用于可视化异染色质相关蛋白的免疫荧光染色 果蝇 唾液腺

摘要

本方案旨在可视化Drosophila多线细胞中的异染色质聚集体。

摘要

通过免疫染色观察异染色质聚集物具有挑战性。许多哺乳动物的染色质组分在进化上是保守的 黑腹果蝇 因此，它是研究异染色质形成与维持的极佳模型. 多线化细胞，例如三龄幼虫唾液腺中发现的细胞 D. melanogaster 幼虫提供了一种极佳的工具，可观察到染色质被扩增近一千倍的现象，使研究人员能够研究细胞核内异染色质分布的变化。尽管异染色质组分的观察可直接在多线染色体标本中进行，但某些蛋白质的定位可能因处理条件剧烈而发生改变。因此，对细胞中异染色质进行直接可视化观察可补充此类研究。在本方案中，我们描述了用于该组织的免疫染色技术、荧光二抗的使用以及共聚焦显微镜观察，以更精确和详细地观察这些异染色质聚集体。

引言

自从Emil Heitz的早期研究以来¹，异染色质一直被认为是调控基因表达、染色体的减数分裂和有丝分裂分离以及维持基因组稳定性等细胞过程的重要调节因子^2,3,4。

异染色质主要分为两种类型：组成型异染色质和兼性异染色质。组成型异染色质通常位于染色体的特定区域，如端粒和着丝粒，其特征是包含重复序列和可移动元件。这类异染色质主要通过特定的组蛋白修饰在表观遗传上加以定义，例如组蛋白H3第9位赖氨酸的二甲基化或三甲基化（H3K9me3），以及异染色质蛋白1a（HP1a）的结合^5,6。另一方面，兼性异染色质分布于染色体臂上，主要由在发育过程中被沉默的基因组成^7,8。通过对有丝分裂中期细胞中异染色质区段进行免疫染色，或观察间期细胞中异染色质的聚集现象，已极大地增进了人们对异染色质区域形成机制与功能的理解⁹。

利用D....

方案

1. 三龄幼虫培养

1. 通过加入100 g酵母、100 g未精制的全甘蔗糖、16 g琼脂、10 mL丙酸和14 g明胶来配制1升标准培养基。除酵母外，将所有成分溶解于800 mL自来水中，然后溶解酵母。立即高压灭菌30分钟。
   1. 随后，让培养基冷却至60 °C，并加入丙酸至终浓度为0.01%。将瓶子静置，直至明胶凝固。
2. 为优化三龄幼虫的培养，首先收集5至10日龄的成虫，并将50只（25只雄性和25只雌性）放入装有标准培养基的宽口瓶中。
3. 将装有果蝇的瓶子置于25 °C的恒温培养箱中，直至产卵数量达到50枚（对于野生型品系约需12小时）。
4. 培养时间结束后，移除成虫并将其转移至新瓶子中以重复该操作。让胚胎在18 °C下生长72小时
   ​注意：有关黑腹果蝇（Drosophila）品系保种条件的更多信息，请参见Tennessen & Thymmel¹³。

2. 幼虫采集

1. 收集幼虫时，应选择未出现气门外翻的游走期幼虫。气门外翻后，幼虫进入前蛹期，此时唾液腺仍具有优良的多线染色体，适合进行分析。唾液腺细胞在12小时后才开始启动程序性细胞死亡^14,

结果

果蝇 唾液腺中HP1a免疫染色的代表性结果如图1所示。阳性结果表现为观察到一个焦点信号（图1a）（异染色质聚集体或凝聚物）。阴性结果则无信号或信号呈弥散分布。有时可观察到双信号，即出现两个焦点（图1c），但通常出现频率较低。

数据分析可用柱状图表示，以比较不同突变背景下HP1a的分布情况。例如，在图2中可以看出，98%的野生型细胞核呈现单个焦点分布，2%的细胞核具有两个焦点；而在突变体中，这一比例发生变化，具有两个焦点的细胞核比例上升至40%。

图3 显示代表性H3K9me3免疫染色结果于 果蝇 唾液腺。我们可以观察到一个焦点（图3b）与.......

讨论

真核生物的细胞功能可以决定细胞核内的三维结构，这种结构依赖于不同蛋白质与染色质以及包括RNA在内的多种分子之间的相互作用。在过去三年中，具有重要生物学意义的生物凝聚物（如异染色质）在相分离过程中发挥了关键作用，促进了活性染色质与抑制性染色质在细胞核内独特的空间组织形式^16,17,18。

异染色质对于维持细胞功能和细胞特性至关重要。过去人们认为这些致密区域不会发生转录。然而，随着技术手段的进步，我们现在发现异染色质不仅能够被转录，而且其转录过程对于维持细胞核骨架结构具有重要作用，并且对发育或病理过程具有敏感性^12,19。此外，位于着丝粒周围异染色质中的一些基因需要异染色质环境才能正常发挥功能。HP1a基因的突变会降低最早被发现的light和rolled

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Axygen MCT-150-C	11351904	品牌不关键
16% 甲醛	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA，分子生物学级	Roche	10735078001	品牌不关键
Complete，不含EDTA的超纯蛋白酶抑制剂 蛋白酶抑制剂	Merck	5892953001
盖玻片	Corning	CLS285022-200EA	22×22，品牌不关键
DTT	Sigma	d9779	品牌不关键
EDTA	Sigma	E5134	品牌不关键
EGTA			品牌不关键
载玻片	Gold seal	3011	品牌不关键
H3BO3	Baker	0084-01	品牌不关键
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	产品形态 浓缩液 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	品牌不关键
甲醇	Baker	9070-03	品牌不关键
NaCl	Sigma	71376	品牌不关键
NaOH			品牌不关键
PIPES			品牌不关键
旋转仪	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake 试管摇床
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	品牌不关键
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL，品牌不关键
β-巯基乙醇	Bio-Rad	1610710	25 mL，品牌不关键