Biology

כתמים אימונופלואורסצנטיים להדמיה של חלבונים הקשורים הטרוכרומטין בבלוטות הרוק של דרוסופילה

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62408

Silvia Meyer-Nava¹, Mario Zurita¹, Viviana Valadez-Graham¹

¹Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

פרוטוקול זה נועד לדמיין אגרגטים הטרוקרומטין בתאי טוריטנה Drosophila.

Abstract

הדמיה של אגרגטים הטרוכרומטינים על ידי חיסון יכול להיות מאתגר. רכיבים יונקים רבים של כרומטין נשמרים Drosophila melanogaster. לכן, זהו מודל מצוין ללמוד היווצרות ותחזוקה הטרוצ'ורומטין. תאים רב-תאיים, כגון אלה שנמצאו בבלוטות הרוק של זחלי אינסטאר D. מלנוגאסטר השלישי, מספקים כלי מצוין להתבוננות בכרומטין מוגבר כמעט אלף פעמים ואפשרו לחוקרים לחקור שינויים בהתפלגות הטרוכרומטין בגרעין. למרות התצפית של רכיבי heterochromatin יכול להתבצע ישירות בתכשירי כרומוזום פוליטן, לוקליזציה של חלבונים מסוימים ניתן לשנות על ידי חומרת הטיפול. לכן, הדמיה ישירה של הטרוקרומטין בתאים משלימה סוג זה של מחקר. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את טכניקות החיסון המשמשות לרקמה זו, את השימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים משניים, ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לבחון את אגרגטים הטרוקרומטין אלה בדיוק ובפרטים גדולים יותר.

Introduction

מאז המחקרים המוקדמים של אמיל הייץ¹, הטרוכרומטין נחשב רגולטור חשוב של תהליכים תאיים כגון ביטוי גנים, הפרדה מיוטית ומיטוטית של כרומוזומים, ושמירה על יציבות הגנום²^,³^,⁴.

הטרוכרומטין מחולק בעיקר לשני סוגים: הטרוקרומטין מהווה המגדיר באופן אופייני רצפים חוזרים ונשנים, ואלמנטים הניתנים לתחלפתם הנמצאים באתרי כרומוזום ספציפיים כגון הטלומרים והצנטרומרים. סוג זה של הטרוכרומטין מוגדר בעיקר באופן אפיגנטי על ידי סימני היסטון ספציפיים כגון di או תלת-מתילציה של ליצין 9 של היסטון H3 (H3K9me3) ואת הכריכה של חלבון Heterochromatin 1a (HP1a)⁵^,⁶. מצד שני, הטרוצ'ורומטין פקולטיבי ממקם דרך זרועות הכרומוזום ומורכב בעיקר גנים מושתקים התפתחותית⁷^,⁸. חיסון של בלוקים הטרוצ'ורומטין בתאי metaphase, או תצפית של אגרגטים הטרוצ'ורומטין בתאים בין-פאזיים, חשף הרבה אור בהבנת היווצרות ותפקוד של אזורים הטרכוכרומטיים⁹.

השימוש Drosophila כמערכת מודל אפשר פיתוח של כלים חיוניים ללמוד הטרוצ'רומטין ללא שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית¹⁰. מאז התיאור של שינוי אפקט המיקום וגילוי חלבונים הקשורים להטרוכרומטין, כגון HP1a, ושינויים לאחר תרגום histone, קבוצות רבות פיתחו מספר טכניקות אימונוהיסטוכימיות המאפשרות הדמיה של אזורים הטרכוכרומטיים אלה¹⁰^,¹¹.

טכניקות אלה מבוססות על שימוש בנוגדנים ספציפיים המזהים חלבונים הקשורים להטרוכרומטין או סימני היסטון. עבור כל סוג תא ונוגדן, יש לקבוע את תנאי הקיבעון והחמלול באופן אמפירי. כמו כן, התנאים עשויים להשתנות אם נעשה שימוש בתהליכים מכניים נוספים כגון טכניקות מעיכה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש בבלוטות הרוק של Drosophila כדי לחקור מוקדים הטרוקרומטיים. בלוטות הרוק יש תאים רביטציה המכילים יותר מ -1,000 עותקים של הגנום, ובכך מספקים תצוגה מוגברת של רוב תכונות הכרומטין, למעט DNA לווין וכמה אזורים הטרכוכרומטיים אשר נמצאים תחת משוכפל. עם זאת, אזורי הטרוכרומטין מוצגים בקלות בתכשירי כרומוזום פוליטן, אך טכניקות העיוץ עלולות לעתים לשבש מתחמים אופייניים הקשורים לכרומטין או את ארכיטקטורת הכרומטין. לכן, אימונולוקלציה של חלבונים ברקמת בלוטת הרוק כולה יכול לעלות על ההשפעות הבלתי רצויות האלה. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לזהות מספר חלבונים הקשורים לכרומטין, והוכחנו כי פרוטוקול זה בשילוב עם מלאי Drosophila מוטציה יכול לשמש כדי ללמוד הפרעה הטרוקרומטין¹².

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות הזחלים השלישית

הכן 1 ליטר של מדיה סטנדרטית על ידי הוספת 100 גרם של שמרים, 100 גרם של סוכר קנים שלם מזוקק, 16 גרם אגר, 10 מ"ל של חומצה פרופיונית ו 14 גרם של ג'לטין. ממיסים את כל החומרים למעט השמרים ב 800 מ"ל של מי ברז ולאחר מכן להמיס את השמרים. יש לאלתר למשך 30 דקות.
1. לאחר מכן, לתת את התקשורת להתקרר עד 60 °C (60 °F) ולהוסיף חומצה פרופיונית לריכוז הסופי 0.01%. תן לבקבוק לעמוד עד הג'לטין נוצר.
כדי לייעל את תרבות הזחלים ה-3o instar, אספו תחילה מבוגרים בני 5 עד 10 ימים והכניסו 50 (25 גברים ו-25 נקבות) לבקבוק רחב של מדיה סטנדרטית.
מניחים את הבקבוק עם הזבובים באינקובטור טמפרטורה מבוקרת ב 25 °C (50 °F) עד מספר הביצים שהונחו הוא 50 (כ 12 שעות עבור זן סוג הבר).
לאחר זמן הדגירה נגמר, להסיר את המבוגרים ולהעביר אותם לבקבוק חדש לחזור על ההליך. תן לעוברים לגדול ב 18 °C (72 שעות)
הערה: למידע נוסף על תנאי התחזוקה של מניות Drosophila, ראה טנסין ותמימל¹³.

2. אוסף זחלים

עבור אוסף זחלים לבחור את הזחלים הנודדים כי אין אי פעם spiracles. לאחר ההסתה של הספירקלים, הזחל נכנס לשלב הטרום-אפופל, תוך שמירה על כרומוזומי פוליטן מעולים המתאימים לניתוח. רק לאחר 12 שעות מתחילים התאים של בלוטת הרוק להתכונן למוות תאי מתוכנת^14,¹⁵.
קח 15 3° זחלים instar ולשים אותם בכוס שעון לשטוף אותם. לאחר מכן העבירו אותם לתמיסת מלח קרה כקרח או PBS (1x PBS: 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ_{Na 2}HPO₄, 2 מ"מ KH₂PO₄, כוונון pH ל 7.4).
לנתח 15 עד 30 זוגות של בלוטות רוק (או רבים ככל האפשר ב 30 דקות) ב PBS קר עם מעכבי פרוטאז תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. מעבירים את בלוטות הרוק לצינור 1.5 מ"ל עם PBS קר כקרח.
לשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS בתוספת מעכבי פרוטאז. חכה שהרקמה תגיע לתחתית הצינור.
לאחר הכביסה, להסיר את PBS עם 1000 μL pipette. יש להקפיד לא לגעת ברקמה.
1. לחלופין, לנתח את בלוטות הרוק ב 5 מ"ל של PBS כדי לחסל את הצורך בשלב כביסה זה ולהמשיך לשלב 3 על ידי העברת בלוטות הרוק ל 0.5 מ"ל של רובקון תיקון חוצץ המתואר להלן.

3. קיבוע רקמת בלוטת הרוק

לאחר הסרת PBS מהשלב האחרון, הוסף ישירות 0.5 מ"ל של 1x Ruvkun תיקון חוצץ, עם 50% מתנול (להוסיף 0.5 מ"ל של מתנול) ו 2% פורמלדהיד.
הערה: פתרון 2x Ruvkun הוא 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES ב pH 7.4.
דגירה במשך 2 שעות ב 4 °C (5 °F) עם סיבוב מתון.

4. שטיפת רקמות בלוטת הרוק

בצע שטיפת סיבוב אחת של 5 דקות עם 1 מ"ל של חיץ טריס/טריטון (100 mM Tris pH 7.4, 1% טריטון X-100 ו- 1 mM EDTA).
הערה: המתן עד שהרקמה תגיע לתחתית הצינור.

5. פרמזביליזציה

לדגור על בלוטות הרוק ב 1 מ"ל של טריס / טריטון X-100 (זהה לעיל). עבור חלבונים מסוימים ייתכן שיהיה צורך להוסיף 1% β-mercaptoethanol.
דגירה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד קל (300 סל"ד).

6. שלב השימור (אופציונלי)

הערה: אם לא ממשיכים מיד לדגירה עם הנוגדן, לשמר את הרקמה כדלקמן.

לשטוף עם 1 מ"ל של BO₃חוצץ (0.01 M H₃BO₃ pH 9.2 + 0.01 M NaOH) ולאחר מכן דגירה BO₃/10mM DTT ב 37 ° C עם רועד קל (300 סל"ד) במשך 15 דקות.
בסוף תקופת הדגירה, בצע לשטוף עם 1 מ"ל של חיץ BO₃ לבד.
הערה: המתן עד שהרקמה תגיע לתחתית הצינור.
הוסף 1 מ"ל של PBS. שמור על הרקמה בתמיסה זו ב 4 °C (72 שעות) ולאחר מכן להמשיך עם השלב הבא. שלב זה מועיל במיוחד בעת עבודה עם זנים מוטנטיים שונים שעשויים להציג מחזור חיים מאוחר, כך שניתן לבצע את החיסון בו זמנית יחד עם הפקדים.

7. חסימת רקמות

לדגור על בלוטות הרוק ב 1 מ"ל של חוצץ B (PBS + 0.1% BSA + 0.5% טריטון X-100 + 1 mM EDTA) במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם סיבוב.

8. חיסונים

הסר את כל המאגר B והוסף מאגר A (PBS + 0.1% BSA) בתוספת נוגדן של עניין.
הערה: אנו משתמשים ב- HP1a C1A9c (נוגדן מרוכז) מבנק Hybridoma עד השעה 1:3000. בעת שימוש C1A9s (supernatant) ניסינו מ 1: 100 כדי 1:500 דילול וכל דילול בין דרגה זו עובד טוב) לילה ב 4 oC עם סיבוב. בשלב זה חשוב כי הרעידות לא להעלות בועות אשר עלול לפגוע בנוגדן.

9. כביסה חיסונית

בצע שטיפות של 3 x 15 דקות עם חוצץ B מתחת לבחוש בטמפרטורת החדר באמצעות 1 מ"ל בכל פעם.
העבר את הבלוטות כדי חוצץ B יחד עם הנוגדן המשני בשילוב פלואורופור במשך 2 שעות תחת סיבוב ב 4 oC (נוגדן משני Alexa פלואור 568 Invitrogen שימשו 1:3000).
1. לכסות את הצינור עם רדיד נייר אלומיניום כדי להגן על הנוגדן המשני מפני האור.
בצע 2 x 15 דקות שטיפות בטמפרטורת החדר תוך סיבוב עם 1 מ"ל של חוצץ B.
דגירה עם סמן DNA כגון Sytox (לקחת 2 μL של 5 mM מלאי להתמוסס 1 מ"ל של חוצץ B) או Hoechst (לקחת 1 μL של 10 מ"ג / מ"ל מלאי להתמוסס 1 מ"ל של חוצץ B) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב.
בצע לשטוף אחד עם חוצץ B ופעם אחת עם PBS, כל לשטוף נמשך 10 דקות תוך סיבוב בטמפרטורת החדר.
הערה: זכור להגן עליו מפני האור.

10. הדמיה

הר בלוטות הרוק על שקופית, מה שהופך בריכה עם כיסוי.
שים את בלוטות הרוק באמצע הבריכה לכסות עם citifluor AF1 כדי למנוע היווצרות של בועות הרחבת הנוזל הצמיג בכל מקום. ואז לאטום את כל הצדדים עם לק ברור.
שימו לב תחת פלואורסצנטיות או מיקרוסקופ קונפוקלי. אם המדגם לא הולך להיות נצפה באותו יום, לאחסן הרחק מהאור ב 4 °C (50 °F).
השתמש במנסרה של GraphPad 6 כדי ליצור את כל הגרפים ניתחוים סטטיסטיים.
נתח את הנתונים מהפצת HP1a בבלוטות הרוק באמצעות בדיקת Kruskal-Wallis. משמעות סטטיסטית נקבעה ב ( p < 0.05 *, < 0.01 **, < 0.001**, < 0.0001****).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות מייצגות של HP1a חיסוני בבלוטות הרוק של Drosophila מוצגות באיור 1. תוצאה חיובית היא להתבונן בנקודת מוקד אחת (איור 1a) (צבירה או עיבוי הטרכוכרומטי). תוצאה שלילית היא לא אות או אות מפוזר. לפעמים ניתן לצפות באות כפול, כלומר, עם נקודה כפולה (איור 1c), אך הוא מתרחש בדרך כלל בכמויות קטנות יותר.

ניתן לייצג ניתוח נתונים כופרפים של עמודות, תוך השוואת ההתפלגות של HP1a בתוך רקעים מוטנטיים שונים. לדוגמה, באיור 2 ניתן לראות ש-98% מהגרעין מסוג הבר מציג התפלגות של מוקד אחד ו-2% מהגרעין מציג שני מוקדים, בעוד שבמוטציה, השיעור משתנה ונוכחותם של שני מוקדים עולה ל-40%.

איור 3 מראה תוצאות חיסון H3k9me3 מייצגות בבלוטות הרוק של דרוסופיל. אנו יכולים לצפות בנקודת מוקד אחת (איור 3b) הדומה לחיסון HP1a (צבירה או עיבוי הטרכוכרומטי). אות כפול או משולש (איור 3c) ניתן לראות במקרים נדירים בזני סוג הבר.

איור 1. תמונת מיקרוסקופיה קונפוקלית מייצגת מבלוטת הרוק המחסן בנוגדן HP1a מסוג בר (wt). a) DNA (אות ציאן), HP1a (אות מגנטה) וסרגל קנה מידה מיזוג 100 מיקרומטר. בחיסון עבור HP1a, גרעין עם נקודת מוקד מסומן בחץ לבן ובגרעין עם שני מוקדים עם תיבת קו מנוקד. העמודה הימנית מציגה תמונה מוגדלת של גרעין יחיד עם סרגל קנה מידה של 5 מיקרומטר. b) התפלגות מוקד. ג) שתי חלוקת מוקדים. שני הגרעינים מסומנים בקו מקווקו לבן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2. דוגמאות נובעות מספירת התפלגות מוקדי גרעינים של חיסוןHP1a. הסרגל הראשון מייצג את ספירת הגרעינים הפראיים (wt), כמו באיור 1. הבר השני מייצג זן מוטנטי שמשפיע על ההתפלגות הזו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3. תמונת מיקרוסקופיה קונפוקלית מייצגת מבלוטת הרוק המחסן בנוגדן H3K9me3 מסוג בר (wt). a) DNA (אות ציאן), H3K9me3 (אות מגנטה) וסרגל קנה מידה מיזוג 100 מיקרומטר. בחיסון עבור H3K9me3.העמודה הימנית מציגה תמונה מוגדלת של גרעין יחיד עם סרגל קנה מידה של 5 מיקרומטר. b) גרעין עם התפלגות מוקד. ג) התפלגות של שלושה מוקדים. שני הגרעינים מסומנים בקו מקווקו לבן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפונקציה התאית של אורגניזמים אאוקריוטים יכולה להגדיר את המבנה התלת-ממדי בתוך הגרעין, הנתמך על ידי אינטראקציות בין חלבונים שונים עם כרומטין ומולקולות שונות כולל RNA. בשלוש השנים האחרונות, העיבויים הביולוגיים שיש להם רלוונטיות, כולל הטרוצ'ורומטין, לקחו תפקיד בסיסי בקביעת הפרדת השלבים המקדמת את הארגון המרחבי הגרעיני המובהק של כרומטין פעיל ודכאני ¹⁶^,¹⁷^,¹⁸.

הטרוכרומטין חיוני לשמירה על תפקודי התא וזהותו. בעבר סברו כי אזורים צפופים אלה לא תועתקו. עם זאת, עכשיו שיש לנו טכנולוגיות חזקות יותר, אנו יכולים לראות כי הטרוכרומטין הוא לא רק מתעתק אלא גם תהליך בסיסי כדי לשמור על הפיגומים של הגרעין והוא רגיש לתהליכים התפתחותיים או פתולוגיים¹²^,¹⁹. חוץ מזה, גנים מסוימים המוטמעים בהטרוכרומטין פריקנטרי זקוקים לסביבה הטרוצ'רומטית כדי לתפקד כראוי. מוטציות HP1a מפחיתות את הביטוי של האור והגנים המגולגלים, שהיו הראשונים שהתגלו¹⁹. גנים אלה חיוניים להישרדות האורגניזם ונמצאים בבלוקים הטרוצ'רומטינים. כתוצאה מכך, למרות יכולתו לגרום להשתקה, לרכיב הגנום המוזר הזה יש פוטנציאל להיות דינמי מאוד²⁰. באיזון מורכב בין סוגים הקשורים לכרומטין לבין סוגים מפוזרים שניתן לשלוט בהם בהקשרים ביולוגיים שונים, קיימים גם חלבונים הקשורים להטרוכרומטין כגון HP1a. כמו כן הוצע לאחרונה כי תכונות הפרדת פאזה מוצגים על ידי הרכבה של עיבוי הטרוצ'רומטין^21,²².

ישנם מספר מאמרים שבהם המחברים ביצעו חיסון מלא של גרעין בלוטת הרוק Drosophila באמצעות פרוטוקולים שונים ולפעמים פשוטים^{יותר 23}^,²⁴. במקרה זה התאמנו פרוטוקול שתואר לראשונה ב C. elegans²⁵, ולאחר מכן נעשה שימוש בבלוטות הרוק Drosophila על ידי מספר קבוצות²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹ ושילב אותו עם שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית ואורגניזמים מוטנטיים. פרוטוקול זה מאפשר גם הדמיה של סוגים שונים של חלבונים, כולל גורמי שעתוק כגון XPD, XPB ו- TBP²⁷, אך גם חלבונים הקשורים להטרוכרומטין כגון סימני HP1a והיסטון כגון H3K9me3, הממקם אותו כפרוטוקול לשימוש נרחב ברקמה זו. יש לו גם את היתרון כי הרקמה ניתן לאחסן בשלב ביניים מבלי להשפיע על פסים כרומוזום פוליטן.

פרוטוקול זה אמין וחסכוני עקב שימוש בנוגדן ספציפי להצגת חלבון HP1a. השלב הקריטי בפרוטוקול זה הוא להימנע מאובדן הבלוטות במהלך הכביסה ולחכות שהרקמה תתכוומה. היתרון של שימוש בבלוטות הרוק הוא כי תצוגה 3D של הגרעין ואת הקונפורמציה שלה ניתן להשיג בקלות, בניגוד לטכניקת כרומוזום פוליטן הדורשת הפרעה מכנית של התא יכול לפגוע הכרומטין. בעת ביצוע פרוטוקול זה, יש לנקוט זהירות מיוחדת במהלך שלבי הכביסה. אם לא מבוצע בקפידה, הרקמה תישבר, ולא ניתן יהיה להשיג תמונות באיכות גבוהה.

כדי להעריך את החשיבות של חוסר כריכה של RNA לאזורים או חלבונים שנצפו, יש צורך להוסיף לשטוף עם חוצץ C (חוצץ B ללא EDTA) ולהוסיף 100 מיקרומטר של RNase. כביסה זו צריכה להתבצע במשך 1 שעות ב 37 °C (50 °F) כפי שתואר בעבר. כביסה צריכה להיעשות לפני השלב שבו מולקולות מתווספות להתבונן ב- DNA (בין שלבים 9.3 ו 9.4).

מיקרוסקופיה קונפוקלית אולי לא נראה כמו מתודולוגיה חדשה מאוד כדי לענות על שאלות של עיבוי הטרוקרומטין²⁵^,³⁰, אבל זה היה מאוד שימושי כדי לזהות delocalization של חלבון HP1a בגרעין Drosophila, אשר מציע בעיות חמורות במבנה כרומטין שניתן להעריך עם טכניקות אחרות ביסודיות רבה יותר. למרות המגבלה שלה, זה יכול לשמש בשילוב עם מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה כגישה ראשונה ליישם טכניקות חדשניות כדי להבהיר את הפעילות הביולוגית כי מווסת את ההרכבה, שליטה, פונקציות הטרוכרומטין³¹. חלק מהמתודולוגיות החדשות הללו המתמקדות באינטראקציות המולקולריות והביופיסיות בין הטרוכרומטין, RNA וחלבונים הקשורים להטרוכרומטין נאספים מסט שיטות זה לבדיקת עיבוי הטרוקרומטין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים למרקו אנטוניו רוסאלס וגה ואייבל סגורה על שלקחו חלק מהתמונות הקונפוקליות, כרמן מוניוז על ההכנה לתקשורת וד"ר ארתורו פימנטל, מ.C ארנס סרלגי וד"ר כריס ווד מה- LMNA לקבלת ייעוץ על השימוש במיקרוסקופים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen MCT-150-C	11351904	brand not critical
16% formaldehyde	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molecular Biology Grade	Roche	10735078001	brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors	Merck	5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22x22, brand not critical
DTT	Sigma	d9779	brand not critical
EDTA	Sigma	E5134	brand not critical
EGTA			brand not critical
Glass slide	Gold seal	3011	brand not critical
H₃BO₃	Baker	0084-01	brand not critical
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	brand not critical
Methanol	Baker	9070-03	brand not critical
NaCl	Sigma	71376	brand not critical
NaOH			brand not critical
PIPES			brand not critical
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	brand not critical
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, brand not critical