan te passen en luchtbellen tussen het monster en de coverslips in stap 4.4 te voorkomen.
- Gebruik hetzelfde hartmonster voor de beeldvorming van zowel SAN als AVN sequentieel. Voor SAN-beeldvorming laadt u het hart rechtstreeks, terwijl u voor AVN-beeldvorming eerder microdissectie uitvoert.
- SAN-beeldvorming
- Identificeer het SAN aan de hand van anatomische oriëntatiepunten: het bevindt zich aan de dorsale kant van het hart in het inter-cavalgebied (het gebied tussen de superieure en inferieure vena cava). De crista terminalis (CT) is de spierstreak tussen het SAN en RAA.
- Plaats het hart in de plasticinegroef met de achterkant van het hart naar boven gericht. Voeg PBS toe aan het hart om alle lucht in de holte te verplaatsen totdat het hart volledig bedekt is met PBS (meestal zijn een paar druppels PBS voldoende).
- Druk onder de dissectiemicroscoop voorzichtig de RAA, LAA en de resterende delen van de linker ventrikel in de plasticine om het hart te fixeren. Zorg ervoor dat de hele inter-caval regio en de crista terminalis duidelijk zichtbaar waren (niet bedekt door plasticine). Het gebied dat in beeld wordt gebracht, wordt weergegeven in figuur 3A.
- AVN-beeldvorming
- Nadat u de beeldvorming van SAN hebt voltooid, herinnert u hetzelfde monster en gebruikt u het vervolgens voor de AVN-beeldvorming. Plaats voor AVN-microdissectie het hart = op een dissectieschaal onder de dissectiemicroscoop.
- Oriënteer het hart met de rechterkant naar boven gericht (inclusief de resterende delen van de rechter ventrikel). Steek pennen door het resterende deel van de LV-vrije wand (die nu aan de onderkant zit) om het weefsel te immobiliseren (figuur 2B).
- Snijd de resterende RV-vrije wand naar boven door de tricuspidalisklep en superieure vena cava. Draai vervolgens de RV en RA weg om het interventriculaire en interatriale septum bloot te leggen. (Figuur 3B)
OPMERKING: Let op dat u de coronaire sinus (CS) niet beschadigt, omdat het een belangrijk anatomisch oriëntatiepunt is om de driehoek van Koch te vinden die vervolgens de AVN kan lokaliseren. De CS loopt dwars in de linker atrioventriculaire groef aan de achterste kant van het hart, en de CS-opening bevindt zich tussen IVC en de tricuspidalisklep op het inferieure deel van het interatriale septum (figuur 3A en B). - Identificeer de driehoek van Koch die te vinden is op het endocardiale oppervlak van het rechter atrium, vooraan begrensd door de scharnierlijn van de septumfolder van de tricuspidalisklep (TV), en achterstevoren door de pees van Todaro. De basis wordt gevormd door de opening van de coronaire sinus (figuur 3B). Aangezien dit het doelgebied is voor AVN-beeldvorming, moet het duidelijk zichtbaar zijn.
- Breng het hart over in de plasticinegroef in de plexiglas ring met de driehoek van Koch duidelijk bloot (d.w.z. niet bedekt met plasticine). Druk het weefsel rond de Koch-driehoek voorzichtig in de plasticine om het monster te fixeren. Voeg PBS toe aan het hart om alle lucht in de holte te verplaatsen totdat het hart volledig bedekt is met PBS (meestal zijn een paar druppels PBS voldoende).
- SAN-beeldvorming
- Breng siliconen aan op de randen van de plexiglas ringen om de harten die in de met plasticine gevulde plexiglas ringen zijn geladen, te kunnen bedekken met afdekslips.
- Druk voorzichtig op de achterkant van de plasticine om delen van de PBS eruit te persen en het hart aan de coverslip te bevestigen terwijl luchtbellen in het beeldgebied worden vermeden.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de interessante gebieden niet worden gevouwen en bedekt tijdens het indrukken van de achterkant van de plasticine. Een plat beeldvormingsvlak zonder monsterovercompressie is noodzakelijk voor het behoud van de anatomie en voor een goede confocale beeldvorming van de monsters. Voor SAN is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de inter-caval regio duidelijk wordt blootgesteld. Voor AVN moet de driehoek van Koch volledig worden blootgelegd. - Leg de kleuringsmonsters van de hele montage ondersteboven op het platform van de confocale microscoop. De blootgestelde SAN/AVN die aan de afdekslip is bevestigd, bevindt zich nu aan de onderkant van het microscoopplatform (figuur 4).
OPMERKING: Om foto's te maken, gebruiken we de Carl Zeiss LSM800 met Airyscan Unit en de software ZEN 2.3 SP1 zwart. - Kies plaat "BP420-480 + LP605" voor de excitatie van Alexa Fluor 647 geconjugeerde anti-HCN4. Varieer de master gain van 650-750.
- Maak een overzichtsafbeelding van het hele SAN- en AVN-gebied met behulp van de tile scan-functie . Selecteer vervolgens het HCN4-positieve gebied door op de overzichtsafbeelding te klikken en een vierkant toe te voegen rond het interessegebied dat wordt gescand.
- Controleer de parameters, inclusief platen en master gain voor de resterende kanalen (Alexa Fluor 488 en DAPI) van de confocale microscoop en stel in zoals beschreven in stap 4.6.
- Pas de focus langzaam aan van boven naar beneden van het voorbeeld om een voorbeeld van het hele voorbeeld te bekijken en het bereik Eerste en Laatste in te stellen voor het Z-stackbereik. Stel een optimaal interval in voor de Z-stack op basis van de dikte van het optische monster. We gebruiken een 20x objectief en 0,8-1 μm als interval voor Z-stack.
- Nadat alle parameters correct zijn ingesteld, scant u het hele gebied van het SAN en AVN.
- Voer een 3D-reconstructie van de afbeeldingen uit met behulp van software (bijv. Imaris versie 8.4.2).
- Selecteer Beeldverwerking | Baseline Aftrekken om achtergrondvlekken te verwijderen.
- Selecteer het maken van oppervlakken op de instelling voor het geselecteerde kanaal en de regio die van belang is voor verwerking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door gebruik te maken van het hierboven beschreven protocol kan confocale microscopie beeldvorming van zowel SAN als AVN betrouwbaar worden uitgevoerd. Specifieke kleuring van het geleidingssysteem met behulp van fluorescerende antilichamen gericht op HCN4 en kleuring van het werkende myocardium met behulp van fluorescerende antilichamen gericht op Cx43 maakt de duidelijke identificatie van SAN (figuur 5, video 1) en AVN (figuur 6, video 2) binnen de intacte anatomie mogelijk.
Figuur 1: Instrumenten voor dissectie en plexiglas ringhouder. A. Plexiglas ring gevuld met plasticine (rode pijl toont de groef gevormd in het midden voor het laden van het hart). B. Dissectie Petrischaal met agarose gel. C. Voorjaarsschaar. D. Iris schaar. E. Gebogen tang. F. Fijne tang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Illustratie van de grove cardiale anatomie. A. Schematische illustratie van de SAN-microdissectie. Pinnen worden aangebracht door de top en het linker atriale aanhangsel (LAA). SAN wordt aangegeven door een rode cirkel met stippen. B. Schematische illustratie van de AVN-microdissectie. Pinnen worden door het resterende deel van de LV-vrije muur (die nu aan de onderkant zit) geplaatst. AVN wordt aangegeven door een rode cirkel met stippen. SVC, Superieure vena cava; IVC, inferieure vena cava; CS, coronaire sinus; LAA, linker atriumaanhangsel; RAA, rechter atriumaanhangsel; PA, longslagader; PV, longader; LV, linker ventrikel; IVS, interventriculair septum; IAS, interatrieel septum; VAN, ovale fossa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Locatie van SAN en AVN in een volwassen muizenhart. A. Locatie van de sinoatriale knoop (SAN) in een volwassen muizenhart. Uitzicht vanuit het achterhoofd. De locatie van het SAN wordt aangegeven met een rode stippellijn binnen het inter-cavalgebied (zwarte stippellijnen). SVC, Superieure vena cava; IVC, inferieure vena cava; CS, coronaire sinus; LAA, linker atriumaanhangsel; RAA, rechter atriumaanhangsel; PV, longader; CT, Crista terminalis; LV, linker ventrikel; RV, rechter ventrikel. B. Locatie van de atrioventriculaire knoop (AVN) in een volwassen muizenhart. Uitzicht van rechts. De AVN (rode stippelcirkel) bevindt zich aan de top van de driehoek van Koch (witte stippelvormige driehoek) aan de onderkant van het vliezige septum. De driehoek van Koch wordt gevormd door de pees van Todaro (TT, groene stippellijn), tricuspidalisklep (TV, blauwe stippellijn) en de opening van de coronaire sinus (CS, gele stippellijn). SVC, superieure vena cava; IVC, inferieure vena cava; IVS, interventriculair septum; VAN, ovale fossa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbereid monster geladen op de confocale microscopie. A. Het voorbereide monster (rode pijl) voor confocale microscopie gemonteerd in de plexiglas ring met plasticine (zwarte pijl). Uitzicht vanaf de onderkant. B. Plexiglas ring met gemonteerd monster geladen up-side-down op het platform van de confocale microscoop (inverse microscoop). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Reconstructie van confocale microscopie beeldvorming van SAN in een C57BL6/J muis gekleurd met anti-HCN4 (rood) en Cx43 (wit) antilichamen. Een. Het stippelgebied bakent het SAN af, dat is georiënteerd langs het inter-cavalgebied tussen de superieure en inferieure vena cava. B. Vergroting van de inlay van paneel A. C. 3D reconstructie van paneel B. RAA, rechter atrium aanhangsel; RA, rechter atrium; SAN, sinoatriaal knooppunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Reconstructie van confocale microscopie beeldvorming van AVN in een C57BL6/J muis gekleurd met anti-HCN4 (rood) en Cx43 (wit) antilichamen. Een. Onderbroken gebied geeft de AVN. B. Vergroting van de inlay van paneel A. C. 3D reconstructie van paneel B. IVS, interventriculair septum; IAS, interatrieel septum; AVN, atrioventriculaire knoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Negatief controlebeeld. Een. negatieve controle hele montage vlekken voor SAN. De stippelcirkel toonde het SAN-gebied dat werd bevestigd door de anatomie-oriëntatiepunten. B. negatieve controlekleuring voor SAN alleen met tweede antilichamen. C. DAPI-kleuring voor SAN. D. negatieve controle hele montage vlekken voor AVN. De stippelcirkel toonde het AVN-gebied dat werd bevestigd door de anatomie-oriëntatiepunten. E. negatieve controlekleuring voor AVN alleen met tweede antilichamen. F. DAPI-kleuring voor AVN. RAA, rechter atriumaanhangsel; RA, rechter atrium; SVC, superieure vena cava; IVS, interventriculair septum; IAS, interatrieel septum; Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: 3D Reconstructie van het SAN Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: 3D Reconstructie van de AVN Klik hier om deze video te downloaden.
| Verbinding | Eindconcentratie | g of ml/100 ml vereist | |
| Oplossing voor bevestiging | |||
| Formaldehyde (16%) | 4% | 25 ml | |
| Pbs (1x) | 75 ml | ||
| 1% Triton oplossing | |||
| Triton X100 | 1% | 1 ml | |
| PBS | 99 ml | ||
| Oplossing blokkeren | |||
| Triton X-100 | 1% | 1 ml | |
| BSA | 0.50% | 0,5 g | |
| Normaal geitenserum | 20% | 20 ml | |
| Pbs (1x) | 89 ml | ||
| Wasoplossing | |||
| Tween 20 | 0.10% | 0,1 ml | |
| BSA | 0.50% | 0,5 g | |
| Pbs (1x) | 99,9 ml | ||
| Tae (50x) | |||
| Tris-basis | 24.20% | 24,2 g | |
| 100% azijnzuur | 5.71% | 5,71 ml | |
| 0,5 M EDTA | 0,05 m | 10 ml | |
| dH2O | Voeg tot 100 ml toe | ||
Tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cardiale anatomie is van oudsher bestudeerd met behulp van dunne histologische secties11. Deze methoden behouden echter niet de driedimensionale structuur van het geleidingssysteem en bieden dus alleen 2D-informatie. Het hier beschreven immunofluorescentiekleuringsprotocol met volledige mount maakt het mogelijk om deze beperkingen te overwinnen en kan routinematig worden gebruikt voor SAN- en AVN-beeldvorming.
In vergelijking met standaardmethoden zoals conventionele immunohistochemie die paraffine-inbedding, sectie en antigeen ophalen vereisen, is de whole-mount-methodologie voordelig voor het aanpakken van de exacte 3D-lokalisatie en morfologie van SAN en AVN, en om de relatie met het omliggende weefsel te onderzoeken, omdat de weefselmorfologie aanzienlijk behouden blijft met slechts minimale weefseluitdroging en fysieke breuk. Ook de immunoreactiviteit (d.w.z. de binding van antilichamen aan weefselantigenen) wordt ook sterk gehandhaafd.
We hebben een praktische monsterprocessiemethode voor confocale microscopie vastgesteld met behulp van een op een plastic ring gemonteerde houder gevuld met plasticine12,13. Plasticine is ideaal omdat het individueel kan worden aangepast aan de grootte van het weefsel, het is moeilijk genoeg om het weefsel betrouwbaar vast te houden zonder overmatige druk van het weefsel. Het belangrijkste is dat het niet fluorescerend is, waardoor de auto-fluorescerende achtergrond wordt vermeden en daarom het fluorescerende signaal van de gebruikte antilichamen niet wordt verstoord.
We gebruikten de confocale laserscanmicroscoop (LSM-Zeiss) met de Airyscan-detector, die een duidelijk voordeel kan bieden bij het verkrijgen van beelden van hoge kwaliteit. Het gebruik van een widefield imaging microscoop kan alleen informatie op weefselniveau bieden, maar mist cellulaire resolutie. Bovendien brengt de widefieldmicroscoop een risico met zich mee van hoge achtergrond14. Door gebruik te maken van een Airyscan detector voor confocale LSM kan een verbeterde resolutie en signaal-ruisverhouding (SNR) worden verkregen, vergeleken met het traditionele one pinhole-and-detector confocale beeldvormingssysteem15.
De vormen en positie van SAN en AVN worden gepresenteerd als 3D-reconstructie en aanvullende virtuele sectievlakken afgeleid van 3D-reconstructie kunnen de interpretatie van histologische secties verbeteren, terwijl conventionele histologie alleen een 2D-beoordeling van de anatomie mogelijk maakt met het inherente risico van niet-detectie van kleine maar relevante structuren. Bovendien biedt 3D-reconstructie de mogelijkheid om anatomische structuren van belang transmuraal en binnen de intacte micro-omgeving te onderzoeken, bijvoorbeeld intrinsiek autonomisch zenuwplex dat het hart innerveert16. Whole mount in situ kleuring en 3D-reconstructie maken onderzoek van de cellulaire omgeving mogelijk, evenals de specifieke celtypen en hun oriëntatie. Bovendien kan regionale en celtypespecifieke eiwitexpressie worden gevisualiseerd en kan het western blot- en proteomics-analyses verder ondersteunen17.
SAN en AVN zijn gespecialiseerde structuren in het hart met een verschillend expressiepatroon van ionkanalen en connexinen die kunnen worden gebruikt voor betrouwbare identificatie10,18. Hyperpolarisatie-geactiveerde cyclische nucleotide-gated kationkanalen (HCN) bepalen de diastolische depolarisatie in pacemakercellen en worden daarom specifiek uitgedrukt binnen het geleidingssysteem met HCN4 als de overheersende isovorm in de muis19. Studies hebben aangetoond dat HCN4 een van de detecteerbare en stabiel tot expressie gebrachte HCN-isovormen is in de SAN en AVN11,20. Connexinen verbinden direct naburige cellen en maken de doorgang van ionen van cel naar cel mogelijk; ze zijn daarom essentieel voor de geleiding van de elektrische impuls door het hart21. Connexin-expressiepatronen variëren tussen verschillende regio's in het hart, waarbij Cx43 de meest voorkomende isovorm is die in bijna alle delen van het hart is gevonden, behalve de SAN en AVN22. Het combineren van microdissectie om blootstelling van specifieke interessegebieden mogelijk te maken met anti-HCN4- en anti-CX43-antilichamen, evenals in silico-benaderingen voor driedimensionale reconstructie van confocale beelden, maakt betrouwbare identificatie van SAN en AVN mogelijk en tot uitgebreid onderzoek van de SAN / AVN-morfologie en hun interactie met het omliggende weefsel.
De SAN en AVN kunnen gemakkelijk te onderscheiden zijn na kleuring met een specifiek antilichaam. Om het SAN en AVN te lokaliseren door hun anatomische oriëntatiepunten, is echter enige oefening nodig voordat de juiste microdissectie kan worden uitgevoerd.
Met behulp van het bovenstaande protocol kunnen ook een aantal andere antigenen worden toegepast. Het protocol werkt ook goed op zowel perfusie-vast als onderdompelingsgefixeerd weefsel. De incubatietijd kan echter worden aangepast voor optimale fixatie, omdat bepaalde antilichamen een verminderde immunoreactiviteit vertonen wanneer het antigeen overfixeerd is. Aangezien de whole-mount kleuringsbenadering 7 dagen nodig heeft voor primaire en secundaire antilichaamincubatie, is het belangrijk om de monsters volledig onder te dompelen in voldoende volumes antilichaambevattende oplossingen. De verdunningsverhouding van elk antilichaam moet vóór het experiment worden getest. Voor een optimale kleuring moet elk irrelevant weefsel worden verwijderd. Voor het protocol hebben we alleen kleine delen van de ventrikels bewaard voor een betere oriëntatie en al het omliggende vetweefsel en longaders verwijderd, omdat omringend (irrelevant) weefsel ook antilichamen kan binden, vooral wanneer de doelantigenen globaal tot expressie komen.
Whole-mount in situ staining, confocale beeldvorming en 3D-reconstructie is een onschatbare en krachtige techniek voor onderzoekers uit verschillende vakgebieden. De methode heeft echter ook enkele beperkingen. (i) Het vereist gespecialiseerde apparatuur zoals een confocale microscoop die niet algemeen verkrijgbaar is bij elke instelling. (ii) Zoals hierboven vermeld, vereist microdissectie van gespecialiseerde anatomische structuren zoals het SAN of AVN, maar ook confocale beeldvorming en post-imaging verwerking intensief oefenend en ervaren personeel. (iii) Het succes van de methode hangt sterk af van de kwaliteit van de gebruikte antilichamen en kan daarom in sommige gevallen zeer uitdagend zijn. Ook (iv) 3D-reconstructie kan moeilijk te bereiken zijn en kan intensieve probleemoplossing vereisen om de procedure te optimaliseren. Er moeten bijvoorbeeld optimale intervallen worden ingesteld tijdens het verkrijgen van afbeeldingen, omdat secties die te ver uit elkaar staan, gaten achterlaten en mogelijk geen adequate 3D-reconstructie van de anatomie mogelijk maken. Secties die te dicht bij elkaar liggen, kunnen oversampling en bleken veroorzaken vanwege de overmatige verlichting en het duurt lang om één afbeelding te voltooien. Ten slotte (v) is de belangrijkste beperking van confocale microscopie de beelddiepte, wat betekent dat als de monsterdikte groter is dan de maximale bedrijfsdiepte van de confocale microscoop, de verdere fluorofoor niet kan worden gedetecteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de China Scholarship Council (CSC, aan R. Xia), het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK; 81X2600255 aan S. Clauss, 81Z0600206 aan S. Kääb), de Corona Foundation (S199/10079/2019 aan S. Clauss), de SFB 914 (project Z01 tot H. Ishikawa-Ankerhold en S. Massberg en project A10 tot C. Schulz), het ERA-NET over hart- en vaatziekten (ERA-CVD; 01KL1910 aan S. Clauss) en de Heinrich-en-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (aan S. Clauss). De financiers hadden geen rol in de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglass ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |
References
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al.
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L.
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
- Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
Tags
Geneeskunde Nummer 166 Sinoatriale knoop Atrioventriculaire knoop Cardiologie elektrofysiologie hartgeleidingssysteem Microdissectie Immunofluorescentie Confocale microscopieErratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
