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Immunology and Infection

Imunização Intranasal e Coleta de Leite em Estudos de Imunização Materna em Coelhos Brancos da Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus)

Published: July 31, 2021 doi: 10.3791/62317
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 2,3,4
1Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, 2Department of Pathology, Duke University Medical Center, 3Department of Immunology, Duke University Medical Center, 4Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Summary

Este artigo descreve e demonstra a administração de vacinas intranasais e a coleta de leite de coelhos lactadores (Oryctolagus cuniculus) como forma de avaliar a imunidade mucosa em um modelo translacionalmente apropriado de imunização materna.

Abstract

Devido às semelhanças na placenta e transferência de anticorpos com humanos, os coelhos são um excelente modelo de imunização materna. Outras vantagens deste modelo de pesquisa são a facilidade de reprodução e coleta de amostras, período de gestação relativamente curto e grandes tamanhos de lixo. As rotas comumente avaliadas de imunização incluem subcutânea, intramuscular, intranasal e intradérmica. A coleta de amostras não terminais para a detecção cronológica das respostas imunológicas a essas imunizações incluem a coleta de sangue, tanto de barragens quanto de kits, e leite da lactação. Neste artigo, demonstraremos técnicas que nosso laboratório tem utilizado em estudos de imunização materna em coelhos brancos da Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus), incluindo imunização intranasal e coleta de leite.

Introduction

Estudos de imunização materna e transferência de anticorpos são inestimáveis por inúmeras razões, pois esta é a rota inicial de transferência de imunidade e posterior proteção contra patógenos e doenças em recém-nascidos e bebês. A imunização materna tem o potencial de impactar positivamente a saúde materno-infantil em nível global, reduzindo a morbidade e a mortalidade associadas a certos patógenos durante este período vulnerável1. O principal objetivo dessa estratégia é aumentar os níveis de anticorpos maternos específicos ao longo da gravidez. Esses anticorpos podem então ser transferidos para o recém-nascido e o bebê em níveis suficientes para proteger contra infecções até que seu sistema imunológico esteja maduro o suficiente para responder adequadamente aos desafios1,2,3. Trabalhos anteriores demonstraram que os maiores títulos de anticorpos ao nascer estão associados à proteção completa ou a um início de início atrasado e à redução da gravidade de inúmeras doenças infecciosas diferentes no recém-nascido, incluindo tétano, coqueluche, vírus sincicial respiratório (RSV), influenza e infecções estreptocócicas do grupo B1,2,3.

Em humanos, os anticorpos maternos são transferidos passivamente através da placenta e também são transferidos através do leite materno via enfermagem. Trabalhos anteriores demonstraram que os níveis de IgA específicos do HIV no leite materno humano de mães infectadas pelo vírus estavam associados à redução da transmissão pós-natal do vírus, sugerindo um papel protetor para o leite materno anti-HIV IgA4. Estudos em primatas não humanos demonstraram que a imunização contra o HIV pode induzir uma resposta significativa de anticorpos no leite materno, e embora respostas semelhantes de IgG sérico tenham sido induzidas após a imunização sistêmica versus mucosa, a imunização mucosa induziu uma resposta de IgA significativamente maior dentro do leite5,6.

A identificação de um modelo animal traduções apropriados para esses estudos deve levar em conta o tipo de placentação e mecanismos de transferência passiva de anticorpos, bem como a transferência de anticorpos através do leite materno. Existem três tipos principais de placenta em mamíferos baseados nos tipos de tecidos e camadas na interface materno-fetal, incluindo hemocolar (primatas, roedores e coelhos), endoteliococorar (carnívoros) e epiteliocorial (cavalos, porcos e ruminantes). A placenta hemocolarial é o tipo mais invasivo, permitindo a comunicação direta entre o suprimento de sangue materno e o chorão, ou a membrana fetal mais externa. Com base no número de camadas de trophoblasto, há várias variações de placenta hemocolarial, incluindo a placenta hemomonochorial encontrada em primatas, a placenta hemodichorial em coelhos e a placenta hemotrichorial observada em ratos e camundongos7. Esse contato direto entre o suprimento de sangue materno e a corão permite a transferência passiva de anticorpos através da placenta durante a gestação. O IgG é a única classe de anticorpos que cruza significativamente a placenta humana8, enquanto o IgA é a classe predominante de Ig encontrada no leite materno humano9. Dos modelos cientificamente relevantes, apenas primatas (incluindo humanos), coelhos e cobaias transferem IgG no útero e IgA no leite10,11. Portanto, o modelo coelho incorpora fatores comparáveis aos humanos que controlam a transferência transplacental do IgG e a transferência lactoracional de IgA.

Além de servirem como modelo excepcional para imunidade materna e desenvolvimento vacinal, semelhanças entre o coelho e as cavidades nasais humanas fazem deles um modelo adequado para a imunização intranasal. O volume da cavidade nasal do coelho é mais semelhante aos humanos do que os modelos de roedores baseados na massa relativa do corpo12. Além disso, Casteleyn et al. 12 demonstraram que o tecido linfoide associado nasal (NALT) é mais volumoso no coelho em comparação com roedores. O NALT está localizado principalmente no aspecto ventral e ventromedial do meatus nasal ventral e no aspecto lateral e dorsolateral do meatus nasofaríngeo em coelhos, enquanto nos roedores, o tecido linfoide só está presente ao longo do aspecto ventral da carne nasofaríngea12. Em coelhos, a estrutura e a localização dos linfócitos intraepithelial e lamina propria, bem como os folículos linfoides isolados, são semelhantes aos humanos12.

Vantagens adicionais de usar o coelho como modelo de imunidade materna e mucosa incluem sua alta fecundidade e período de gestação relativamente curto. Grandes vasos sanguíneos auriculares permitem acesso relativamente fácil a grandes volumes de sangue para coletas seriais. Uma variedade de amostras mucosas podem ser coletadas para ensaios de resposta a anticorpos específicos de antígeno, incluindo leite materno13 (quando lactante), secreções mucosas ou lavagens (por exemplo, oral14,15,16, lavagem broncoalveolar13,17,18,19, vaginal20,21,22), e fezes20,23,24,25. As amostras de leite podem ser facilmente coletadas durante a lactação para avaliar a presença de respostas de anticorpos específicos de antígeno. Embora não seja tão abundante quanto para humanos e camundongos, uma grande variedade de reagentes experimentais estão disponíveis para estudos e ensaios específicos de coelhos. Neste artigo, descreveremos e demonstraremos a imunização intranasal e a coleta de leite em coelhos brancos da Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus).

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Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados e realizados de acordo com as políticas da Universidade Duke IACUC.

NOTA: Os materiais necessários são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Sedação de Coelho e Anestesia

  1. Sedar o coelho fêmea (sexualmente maduro; aproximadamente 5-30 meses de idade) administrando acepromazina intramuscularmente (IM) a uma dose de 1 mg/kg. Dependendo do tamanho do animal, use uma seringa de 1 ou 3 mL com uma agulha de 25 G. Os músculos epaxiais são o local preferido da injeção intramuscular.
    NOTA: A acepromazina também pode ser administrada subcutâneamente, mas o IM é preferido pelo laboratório, pois age mais rapidamente e reduz a incidência de lesões cutâneas.
  2. Aguarde de 10 a 15 minutos para permitir que a acepromazina faça efeito.
  3. Anestesiar o coelho com isoflurane colocando o cone do nariz conectado sobre o nariz do animal. Ajuste o vaporizador para até 4% de isoflurane combinado com oxigênio de até 4 litros/minuto. Coelhos têm alta aversão ao isoflurane, por isso a contenção adequada é necessária ao mascarar o animal.
  4. Uma vez totalmente anestesiado, conforme avaliado pelo pináculo, pedal e/ou reflexo palpebral, aplique lubrificante oftálmico em cada olho para evitar a secagem dos olhos e posterior ulceração córnea.
  5. Monitore continuamente os reflexos e a respiração durante a anestesia, e reduza a taxa de isoflurane para 1-2% uma vez que um plano adequado de anestesia tenha sido atingido.

2. Imunização intranasal

  1. Prepare a solução de imunização antes do manuseio de animais.
  2. Sedar o coelho como descrito acima.
  3. Uma vez que o membro do laboratório esteja pronto para administrar a vacina e o coelho esteja em um plano adequado de anestesia, desligue o isoflurane e o oxigênio e remova o cone do nariz.
  4. Coloque o coelho em recumbência dorsal, e apoie o pescoço e a cabeça em um ângulo aproximado de 45° que permite fácil acesso e visualização de ambos os nares pelo membro do laboratório que administra a vacina.
  5. Carregue a pipeta com no máximo 100 μL da solução vacinal e administre rapidamente a solução em cada narina. A pipeta deve ser mantida em um ângulo aproximado de 45°, em ângulo em direção ao aspecto medial da passagem nasal.
    NOTA: O objetivo da imunização é que a solução entre em contato com a membrana mucosa dos nares, de modo que a ponta não deve ser colocada dentro das nares, pois isso pode resultar em abrasão ou irritação dos tecidos mucosos e potencialmente influenciar a imunogenicidade da vacina administrada nasalmente. A vacina deve ser administrada rapidamente e feita da mesma forma na outra nare.
  6. Seguindo a administração em ambas as passagens nasais, mantenha o coelho em recumbência dorsal por 30 segundos para minimizar o vazamento da solução vacinal.
    NOTA: O laboratório normalmente não administrará mais de 100 μL por narina por vez. Se um volume maior for administrado, com um total máximo de 500 μL, a vacina pode ser dada em alíquotas de 100 μL com um período de descanso de 30 segundos entre as imunizações, e administrações adicionais da vacina repetidas, com 30 segundos de descanso entre cada administração, até que o volume total da vacina seja entregue.
  7. Após a imunização, coloque o coelho no ventrum para recuperação e monitore de perto o animal até que ele possa manter a recumbência severa.

3. Coleta de leite

  1. Sedar o coelho lactado como descrito acima.
  2. Limpe a pele sobre a veia marginal da orelha com o cotonete/limpeza de álcool.
  3. Usando uma seringa de 1 mL e agulha de 25 g, administre aproximadamente 1-2 UI de ocitocina por via intravenosa através da veia auditiva marginal para induzir a desapontamento do leite.
    NOTA: Devido ao relaxamento muscular suave, é comum que o coelho urinar ou defecar após a administração da ocitocina.
  4. Após a administração da ocitocina, aplique pressão no local da injeção com o pedaço de gaze.
  5. Enquanto mantém a máscara de anestesia sobre o nariz do coelho, apoie o coelho em seu traseiro.
    NOTA: A coleta de leite também pode ser realizada com o animal em recumbência lateral, mas o laboratório descobre que a coleta é mais fácil quando o coelho é apoiado em sua garupa com um assistente segurando o coelho ereto com a máscara de anestesia.
  6. Abra o tubo estéril para preparar para a coleta de leite e localizar o tecido mamário e as associadas. As são tipicamente cercadas por peles molhadas da enfermagem recente, e o tecido mamário é facilmente palpável quando cheio de leite.
  7. Segure o tecido mamário associado a uma entre o polegar e o indicador e aplique uma pressão suave e massageada no tecido glandular na direção da. Coloque o tubo de coleta sobre a para coletar o leite expresso.
    NOTA: Às vezes pode levar vários minutos para que a ocitocina seja eficaz, e a produção de leite parece variar entre as glândulas mamárias. Se a expressão do leite não for bem sucedida, espere vários minutos ou gire para as glândulas mamárias adicionais. O leite de todas as pode ser coletado no mesmo frasco. Normalmente, vários mililitros de leite podem ser facilmente coletados de um doe lactante.
  8. Após a coleta de leite, desligue o isoflurane e o oxigênio, e permita que o coelho se recupere enquanto é monitorado de perto até que o animal seja capaz de manter a recumbência severa.

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Representative Results

Uma visão geral de um desenho típico do estudo de imunização intranasal materna é retratada na Figura 1, incorporando as imunizações, reprodução, kindling, lactação e transferência de anticorpos. Embora não ilustrado, o sangue deve ser coletado antes da imunização inicial para medições de linha de base e durante todo o restante do estudo em intervalos regulares. O sangue é facilmente obtido através da artéria do ouvido central com sedação leve e um agente analgésico tópico (por exemplo, lidocaína 2,5% e creme prilocaine 2,5%). A presença de níveis de IgG específicos de antígeno pode ser medida nestas amostras. Coelhos fêmeas são imunizados pela via intranasal, conforme descrito no protocolo e demonstrado no vídeo. Dependendo do estudo, a vacina pode exigir um impulso ou pode precisar ser dada através de uma rota adicional (por exemplo, intramuscular ou subcutânea). Após a iniciação do estudo, os coelhos são criados; preferimos comprar criadores comprovados de fornecedores para usar para garantir uma maior taxa de gravidez para esses estudos. Dependendo do cronograma de imunização, os coelhos podem receber imunizações adicionais durante a gravidez. IgG específico para antígeno é transferido transplacently para os kits, e em aproximadamente 30-32 dias após a reprodução, a gestante faz kindle. Recomendamos limitar o manuseio de kits nos primeiros dias para minimizar a rejeição dos faz. Amostras de sangue podem ser coletadas dos kits para avaliar os níveis de IgG específicos do antígeno que foram transferidos transplacentalmente(Figura 3). Além de uma grande variedade de nutrientes, os kits recebem IgA do xixi enquanto amamentam. Os kits são tipicamente desmamados em 4-8 semanas, mas antes do desmamar, o leite pode ser facilmente coletado de lactantes faz, como demonstrado no vídeo. As amostras de leite coletadas podem então ser processadas para a detecção dos níveis de IgA total e específico do antígeno(Figura 4). Dependendo do estudo, as vacinas (+/- boosts) podem ser administradas nos kits, e amostras de sangue serial podem ser coletadas dos kits muito cedo usando a veia safena lateral.

Para estudos maternos, determinar a gravidez o mais cedo possível é útil para o desenho do estudo e para garantir que o doe não precise ser ressarcido. As medidas de progesterona podem ser usadas como um meio de detectar a gravidez. Como mostrado na Figura 2,níveis elevados de progesterona podem ser detectados em coelhos grávidas em comparação com coelhos não gestantes, mesmo após acasalamentos por um dólar foram confirmados para todos. Existem métodos adicionais para detecção de gravidez, incluindo palpação manual, ultrassom e radiografias; no entanto, estes requerem equipamentos pessoais e adequados bem treinados.

IgG específico de antígeno que foi transferido transplacentalmente enquanto no útero pode ser medido no soro de kits. O sangue pode ser coletado de um pequeno número de kits na hora ou perto do nascimento para avaliar os níveis precoces de anticorpos específicos do antígeno, mas a coleta de sangue serial é tecnicamente muito mais fácil à medida que a idade e aumento dos kits é tamanho. Conforme descrito na Figura 3,os níveis de soro de IgG específicos de antígeno nos kits podem ser medidos pela ELISA e comparados aos níveis maternos. Os níveis de IgG transferidos maternamente tendem a ser mais elevados ao nascer e diminuir ao longo do tempo.

Como um tipo de amostra mucosa, o leite pode ser coletado e processado para medir os níveis totais ou específicos de anticorpos. Como mostrado na Figura 4,o IgA compõe uma parte significativa dos níveis totais de anticorpos dentro do leite materno que está sendo transferido para os kits via lactação. Nossos resultados demonstram que o IgA do leite materno produz um sinal ELISA ligeiramente maior (unidades de luz relativa, RLU) quando comparado ao IgG, e tanto o IgA quanto o IgG produzem um sinal muito maior do que o sinal para IgM. Estes resultados estão de acordo com os resultados de outros que sugerem que o leite de coelho contém cerca de 4,5 mg/mL IgA, 2,4 mg/mL IgG e 0,1 mg/mL IgM26,27.

Figure 1
Figura 1. Cronograma amostral para um desenho de estudo de imunização intranasal materna em um modelo de coelho (Oryctolagus cuniculus). Coelhos fêmeas são imunizados pela via intranasal, conforme descrito no protocolo e demonstrado no vídeo. Dependendo do estudo, a vacina pode exigir um impulso ou pode precisar ser dada através de uma rota adicional (por exemplo, intramuscular ou subcutânea). Coelhos são então criados. IgG específico para antígeno é transferido transplacently para os kits, e em aproximadamente 30-32 dias após a reprodução, a gestante faz kindle. IgA é passado para os kits do xixi enquanto amamenta. Antes do desmamar, o leite pode ser facilmente coletado a partir da lactação faz para avaliar os níveis de IgA totais e específicos de antígeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Níveis de progesterona em coelhos grávidas e não grávidas em 3 semanas após a reprodução. Sangue foi coletado de coelhos em 3 semanas após a reprodução. Coelhos foram confirmados grávidas ou não-grávidas com base na capacidade de acender uma ninhada entre 30 e 32 dias após a reprodução. Os níveis de progesterona soro foram medidos através do Laboratório de Diagnóstico Veterinário da Universidade Estadual de Michigan usando um imunoensaio quimiluminescente (CLIA) com um sistema de imunoensaio (por exemplo, Siemens Healthineers IMMULITE 2000). As barras de erro representam erro padrão da média, e o tamanho da amostra consistiu em 4-6 coelhos por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Níveis de IgG específicos de antígeno em kits (relativos aos níveis maternos) ao nascer e às 3 semanas de idade após uma série de imunizações maternas. Sangue foi coletado dos que fazem e kits logo após o acende e com 3 semanas de idade. Os níveis de IgG específicos de antígeno dentro do soro foram detectados utilizando um ELISA fluorescente como descrito anteriormente28. O IgG específico do antígeno é traçado como uma razão de níveis detectados no soro do kit e no soro materno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Uma comparação dos níveis de IgA, IgM e IgG no leite de coelho. O leite de coelho foi coletado como descrito e demonstrado no vídeo. O leite foi processado por uma centrifugação longa (13.000 x g por 4,5 horas a 4 °C), e a camada média clara foi isolada após o processamento. Os níveis totais de IgA, IgG e IgM foram medidos nesta camada clara por ELISA fluorescente como descrito anteriormente28, exceto que as placas foram revestidas com anti-IgA policlonal, anti-IgG ou anti-IgM para detectar IgA total de coelho, IgG ou IgM, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Embora não descrito no protocolo acima, a reprodução bem sucedida dos coelhos é necessária para este modelo materno e para permitir a coleta de leite. Coelhos são facilmente criados por cobertura ao vivo em um ambiente de pesquisa. Recomenda-se que seja transferido para a gaiola do dólar para reprodução, assim como pode ser territorial e agressivo se mantido em sua própria gaiola com o dólar. Se as fêmeas não são receptivas após 15 minutos (como indicado por fugir mordendo, ou vocalizando), a doe deve ser colocada de volta em sua própria gaiola. Existem vários vídeos informativos e tutoriais sobre criação de coelhos que podem ser observados online29, mas após a reprodução, o macho normalmente cairá e pode vocalizar. Uma vez observado isso, a doe pode ser devolvida à gaiola. Um dólar pode procriar 2-3 vezes por dia sem diminuição na contagem de espermatozoides30. Em nosso protocolo aprovado pela IACUC, os dólares são limitados à reprodução de 10-12 faz por semana e são fornecidos pelo menos dois dias de descanso por semana, como fontes afirmam que um único dólar geralmente é suficiente para atender 10-15 faz31. Nosso grupo sugere a compra de criadores comprovados do fornecedor para melhorar a taxa de sucesso da reprodução. Como os coelhos são ovuladores induzidos e a ovulação normalmente ocorre de 10 a 13 horas após a cópula31, experimentamos uma taxa maior de gravidez em que são criados pela manhã e depois novamente à tarde, ou duas vezes dentro dessa janela de 10-13 horas (aumento observado de 75% para 95% de taxa de sucesso, inédito). Com base na literatura, as taxas típicas de sucesso de reprodução variam de 57-100%32,33,34,35,36,37,38,39,40, e tamanhos de lixo em média aproximadamente 7-9 kits31.

Determinar a gravidez o mais cedo possível é útil nos estudos maternos para confirmar que a doe não precisa ser renascido ou removido do estudo. As opções para detecção da gravidez incluem palpação (já em 14 dias)31,ultrassom (já em 5-9 dias)40,radiografias (já no dia 11)31,ganho de peso e técnicas moleculares, como medidas de fatores de crescimento de insulina41 (IGF) e progesterona34,37,38,42,43. Trabalhos anteriores indicaram elevações significativas dos níveis de IGF-II em coelhos gestantes em comparação com os níveis em coelhos não gestantes41. No entanto, em nossas mãos, não conseguimos detectar uma diferença nos níveis de IGF-II entre coelhos grávidas e não grávidas (não publicados). Como os níveis adequados de progesterona são necessários para a manutenção da gravidez em coelhos37,44, vários estudos avaliaram os níveis de progesterona em coelhos gestantes e demonstraram níveis elevados em relação aos coelhos não gestantes, particularmente durante a organogênese em torno da gestação média34,43,44. Nosso grupo não foi capaz de detectar diferenças nos níveis de progesterona usando um ELISA entre coelhos grávidas e não grávidas, mas resultados preliminares usando um ensaio automatizado de chemiluminescente no Laboratório de Diagnóstico Veterinário da Universidade Estadual de Michigan indicam níveis elevados de progesterona em coelhos grávidas em comparação com coelhos não gestantes mesmo após acasalamentos por um dólar foram confirmados para todos os que são avaliados(Figura 2).

A lactação pode produzir aproximadamente 250 mL, ou 60 mL/kg, de leite diariamente45,46, permitindo grandes volumes para ensaios experimentais para avaliar respostas/concentrações de anticorpos totais e específicas de antígenos. O leite de coelho contém altos níveis de gordura e proteína, contendo 2 e 3 vezes mais níveis concentrados de gordura e proteína, em comparação com o leite de vaca e semeadura,respectivamente 45,47. Devido ao alto teor de gordura no leite, as amostras requerem processamento significativo, dependendo dos ensaios a serem conduzidos. Após a centrifugação da amostra de leite, três camadas distintas são separadas, incluindo as células dentro da camada inferior, camada intermediária clara contendo as imunoglobulinas e gordura dentro da camada superior48. As imunoglobulinas, dentro da camada intermediária clara, estão presentes em altas concentrações dentro do colostro e do leite e são compostas principalmente de IgA, IgG e IgM(Figura 4). Embora as amostras de leite sejam facilmente coletadas manualmente, e esta é a nossa técnica preferida dentro do laboratório, sistemas de vácuo também foram relatados na literatura13,46,48. Yoshiyama et al.48 coletaram amostras de leite usando pressão negativa e descreveram uma centrifugação longa (15.000 x g por 4 horas) para separação das camadas de leite antes de passar a camada intermediária clara através de uma coluna Sepharose 4B para remoção de imunoglobulina. Usando este método, os autores foram capazes de detectar anticorpos específicos da toxina da cólera dentro do leite de coelho de coelhos imunizados oralmente em níveis suficientes para proteção contra a secreção induzida por vibrio choleraeno intestino48. Peri et al.13 amostras de leite processado coletadas por aspiração com sistema de vácuo de água por centrifugação a 4 °C por 2 horas a 24.000 x g. Neste estudo, os autores foram capazes de detectar igA anti-RSV no colistro, leite e secreções brônquicais e intestinais após a imunização mucosa (oral ou intratraqueal), mas não a imunização intravenosa, enquanto o IgG anti-RSV foi detectado em colisão, leite e soro independentemente da rota de imunização13.

Deve-se tomar cuidado durante o procedimento de imunização intranasal para confirmar que o coelho está em um plano adequado de anestesia e para evitar administrar grandes volumes de vacina de uma só vez. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram que a eficácia da imunização intranasal foi influenciada pelo uso da anestesia49. Especificamente, anestesia profunda induzida pela combinação de cetamina e xilazina correlacionada com o aumento da imunogenicidade da vacina administrada nasal e melhor retenção nasal da solução. Esses níveis foram significativamente maiores do que a retenção e a imunogenicidade em coelhos intranasalmente imunizados após sedação com acepromazina e butorphanol49. Achados semelhantes também foram demonstrados após a imunização intranasal em camundongos50,51. Além disso, nosso trabalho demonstrou aumento da imunogenicidade após a imunização intranasal sob a anestesia profunda sobre animais que estavam totalmente acordados e sobre animais submetidos a anestesia de menor duração com uma combinação de acepromazina e isoflurane. Essa diferença na imunogenicidade IgG entre anestesia de duração profunda versus curta foi significativa no ponto de tempo de 42 dias, mas não no ponto de tempo de 56 dias. Embora o aumento da imunogenicidade e retenção possa resultar da anestesia mais profunda, os coelhos precisaram de pelo menos 30 minutos para se recuperarem; que os coelhos estavam eretos e móveis dentro de 5 minutos após receberem a vacina nasal após a anestesia induzida pela isoflurane de menor duração. Embora a anestesia possa não ser ideal para imitar o cenário clínico para a imunização intranasal em humanos, uma anestesia de menor duração (por exemplo, isoflurane) pode ser preferida para uma anestesia mais longa e profunda com agentes injetáveis (por exemplo, cetamina + xilazina). O uso de um modelo animal, como demonstrado em Gwinn et al.49,muitas vezes exigirá o uso de sedação ou anestesia para permitir o manuseio seguro de animais e a entrega eficaz e consistente da vacina. Uma limitação potencial para o uso de anestesia com a administração de vacinas em modelos animais é o seu efeito sobre a capacidade do animal de induzir uma resposta imune adequada à vacina. Curiosamente, relatos na literatura sugerem que a isoflurane pode atenuar as respostas inflamatórias sistêmicas, proporcionando proteção contra desafios52 e reduzindo o estresse oxidativo e inflamação53.

Com relação à minimização da perda vacinal e à entrega intranasal adequada, nosso grupo recomenda um período de descanso de 30 segundos após a administração de cada alíquota da vacina intranasal para permitir a retenção da solução dentro da cavidade nasal e evitar que a solução saia das narinas se o coelho estiver sendo imediatamente colocado em recidência severa e devolvido à gaiola. Além disso, é importante limitar o volume da alíquota administrada para garantir a imunização intranasal, uma vez que a absorção mucosa é limitada pela área superficial da passagem nasal. Se um grande volume for administrado, a solução pode contornar a mucosa nasal e resultar em imunização inalacional ou gástrica. Nosso grupo recomenda alíquotas de 100 μL por narina com um volume intranasal máximo de 500 μL.

Este artigo tem como foco a entrega de vacinas mucosas, especificamente via rota intranasal, mas existem múltiplos métodos de imunização, tanto mucosal quanto parenteral que foram demonstrados em coelhos. Estes métodos adicionais incluem, mas não se limitam a, oral, subcutâneo, intramuscular e intradérmico. Sendo assim, as amostras a serem coletadas e avaliadas variam de acordo com as metas experimentais e a rota da imunização.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de reconhecer a Divisão de Recursos Animais Laboratoriais da Universidade duke e sua equipe de criação por sua assistência e muito cuidado prestado aos animais. Além disso, os autores gostariam de reconhecer a equipe do PhotoPath dentro do Departamento de Patologia para sua assistência com as partes de áudio e vídeo do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por fundos de pesquisa discricionários do laboratório Staats.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needle (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Mucosal Vaccine N/A N/A Experimental Vaccine
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
Pipette Tips VWR 53503-290
Pipettor VWR 89079-962
PromAce (Acepromazine maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply Covidien 07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needles (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4) Covidien 07-891-5815
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL) Falcon 14-959-49B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Imunologia e Infecção Edição 173 Imunização materna imunização intranasal imunização mucosa coleta de leite leite de coelho oryctolagus cuniculus.
Imunização Intranasal e Coleta de Leite em Estudos de Imunização Materna em Coelhos Brancos da Nova Zelândia (<em>Oryctolagus cuniculus</em>)
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Landon, C. D., Dancourt, G., Shing,… More

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing, V., Staats, H. F. Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus). J. Vis. Exp. (173), e62317, doi:10.3791/62317 (2021).

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