Summary
此协议旨在可视化 多聚 体细胞中的异色素聚合物。
Abstract
通过免疫染色来可视化异色素聚合物可能具有挑战性。许多哺乳动物的染色质成分在 果蝇黑色素加斯特保存。 因此，研究异色素的形成和维护是一个很好的模型。 聚合细胞，如在第三星 D.黑色素幼 虫的唾液腺中发现的细胞，提供了观察血红素放大近千次的绝佳工具，并使研究人员能够研究异色素在细胞核中分布的变化。虽然异色素成分的观察可以直接在多极染色体制剂中进行，但某些蛋白质的定位可以通过治疗的严重程度来改变。因此，细胞中异色素的直接可视化补充了这种类型的研究。在此协议中，我们描述了用于此组织的免疫染色技术、使用二次荧光抗体和连续显微镜以更精确和更精细的方式观察这些异色素聚合物。
Introduction
自早期研究Emil Heitz1以来，异色素一直被认为是细胞过程的重要调节器，如基因表达、染色体的美色和间质分离，以及维持基因组稳定性2、3、4。
异色素主要分为两种类型：具有特征定义重复序列的构成异色素，以及存在于特定染色体位点（如端粒和中位体）中的可转换元素。这种类型的异色素主要通过特定的平生标记，如赖氨酸9的地基或三甲基化的希石H3（H3K9me3）和异色素蛋白1a（HP1a）5，6的结合来表观遗传。另一方面，通过染色体的手臂，由发育沉默的基因7，8组成。代谢细胞中异色素块的免疫染色，或相间细胞中异色素聚合物的观察，在了解异色区形成和功能方面，揭示了许多光。
使用卓索菲拉作为模型系统，使得开发必要的工具，研究异色素，而无需使用电子显微镜10。由于位置效应变异的描述和异色素相关蛋白质（如HP1a）和组蛋白后转化改性蛋白的发现，许多小组已经开发出几种免疫造血技术，允许这些异色区域的可视化10，11。
这些技术基于特定抗体的使用，这些抗体能够识别异色素相关蛋白质或希石标记。对于每个细胞类型和抗体，必须经验确定固定和渗透条件。此外，如果使用额外的机械过程（如挤压技术），条件可能会有所不同。在这个协议中，我们描述了使用果蝇唾液腺来研究异色病。唾液腺具有多聚化细胞，包含超过1000份基因组，因此提供了大部分染色质特征的放大视图，除了卫星DNA和一些被复制的异色区域。然而，异色素区域很容易在多极染色体制剂中可视化，但挤压技术有时可能会破坏典型的染色质结合复合物或染色质结构。因此，整个唾液腺组织中蛋白质的免疫定位可以超越这些不良反应。我们使用这个协议来检测几个染色质结合蛋白，我们已经证明，这个协议结合突变的果蝇种群可用于研究异色素干扰12。
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Protocol
1. 第三星幼虫培养
- 加入100克酵母、100克未精制的全甘蔗糖、16克琼脂、10mL丙烯酸和14克明胶，准备1升标准介质。将除酵母以外的所有成分溶解在 800 mL 的自来水中，然后溶解酵母。高压灭菌立即30分钟。
- 之后，让媒体冷却到60°C，并将丙酸添加到最终浓度0.01%。让瓶子站立，直到明胶形成。
- 为了优化3o星内幼虫培养，首先收集5至10天的老年人，并将50（25男25女）放在一个宽脖子瓶的标准媒体。
- 将瓶子与苍蝇一起放在25°C的受控温度孵化器中，直到产卵数量为50个（野生型菌株约12小时）。
- 孵化期结束后，将成人取出并转移到新瓶中重复该程序。让胚胎在18°C下生长72小时
注意：有关果蝇库存维护条件的更多情况，请参阅特内森和提梅尔13。
2. 拉瓦系列
- 对于幼虫集合选择没有曾经的螺旋骨的流浪幼虫。螺旋骨变老后，幼虫进入前肺阶段，同时保留适合分析的优秀多分子染色体。只有12小时后，唾液腺的细胞才开始为14、15号程序化细胞死亡做准备。
- 取15个3°星内幼虫，并把它们放在一个手表玻璃清洗他们。然后将其转移到冰冷的盐水溶液或PBS（1x PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，调整pH值至7.4）。
- 在立体显微镜下用蛋白酶抑制剂在冷的PBS中解剖15至30对唾液腺（或在30分钟内尽可能多地）。将唾液腺转移到1.5mL管与冰冷的PBS。
- 用1 mL的PBS加蛋白酶抑制剂洗一次。等待组织到达管子底部。
- 洗涤后，用 1000 μL 移液器取出 PBS。小心不要触摸组织。
- 或者，在 PBS 的 5 mL 中解剖唾液腺，以消除此洗涤步骤的需要，并通过将唾液腺转移到下面描述的 Ruvkun 固定缓冲器的 0.5 mL 来继续第 3 步。
3. 唾液腺组织固定
- 从最后一步中取出 PBS 后，直接添加 0.5 mL 的 1x Ruvkun 固定缓冲，50% 甲醇（添加 0.5 mL 甲醇）和 2% 甲醛。
注： 2x Ruvkun 解决方案是 160 mM KCl， 40 mM NaCl， 20 m M EGTA， 30 mM PIPES pH 7.4。 - 在 4 °C 下孵育 2 小时，轻度旋转。
4. 唾液腺组织清洗
- 用 1 mL 的 Tris/Triton 缓冲器（100 mM Tris pH 7.4，1% 特里顿 X-100 和 1 m M EDTA）进行 5 分钟的旋转洗涤。
注意：等待组织到达管子底部。
5. 渗透
- 将唾液腺孵育在 1 mL 的 Tris/Triton X-100（与上图相同）中。对于某些蛋白质，可能需要添加1%β-甲醇。
- 在 37 ° C 下孵育 2 小时，轻微摇晃（300 转转）。
6. 保存步骤（可选）
注意：如果不立即用抗体进行孵化，请保留以下组织。
- 用 1 mL 的 BO3 缓冲器（0.01 M H3BO3 pH 9.2 = 0.01 M NaOH）清洗，然后在37° C 的 BO 3 /10 mM DTT 中孵育，轻度摇晃（300 rpm）15 分钟。
- 在潜伏期结束时，仅用 1 mL 的 BO3 缓冲器进行洗涤。
注意：等待组织到达管子底部。 - 添加 1 mL 的 PBS。将溶液中的组织保存在 4 °C 下长达 72 小时，然后继续下一步。此步骤在处理可能呈现延迟生命周期的不同突变菌株时特别有用，因此免疫检测可以与对照组同时执行。
7. 组织阻塞
- 在缓冲 B （PBS = 0.1% BSA = 0.5% 特里顿 X-100 = 1 m M EDTA） 中孵育唾液腺 2 小时，在室温下旋转。
8. 免疫染色
- 取出所有缓冲 B 并添加缓冲 A （PBS = 0.1% BSA） 加上感兴趣的抗体。
注：我们使用HP1a C1A9c（浓缩抗体）从混合瘤银行到1：3000。当使用C1A9s（超高）时，我们已经尝试从1：100到1：500稀释和任何稀释之间的排名工作得很好）在4 oC与旋转过夜。在这一点上，重要的是，震动不会引发气泡，可能会损害抗体。
9. 免疫染色洗涤
- 每次使用 1 mL 在室温下搅拌 3 x 15 分钟用缓冲 B 清洗。
- 将腺体与二级抗体一起转移到缓冲B，在4°C的旋转下与荧光剂结合2小时（使用1：3000使用二级抗体亚历克萨氟568因维他根）。
- 用铝纸箔盖住管子，保护辅助抗体免受光线的照射。
- 在室温下进行 2 x 15 分钟的洗涤，同时用 1 mL 的缓冲 B 进行旋转。
- 用Sytox（5 mM库存的2微升，溶解在缓冲区B的1兆升）或霍奇斯特（1微升10毫克/毫升的库存，溶解在1兆升缓冲B）等DNA标记下孵育10分钟，在室温下旋转。
- 用缓冲器 B 洗一次，用 PBS 洗一次，每次洗涤持续 10 分钟，同时在室温下旋转。
注意：记住保护它免受光线的照射。
10. 成像
- 将唾液腺安装在滑梯上，制作一个带盖片的游泳池。
- 将唾液腺放在池中，用AF1的葡萄球盖住，以避免气泡的形成，将粘稠液体扩展到所有地方。然后用清晰的指甲油密封所有侧面。
- 在荧光或聚焦显微镜下观察。如果当天不观察样品，则在 4 °C 时远离光线。
- 使用 GraphPad 棱镜 6 生成所有图形和统计分析。
- 使用克鲁斯卡尔-瓦利斯测试分析唾液腺中HP1a分布的数据。统计意义设定为（p < 0.05*，< 0.01**，< 0.001***，< 0.0001****）。
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Representative Results
图1显示，在果蝇唾液腺中，HP1a免疫染色具有代表性。 一个积极的结果是观察一个焦点（图1a）（异色聚合物或凝结物）。负结果为无信号或分散信号。有时可以观察到双重信号，即双点（图1c），但它通常发生的数量较小。
数据分析可以表示为条形图，比较不同突变背景中 HP1a 的分布。例如，在 图2 中，我们可以看到，98%的野生类型核呈现一个焦点的分布，2%的原子核存在两个foci，而在突变体中，比例变化，两个foci的存在增加到40%。
图3显示了 德罗索菲拉 唾液腺中具有代表性的H3k9me3免疫染色结果。我们可以观察一个焦点（图3b），类似于HP1a免疫染色（异色聚合物或凝结水）。在野生类型菌株中，极难看到双信号或三重信号 （图 3c）。
图1。代表共聚焦显微镜图像从唾液腺免疫染色与HP1a抗体从野生类型（wt）。a） DNA（青色信号）、HP1a（品红色信号）和合并秤条 100 μm。在 HP1a 的免疫染色中，带有焦点的核标有白色箭头和带点线盒的两个 foci 的核。右侧列显示单核的放大图像，刻度条为 5 μm. b）焦距分布。 c） 两个 foci 分布。两个核都标有白色虚线。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。例如，通过计算HP1a免疫染色物的核分枝分布。 第一个条形表示野生型核（wt）的计数，如 图1。第二个条形表示影响此分布的突变应变。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3。代表共聚焦显微镜图像从唾液腺免疫染色与H3K9me3抗体从野生类型（wt）。a） DNA（青色信号）、H3K9me3（品红色信号）和合并秤杆100μm。在H3K9me3的免疫染色中，右列显示一个比例为 5μm.b的单核的放大图像，该核是一个具有焦距分布的核。 c） 三个 foci 分布。两个核都标有白色虚线。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
真核生物的细胞功能可以定义细胞核内的3D结构，由不同蛋白质与染色质和包括RNA在内的各种分子之间的相互作用得到支持。在过去三年中，具有相关性的生物凝结物，包括异色素，在确定相分离方面发挥了根本作用，促进了活跃和抑制性色度素16、17、18的独特核空间组织。
异色素对于保持细胞功能和身份至关重要。以前人们认为这些密集区域没有转录。然而，现在我们有更强大的技术，我们可以看到，异色素不仅是转录，而且是一个基本的过程，以保持基座的脚手架，是敏感的发展或病理过程12，19。此外，某些嵌入在近心异色素中的基因需要一个异色环境才能正常工作。HP1a突变减少了光和轧基因的表达，这是19日首次发现。这些基因对生物体的生存至关重要，存在于异色素块中。因此，尽管它能够诱导沉默，这个特殊的基因组成分有潜力是非常动态的20。在可由各种生物环境控制的染色质结合型和扩散型之间的复杂平衡中，也存在异色素相关蛋白质，如HP1a。最近还有人建议，异色素凝结物21、22的组装显示了相分离特性。
有许多论文，作者使用不同的，有时更简单的协议23，24对果蝇唾液腺核进行了全安装免疫染色。在这种情况下，我们修改了一个协议，首先描述在C.elegans25，随后使用在果蝇唾液腺由几个组26，27，28，29，并结合使用共聚焦显微镜和突变生物。此协议还允许可视化不同类型的蛋白质，包括转录因子，如XPD，XPB和TBP27，但也异色素结合蛋白，如HP1a和希石标记，如H3K9me3，它定位为一个协议，广泛用于这个组织。它还具有在不影响多聚乙烯染色体带的情况下将组织存储在中间步骤的优势。
由于使用特定抗体查看 HP1a 蛋白质，此协议是可靠且具有成本效益的。此协议的关键步骤是避免在洗涤过程中失去腺体，并等待组织触底。使用唾液腺的优点是，与多特尼染色体技术相比，细胞核及其构象的3D视图很容易获得，而多分子染色体技术需要细胞的机械破坏，并可能损害染色质。在执行此协议时，应在洗涤步骤中特别小心。如果不仔细执行，组织将断裂，将无法获得高质量的图像。
为了评估RNA对正在观察到的区域或蛋白质缺乏结合的重要性，有必要添加缓冲C（没有EDTA的缓冲B）洗涤，并添加100μM的RNASE。如前所述，此洗涤应在 37 °C 下进行 1 小时。在添加分子以观察DNA的步骤（在步骤 9.3 和 9.4 之间）之前，应进行清洗。
聚焦显微镜可能看起来并不是解决异色素凝结物25、30问题的一种非常新的方法，但它对于识别果蝇核中HP1a蛋白的去定位非常有用，这表明染色质结构存在严重问题，可以通过其他技术进行更彻底的评估。尽管它有限，它可与高分辨率显微镜相结合，作为第一种方法，应用新技术来澄清调节异色素凝结物组装、控制和功能的生物活性。其中一些新方法侧重于异色素、RNA 和异色素相关蛋白质之间的分子和生物物理相互作用，这些新方法是从这组测试异色素凝结物的方法中收集的。
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Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们感谢马可·安东尼奥·罗萨莱斯·维加和阿贝尔·塞古拉拍摄了一些焦点图像，卡门·穆尼奥斯为媒体准备，阿图罗·皮门特尔博士，M.C安德烈斯·萨拉莱吉博士和来自LMNA的克里斯·伍德博士就显微镜的使用提供建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
| 16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
| BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
| Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
| Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22x22, brand not critical |
| DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
| EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
| EGTA | brand not critical | ||
| Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
| H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
| H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
| HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
| KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
| Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
| NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
| NaOH | brand not critical | ||
| PIPES | brand not critical | ||
| Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
| Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
| Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |
References
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