Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Immunofluorescerande färgning för visualisering av heterochromatin associerade proteiner i Drosophila Salivary Körtlar

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62408
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

Detta protokoll syftar till att visualisera heterochromatin aggregat i Drosophila polytene celler.

Abstract

Visualisering av heterochromatinaggregat genom immunostaining kan vara utmanande. Många däggdjur komponenter i kromatin bevaras i Drosophila melanogaster. Därför är det en utmärkt modell för att studera heterochromatinbildning och underhåll. Polyteniserade celler, som de som finns i salivkörtlar av tredje instar D. melanogaster larver, ger ett utmärkt verktyg för att observera kromatin förstärks nästan tusen gånger och har gjort det möjligt för forskare att studera förändringar i fördelningen av heterochromatin i kärnan. Även om observationen av heterokromatinkomponenter kan utföras direkt i polytenkromosompreparat, kan lokaliseringen av vissa proteiner ändras av behandlingens svårighetsgrad. Därför kompletterar den direkta visualiseringen av heterokromatin i celler denna typ av studie. I detta protokoll beskriver vi de immunostaining tekniker som används för denna vävnad, användning av sekundära fluorescerande antikroppar och confocal mikroskopi att observera dessa heterochromatin aggregat med större precision och detalj.

Introduction

Sedan de tidiga studierna av Emil Heitz1, heterochromatin har ansetts vara en viktig regulator av cellulära processer såsom genuttryck, meiotisk och mitotisk separation av kromosomer, och upprätthållandet av genomstabilitet2,3,4.

Heterochromatin är huvudsakligen indelat i två typer: konstituerande heterokromatin som karakteristiskt definierar repetitiva sekvenser och transponerbara element som finns på specifika kromosomplatser som telomerer och centromerer. Denna typ av heterokromatin definieras huvudsakligen epigenetiskt av specifika histonmärken såsom di- eller tri-metylering av lysin 9 av histon H3 (H3K9me3) och bindningen av heterochromatinproteinet 1a (HP1a)5,6. Å andra sidan lokaliserar facultative heterokromatin genom kromosomens armar och består huvudsakligen av utvecklingsmässigt tystade gener7,8. Immunostaining av heterokromatinblock i metafasceller, eller observation av heterokromatiska aggregat i interfasceller, har avtäckt mycket ljus i förståelsen av bildandet och funktionen av heterokromatiska regioner9.

Användningen av Drosophila som modellsystem har gjort det möjligt att utveckla viktiga verktyg för att studera heterochromatin utan användning av elektronmikroskopi10. Sedan beskrivningen av position effekt variation och upptäckten av heterochromatin-associerade proteiner, såsom HP1a, och histon post-translationella modifieringar, har många grupper utvecklat flera immunohistochemical tekniker som tillåter visualisering av dessa heterochromatic regioner10,11.

Dessa tekniker är baserade på användning av specifika antikroppar som känner igen heterochromatin-associerade proteiner eller histonmärken. För varje celltyp och antikropp måste fixerings- och permeabiliseringsförhållandena bestämmas empiriskt. Förhållandena kan också variera om ytterligare mekaniska processer som squashteknik används. I detta protokoll beskriver vi användningen av Drosophila salivary körtlar för att studera heterochromatic högborgar. Salivkörtlar har polyteniserade celler som innehåller mer än 1 000 kopior av genomet, vilket ger en förstärkt bild av de flesta kromatinfunktionerna, med undantag för satellit-DNA och vissa heterochromatiska regioner som är under replikerade. Ändå visualiseras heterokromatinregioner lätt i polytenkromosompreparat, men squashteknikerna kan ibland störa karakteristiska kromatinbundna komplex eller kromatinarkitekturen. Därför kan immunlokalisering av proteiner i hela salivkörtelvävnad överträffa dessa oönskade effekter. Vi har använt detta protokoll för att upptäcka flera kromatin bundna proteiner, och vi har visat att detta protokoll kombinerat med mutanta Drosophila lager kan användas för att studera heterochromatin störning12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tredje instar larver kultur

  1. Förbered 1 liter standardmedia genom att tillsätta 100 g jäst, 100 g oraffinerat helrörssocker, 16 g agar, 10 ml propionsyra och 14 g gelatin. Lös upp alla ingredienser utom jästen i 800 ml kranvatten och lös sedan upp jästen. Autoklav omedelbart i 30 minuter.
    1. Låt sedan media svalna till 60 °C och tillsätt propionsyra till en slutlig koncentration på 0,01 %. Låt flaskan stå tills gelatinet bildas.
  2. För att optimera 3o instar larver kultur, samla först 5-till-10-dagars gamla vuxna och placera 50 (25 män och 25 honor) i en bred halsflaska med standardmedia.
  3. Placera flaskan med flugorna i en kontrollerad temperaturinkubator vid 25 °C tills antalet ägg som läggs är 50 (cirka 12 timmar för den vilda stammen).
  4. När inkubationstiden är över, ta bort de vuxna och överför dem till en ny flaska för att upprepa proceduren. Låt embryona växa vid 18 °C i 72 timmar
    OBS: För mer information om Drosophila lagerunderhållsförhållanden, se Tennessen & Thymmel13.

2. Larver samling

  1. För larver kollektion välj de vandrande larverna som inte har everted spiracles. Efter spiracles eversion går larven in i det prepupala stadiet, samtidigt som utmärkt polytenkromosomer som är lämpliga för analys bibehålls. Först efter 12 timmar börjar cellerna i salivkörteln förbereda sig för programmerad celldöd14,15.
  2. Ta femton 3° instar larver och lägg dem i ett klockglas för att tvätta dem. Överför dem sedan till en iskall saltlösning eller PBS (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, justera pH till 7,4).
  3. Dissekera 15 till 30 par salivkörtlar (eller så många som möjligt på 30 minuter) i kall PBS med proteashämmare under stereoskopiska mikroskopet. Överför salivkörtlarna till ett 1,5 ml-rör med iskallt PBS.
  4. Tvätta en gång med 1 ml PBS plus proteashämmare. Vänta tills vävnaden når botten av röret.
  5. Efter tvätten, ta bort PBS med en 1000 μL pipett. Var försiktig så att du inte rör vävnaden.
    1. Alternativt dissekera salivkörtlarna i 5 ml PBS för att eliminera behovet av detta tvättsteg och fortsätt till steg 3 genom att överföra salivkörtlarna till 0,5 ml av Ruvkun-fixeringsbufferten som beskrivs nedan.

3. Salivkörtelvävnad fixering

  1. Efter att PBS har avlägsnats från det sista steget, tillsätt direkt 0,5 ml 1x Ruvkun-fixeringsbuffert, med 50% metanol (tillsätt 0,5 ml metanol) och 2% formaldehyd.
    OBS: 2x Ruvkun lösning är 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM RÖR vid pH 7,4.
  2. Inkubera i 2 timmar vid 4 °C med mild rotation.

4. Salivkörtelvävnadstvätt

  1. Utför en 5-minuters rotationstvätt med 1 ml Tris/Triton-buffert (100 mM Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 och 1 mM EDTA).
    OBS: Vänta tills vävnaden når botten av röret.

5. Permeabilisering

  1. Inkubera salivkörtlarna i 1 ml Tris/Triton X-100 (samma som ovan). För vissa proteiner kan det vara nödvändigt att tillsätta 1% β-mercaptoethanol.
  2. Inkubera i 2 timmar vid 37 ° C med mild skakning (300 rpm).

6. Bevarandesteg (valfritt)

OBS: Om du inte omedelbart fortsätter till inkubationen med antikroppen, bevara vävnaden enligt följande.

  1. Tvätta med 1 ml BO3-buffert (0,01 M H3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) och inkubera sedan i BO3/10 mM DTT vid 37 ° C med mild skakning (300 varv/min) i 15 minuter.
  2. I slutet av inkubationsperioden, utför en tvätt med 1 ml BO3-buffert ensam.
    OBS: Vänta tills vävnaden når botten av röret.
  3. Tillsätt 1 ml PBS. Bevara vävnaden i denna lösning vid 4 °C i upp till 72 timmar och fortsätt sedan med nästa steg. Detta steg är särskilt användbart när du arbetar med olika mutanta stammar som kan presentera en fördröjd livscykel, så immunodetection kan utföras samtidigt tillsammans med kontrollerna.

7. Vävnadsblockering

  1. Inkubera salivkörtlarna i 1 ml buffert B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) i 2 timmar vid rumstemperatur med rotation.

8. Immunostaining

  1. Ta bort all buffert B och lägg till buffert A (PBS + 0,1% BSA) plus antikropp av intresse.
    OBS: Vi använder HP1a C1A9c (koncentrerad antikropp) från Hybridoma Bank fram till 1:3000. När vi använder C1A9s (supernatant) har vi försökt från 1:100 till en 1:500 utspädning och eventuell utspädning mellan denna rang fungerar bra) över natten vid 4 oC med rotation. Vid denna tidpunkt är det viktigt att skakningarna inte höjer bubblor som kan skada antikroppen.

9. Immunostaining tvätt

  1. Utför 3 x 15 minuters tvättar med buffert B under omrörning vid rumstemperatur med 1 ml varje gång.
  2. Överför körtlarna till buffert B tillsammans med den sekundära antikroppen i kombination med en fluorofor i 2 timmar under rotation vid 4 oC (sekundär antikropp Alexa fluor 568 Invitrogen användes 1:3000).
    1. Täck röret med aluminiumpappersfolie för att skydda den sekundära antikroppen från ljuset.
  3. Utför 2 x 15 minuters tvättar vid rumstemperatur under rotation med 1 ml buffert B.
  4. Inkubera med en DNA-markör som Sytox (ta 2 μL 5 mM lager och lös upp i 1 ml buffert B) eller Hoechst (ta 1 μL 10 mg/ml lager och lös upp i 1 ml buffert B) i 10 minuter vid rumstemperatur med rotation.
  5. Utför en tvätt med buffert B och en gång med PBS, var och en tvätt varar i 10 minuter medan du roterar vid rumstemperatur.
    OBS: Kom ihåg att skydda den från ljuset.

10. Bildbehandling

  1. Montera salivkörtlarna på en rutschkana och gör en pool med täckslip.
  2. Sätt salivkörtlarna i mitten av poolen och täck med AF1 citifluor för att undvika bildandet av bubblor som förlänger den trögflytande vätskan överallt. Försegla sedan alla sidor med klart nagellack.
  3. Observera under ett fluorescens- eller konfokalt mikroskop. Om provet inte kommer att observeras samma dag, förvaras i 4 °C.
  4. Använd GraphPad Prism 6 för att generera alla grafer och statistiska analyser.
  5. Analysera data från HP1a-distributionen i salivkörtlar med Kruskal-Wallis-testet. Statistisk signifikans fastställdes till (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa resultat av HP1a immunostaining i Drosophila salivkörtlar visas i figur 1. Ett positivt resultat är att observera en brännpunkt (figur 1a) (heterochromatiskt aggregat eller kondensat). Ett negativt resultat är ingen signal eller en spridd signal. Ibland kan en dubbelsignal observeras, det vill säga med en dubbelpunkt (figur 1c), men den förekommer vanligtvis i mindre mängder.

Dataanalys kan representeras som stapeldiagram och jämföra fördelningen av HP1a inom olika mutantbakgrunder. I figur 2 kan vi till exempel se att 98 procent av de vilda atomkärnorna uppvisar en fördelning av en brännpunkt och 2 procent av kärnorna utgör två högborgar, medan andelen i mutanten ändras och närvaron av två högborgar ökar till 40 procent.

Figur 3 visar representativa H3k9me3 immunostaining resultat i Drosophila salivary körtlar. Vi kan observera en brännpunkt (figur 3b) som liknar HP1a immunostaining, (heterokromatiskt aggregat eller kondensat). En dubbel- eller trippelsignal (figur 3c) kan ses vid sällsynta tillfällen i de vilda typstammarna.

Figure 1
Figur 1. Representativ konfokal mikroskopi bild från salivary körtel immunostaining med HP1a antikroppar från vilda typ (wt). a)DNA (cyansignal), HP1a (magentasignal) och sammanslagningsskala 100 μm. Vid immunostaining för HP1a markeras en kärna med en brännpunkt med en vit pil och en kärna med två foci med en prickad linjelåda. Den högra kolumnen visar en förstorad bild av en enda kärna med en skalstång på 5 μm b) brännfördelning. c)Två högborgarfördelning. Båda kärnorna är markerade med en vit streckad linje. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2. Exempel är att räkna nuclei foci distribution avHP1a immunostaining. Den första stapeln representerar räkningen av de vilda kärnkärnorna (wt), som i figur 1. Den andra stapeln representerar en mutantstam som påverkar denna fördelning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3. Representativ konfokal mikroskopi bild från salivary körtel immunostaining med H3K9me3 antikroppar från vilda typ (wt). a) DNA (cyansignal), H3K9me3 (magentasignal) och sammanslagningsskala 100 μm. Vid immunostaining för H3K9me3.Den högra kolumnen visar en förstorad bild av en enda kärna med en skalstång på 5 μm. b) en kärna med en brännfördelning. c)Tre högborgarfördelning. Båda kärnorna är markerade med en vit streckad linje. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den cellulära funktionen hos eukaryota organismer kan definiera 3D-strukturen i kärnan, vilket stöds av interaktioner mellan olika proteiner med kromatin och olika molekyler inklusive RNA. Under de senaste tre åren har de biologiska kondensat som har haft relevans, inklusive heterokromatin, tagit en grundläggande roll i fastställandet av fasseparationen som främjar den distinkta nukleära rumsliga organisationen av aktiv och repressiv kromatin 16,17,18.

Heterochromatin är viktigt för att bevara cellfunktioner och identitet. Tidigare trodde man att dessa täta områden inte transkriberades. Men nu när vi har mer kraftfull teknik kan vi se att heterokromatin inte bara transkriberas utan också en grundläggande process för att upprätthålla kärnans byggnadsställning och är känslig för utvecklings- eller patologiska processer12,19. Dessutom behöver vissa gener inbäddade i pericentric heterochromatin en heterochromatic miljö för att fungera korrekt. HP1a mutationer minskar uttrycket av ljuset och rullade gener, som var de första som upptäcktes19. Dessa gener är väsentliga för organismens överlevnad och finns i heterochromatinblock. Som ett resultat, trots dess förmåga att inducera tystning, har denna speciella genomkomponent potential att vara mycket dynamisk20. I en komplex balans mellan kromatinbundna och diffusa typer som kan styras av olika biologiska sammanhang finns också heterochromatinrelaterade proteiner som HP1a. Det föreslogs också nyligen att fas-separation egenskaper visas av monteringen av heterochromatin kondensat21,22.

Det finns ett antal artiklar där författarna utförde hela berget immunostaining av Drosophila salivary körtelkärnor med hjälp av olika och ibland enklare protokoll23,24. I det här fallet anpassade vi ett protokoll som först beskrivs i C. elegans25, och därefter används i Drosophila salivary körtlar av fleragrupper 26,27,28,29 och kombinerade det med användning av confocal mikroskopi och mutanta organismer. Detta protokoll tillåter också visualisering av olika typer av proteiner, inklusive transkriptionsfaktorer som XPD, XPB och TBP27, men också heterochromatinbundna proteiner som HP1a och histonmärken som H3K9me3, som placerar det som ett protokoll för bred användning i denna vävnad. Det har också fördelen att vävnaden kan lagras i ett mellansteg utan att påverka polytenkromosombanding.

Detta protokoll är tillförlitligt och kostnadseffektivt på grund av användningen av en specifik antikropp för att se HP1a-proteinet. Det kritiska steget i detta protokoll är att undvika att förlora körtlarna under tvättar och väntar på att vävnaden ska bottna ut. Fördelen med att använda salivkörtlar är att en 3D-vy av kärnan och dess konformation lätt kan erhållas, i motsats till polytenkromosomtekniken som kräver en mekanisk störning av cellen och kan skada kromatin. När du utför detta protokoll bör särskild försiktighet vidtas under tvättstegen. Om den inte utförs noggrant kommer vävnaden att brytas, och det skulle inte vara möjligt att få högkvalitativa bilder.

För att utvärdera vikten av bristen på bindning av RNA till de regioner eller proteiner som observeras är det nödvändigt att lägga till en tvätt med buffert C (buffert B utan EDTA) och lägga till 100 μM RNase. Denna tvätt ska utföras i 1 timme vid 37 °C enligt tidigare beskrivet. Tvättning bör göras före det steg där molekyler tillsätts för att observera DNA (mellan steg 9.3 och 9.4).

Konfokal mikroskopi kanske inte verkar vara en mycket ny metod för att ta itu med frågor om heterokromatinkondensat25,30, men det har varit extremt användbart att identifiera omlokalisering av HP1a-proteinet i Drosophila-atomkärnor, vilket tyder på allvarliga problem i kromatinstrukturen som kan utvärderas med andra tekniker mer noggrant. Trots sin begränsning kan den användas i kombination med högupplöst mikroskopi som ett första tillvägagångssätt för att tillämpa nya tekniker för att klargöra den biologiska aktiviteten som modulerar heterochromatinkondensatmontering, kontroll och funktioner31. Några av dessa nya metoder som fokuserar på de molekylära och biofysiska interaktionerna mellan heterochromatin, RNA och heterochromatin-associerade proteiner samlas in från denna uppsättning metoder för att testa heterochromatinkondensat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Marco Antonio Rosales Vega och Abel Segura för att de tagit några av de konfikala bilderna, Carmen Muñoz för medieförberedelser och Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui och Dr. Chris Wood från LMNA för råd om användningen av mikroskopen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 11351904 brand not critical
16% formaldehyde Thermo Scientific 28908
AF1 Citifluor Ted pella 19470 25 mL
BSA, Molecular Biology Grade Roche 10735078001 brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free
protease inhibitors		 Merck 5892953001
Coverslip Corning CLS285022-200EA 22x22, brand not critical
DTT Sigma d9779 brand not critical
EDTA Sigma E5134 brand not critical
EGTA brand not critical
Glass slide Gold seal 3011 brand not critical
H3BO3 Baker 0084-01 brand not critical
H3K9me3 Abcam 8889
HP1a Hybridoma Bank C1A9 Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl Baker 3040-01 brand not critical
Methanol Baker 9070-03 brand not critical
NaCl Sigma 71376 brand not critical
NaOH brand not critical
PIPES brand not critical
Rotator Thermo Scientific 13-687-12Q  Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C Eppendorf 13527550 SmartBlock 1.5 mL
Tris Milipore 648311 brand not critical
Triton X-100 Sigma T8787 100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710 25 mL, brand not critical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).
  2. Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
  3. Kasinathan, B., et al. Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila. Elife. , 1-31 (2020).
  4. Lifschytz, E., Hareven, D. Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).
  5. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  6. Lee, Y. C. G., et al. Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin. PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).
  7. Koryakov, D. E., et al. The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).
  8. Cao, R., et al. Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing. Science. 298 (5595), 1039 (2002).
  9. Hines, K. A., et al. Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading. Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).
  10. Elgin, S. C. R., Reuter, G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).
  11. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  12. Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription. BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).
  13. Tennessen, J. M., Thummel, C. S. Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila. Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).
  14. Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling. Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).
  15. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).
  16. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  17. Larson, A. G., Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).
  18. Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α. Methods in Enzymology. , (2018).
  19. Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).
  20. Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster. Trends in Genetics. , (2019).
  21. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  22. Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
  23. Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes. Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).
  24. Kolesnikova, T. D., et al. Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene. Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).
  25. Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).
  26. Messina, G., et al. Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization. Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).
  27. Aguilar-Fuentes, J., et al. p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model. PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).
  28. Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes. Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).
  29. Farkaš, R., Mechler, B. M. The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response. Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).
  30. Zhang, P., Spradling, A. C. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).
  31. Stormo, B. M., Fox, D. T. Polyteny: still a giant player in chromosome research. Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).

Tags

Biologi Utgåva 174 Drosophila melanogaster heterochromatin salivkörtlar kromatin immunostaining HP1a
Immunofluorescerande färgning för visualisering av heterochromatin associerade proteiner i <em>Drosophila</em> Salivary Körtlar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meyer-Nava, S., Zurita, M.,… More

Meyer-Nava, S., Zurita, M., Valadez-Graham, V. Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands. J. Vis. Exp. (174), e62408, doi:10.3791/62408 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter