Summary
Este protocolo tiene como objetivo visualizar agregados de heterocromatina en células de Politeno de Drosophila.
Abstract
La visualización de los agregados de la heterocromatina immunostaining puede ser desafiadora. Muchos componentes mamíferos de la cromatina se conservan en Drosophila melanogaster. Por lo tanto, es un excelente modelo para estudiar la formación y el mantenimiento de la heterocromatina. Las células politenizadas, como las que se encuentran en las glándulas salivales de las larvas de D. melanogaster de tercer estadio, proporcionan una excelente herramienta para observar la cromatina amplificada casi mil veces y han permitido a los investigadores estudiar los cambios en la distribución de la heterocromatina en el núcleo. Aunque la observación de los componentes de la heterocromatina se puede llevar a cabo directamente en preparaciones cromosómicas de politeno, la localización de algunas proteínas puede verse alterada por la gravedad del tratamiento. Por lo tanto, la visualización directa de la heterocromatina en las células complementa este tipo de estudio. En este protocolo, describimos las técnicas immunostaining usadas para este tejido, el uso de anticuerpos fluorescentes secundarios, y la microscopia confocal de observar estos agregados de la heterocromatina con mayor precisión y detalle.
Introduction
Desde los primeros estudios de Emil Heitz1,la heterocromatina ha sido considerada un importante regulador de procesos celulares como la expresión génica, la separación meiótica y mitótica de los cromosomas, y el mantenimiento de la estabilidad del genoma2,3,4.
La heterocromatina se divide principalmente en dos tipos: heterocromatina constitutiva que define característicamente secuencias repetitivas, y elementos transponibles que están presentes en sitios cromosómicos específicos como los telómeros y centrómeros. Este tipo de heterocromatina se define principalmente epigenéticamente por marcas de histonas específicas como la di o tri-metilación de la lisina 9 de la histona H3 (H3K9me3) y la unión de la proteína heterocromatina 1a (HP1a)5,6. Por otro lado, la heterocromatina facultativa se localiza a través de los brazos del cromosoma y consiste principalmente en genes silenciados por el desarrollo7,8. La inmunotinción de bloques de heterocromatina en células metafásicas, o la observación de agregados de heterocromatina en células interfase, ha revelado mucha luz en la comprensión de la formación y función de las regiones heterocromáticas9.
El uso de Drosophila como sistema modelo ha permitido el desarrollo de herramientas esenciales para estudiar la heterocromatina sin el uso de microscopía electrónica10. Desde la descripción de la posición del efecto variegación y el descubrimiento de proteínas asociadas a la heterocromatina, como la HP1a, y las modificaciones postraduccionales de histonas, muchos grupos han desarrollado varias técnicas inmunohistoquímicas que permiten la visualización de estas regiones heterocromáticas10,11.
Estas técnicas se basan en el uso de anticuerpos específicos que reconocen proteínas asociadas a la heterocromatina o marcas de histonas. Para cada tipo de célula y anticuerpo, las condiciones de fijación y permeabilización deben determinarse empíricamente. Además, las condiciones pueden variar si se utilizan procesos mecánicos adicionales como técnicas de aplastamiento. En este protocolo, describimos el uso de las glándulas salivales de Drosophila para estudiar focos heterocromáticos. Las glándulas salivales tienen células politenizadas que contienen más de 1.000 copias del genoma, proporcionando así una vista amplificada de la mayoría de las características de la cromatina, con la excepción del ADN satélite y algunas regiones heterocromáticas que están poco replicadas. Sin embargo, las regiones de la heterocromatina se visualizan fácilmente en preparaciones del cromosoma del politeno, pero las técnicas que aplastan pueden interrumpir a veces los complejos cromatina-limitados característicos o la arquitectura de la cromatina. Por lo tanto, la inmunolocalización de proteínas en el tejido entero de la glándula salival puede superar estos efectos no deseados. Hemos utilizado este protocolo para detectar varias proteínas ligadas a la cromatina, y hemos demostrado que este protocolo combinado con cepas mutantes de Drosophila puede ser utilizado para estudiar la disrupción de la heterocromatina12.
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Protocol
1. Cultivo de larvas de tercer estadio
- Preparar 1 litro de medio estándar añadiendo 100 g de levadura, 100 g de azúcar de caña entera sin refinar, 16 g de agar, 10 mL de ácido propiónico y 14 g de gelatina. Disuelva todos los ingredientes excepto la levadura en 800 mL de agua del grifo y luego disuelva la levadura. Autoclave inmediatamente durante 30 minutos.
- Después, deje que el medio se enfríe a 60 °C y agregue ácido propiónico a una concentración final al 0.01%. Dejar reposar la botella hasta que se forme la gelatina.
- Para optimizar el cultivo de larvas de 3o instar, primero recoja a los adultos mayores de 5 a 10 días y coloque 50 (25 machos y 25 hembras) en una botella de cuello ancho de medios estándar.
- Coloque la botella con las moscas en una incubadora de temperatura controlada a 25 °C hasta que el número de huevos puestos sea de 50 (aproximadamente 12 horas para la cepa de tipo salvaje).
- Después de que el tiempo de incubación haya terminado, retire los adultos y transfiéralos a una nueva botella para repetir el procedimiento. Dejar que los embriones crezcan a 18 °C durante 72 horas
NOTA: Para obtener más información sobre las condiciones de mantenimiento de las existencias de Drosophila, consulte Tennessen &Thymmel13.
2. Colección de larvas
- Para la recolección de larvas elija las larvas errantes que no tienen espiráculos everted. Después de la eversión de los espiráculos, la larva entra en la etapa prepupal, conservando excelentes cromosomas politeno adecuados para el análisis. Sólo después de 12 horas las células de la glándula salival comienzan a prepararse para la muerte celular programada14,15.
- Tome quince larvas de 3° y colótelas en un vaso de reloj para lavarlas. Luego transferirlos a una solución salina helada o PBS (1x PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4,ajustar el pH a 7.4).
- Diseccione de 15 a 30 pares de glándulas salivales (o tantas como sea posible en 30 minutos) en PBS frío con inhibidores de la proteasa bajo el microscopio estereoscópico. Transfiera las glándulas salivales a un tubo de 1,5 mL con PBS helado.
- Lavar una vez con 1 mL de PBS más inhibidores de la proteasa. Espere a que el tejido llegue a la parte inferior del tubo.
- Después del lavado, retire el PBS con una pipeta de 1000 μL. Tenga cuidado de no tocar el tejido.
- Alternativamente, diseccione las glándulas salivales en 5 mL de PBS para eliminar la necesidad de esta etapa de lavado y proceda a la etapa 3 transfiriendo las glándulas salivales a 0,5 mL del tampón de fijación de Ruvkun que se describe a continuación.
3. Fijación del tejido de la glándula salival
- Después de retirar el PBS del último paso, agregue directamente 0.5 mL de 1x tampón de fijación de Ruvkun, con 50% de metanol (agregue 0.5 mL de metanol) y 2% de formaldehído.
NOTA: 2x solución de Ruvkun es 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM TUBERÍAS a pH 7.4. - Incubar durante 2 horas a 4 °C con rotación suave.
4. Lavado de tejido de las glándulas salivales
- Realizar un lavado de rotación de 5 minutos con 1 mL de tampón Tris/Tritón (100 mM Tris pH 7,4, 1% Tritón X-100 y 1 mM EDTA).
NOTA: Espere a que el tejido llegue a la parte inferior del tubo.
5. Permeabilización
- Incubar las glándulas salivales en 1 mL de Tris/Triton X-100 (lo mismo que arriba). Para algunas proteínas podría ser necesario añadir un 1% β-mercaptoetanol.
- Incubar durante 2 horas a 37°C con temblor leve (300 rpm).
6. Paso de preservación (opcional)
NOTA: Si no procede inmediatamente a la incubación con el anticuerpo, preservar el tejido de la siguiente manera.
- Lavar con 1 mL de Tampón BO3 (0.01 M H3BO3 pH 9.2 + 0.01 M NaOH) y luego incubar en BO3/10 mM TDT a 37 °C con agitación leve (300 rpm) durante 15 minutos.
- Al final del período de incubación, realice un lavado con 1 mL de BO3 tampón solo.
NOTA: Espere a que el tejido llegue a la parte inferior del tubo. - Añadir 1 mL de PBS. Conservar el tejido de esta solución a 4 °C durante un hasta 72 horas y luego continuar con el siguiente paso. Este paso es particularmente útil cuando se trabaja con diferentes cepas mutantes que pueden presentar un ciclo de vida retrasado, por lo que la inmunodetección se puede realizar al mismo tiempo junto con los controles.
7. Bloqueo de tejidos
- Incubar las glándulas salivales en 1 mL de Buffer B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) durante 2 horas a temperatura ambiente con rotación.
8. Inmunosutención
- Retire todo el tampón B y agregue el tampón A (PBS + 0.1% BSA) más anticuerpos de interés.
NOTA: Utilizamos el HP1a C1A9c (anticuerpo concentrado) de Hybridoma Bank hasta 1:3000. Al usar el C1A9s (sobrenadante) hemos intentado de 1:100 a una dilución de 1:500 y cualquier dilución entre este rango funciona bien) durante la noche a 4 oC con rotación. En este punto es importante que la sacudida no levante burbujas que podrían dañar el anticuerpo.
9. Lavado inmunosutensible
- Realice lavados de 3 x 15 minutos con tampón B bajo agitación a temperatura ambiente usando 1 mL cada vez.
- Transfiera las glándulas al almacenador intermediario B junto con el anticuerpo secundario acoplado a un fluoróforo por 2 horas bajo rotación en 4 oC (el anticuerpo secundario Alexa fluor 568 Invitrogen fue utilizado 1:3000).
- Cubra el tubo con papel de aluminio para proteger el anticuerpo secundario de la luz.
- Realizar lavados de 2 x 15 minutos a temperatura ambiente mientras se realiza la rotación con 1 mL de Buffer B.
- Incubar con un marcador de ADN como Sytox (tomar 2 μL de 5 mM y disolver en 1 mL de Buffer B) o Hoechst (tomar 1 μL de 10 mg/mL de stock y disolver en 1 mL de Buffer B) durante 10 minutos a temperatura ambiente con rotación.
- Realice un lavado con Buffer B y una vez con PBS, cada lavado con una duración de 10 minutos mientras gira a temperatura ambiente.
NOTA: Recuerde protegerlo de la luz.
10. Imágenes
- Monte las glándulas salivales en un tobogán, haciendo una piscina con un cubrebocas.
- Poner las glándulas salivales en el centro de la piscina y cubrir con AF1 citifluor para evitar la formación de burbujas que extienden el líquido viscoso por todo el lugar. A continuación, selle todos los lados con esmalte de uñas transparente.
- Observar bajo un microscopio de fluorescencia o confocal. Si la muestra no se va a observar el mismo día, guárdelo lejos de la luz a 4 °C.
- Utilice GraphPad Prism 6 para generar todos los gráficos y análisis estadísticos.
- Analice los datos de la distribución de HP1a en glándulas salivales utilizando la prueba de Kruskal-Wallis. La significación estadística se fijó en (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****).
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Representative Results
Los resultados representativos de la inmunotensión de HP1a en las glándulas salivales de Drosophila se muestran en la Figura 1. Un resultado positivo es observar un punto focal(Figura 1a)(agregado heterocromático o condensado). Un resultado negativo es ninguna señal o una señal dispersa. A veces se puede observar una señal doble, es decir, con un punto doble (Figura 1c), pero por lo general se produce en cantidades más pequeñas.
El análisis de datos se puede representar como gráficos de barras, comparando la distribución de HP1a dentro de diferentes fondos mutantes. Por ejemplo, en la Figura 2 podemos ver que el 98% de los núcleos de tipo salvaje presentan una distribución de un punto focal y el 2% de los núcleos presentan dos focos, mientras que en el mutante, la proporción cambia, y la presencia de dos focos aumenta hasta el 40%.
La Figura 3 muestra resultados representativos de inmunotensión de H3k9me3 en las glándulas salivales de Drosophila. Podemos observar un punto focal(Figura 3b)que se asemeja a la inmunotensión hp1a, (agregado heterocromático o condensado). Una señal doble o triple (Figura 3c) se puede ver en raras ocasiones en las cepas de tipo salvaje.
Figura 1. Imagen confocal representativa de la microscopia de la glándula salival immunostaining con el anticuerpo de HP1a del tipo salvaje (peso). a)ADN (señal cian), HP1a (señal magenta) y barra de escala de fusión de 100 μm. En la inmunotensión para HP1a, un núcleo con un punto focal está marcado con una flecha blanca y un núcleo con dos focos con una caja de líneas punteadas. La columna de la derecha muestra una imagen ampliada de un solo núcleo con una barra de escala de 5 μm. b)de distribución focal. c)distribución de dos focos. Ambos núcleos están marcados con una línea discontinua blanca. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2. Los ejemplos resultan de contar la distribución de los focos de los núcleos deHP1a immunostaining. La primera barra representa el conteo de los núcleos de tipo salvaje (wt), como en la Figura 1. La segunda barra representa una cepa mutante que afecta a esta distribución. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3. Imagen confocal representativa de la microscopia de la glándula salival immunostaining con el anticuerpo H3K9me3 del tipo salvaje (peso). a)ADN (señal cian), H3K9me3 (señal magenta) y barra de escala de fusión de 100 μm. En inmunostaining para H3K9me3.La columna derecha muestra una imagen magnificada de un solo núcleo con una barra de escala de 5 μm. b)un núcleo con una distribución focal. c) distribución de tres focos. Ambos núcleos están marcados con una línea discontinua blanca. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
La función celular de los organismos eucariotas puede definir la estructura 3D dentro del núcleo, que está respaldada por interacciones entre diferentes proteínas con cromatina y varias moléculas, incluido el ARN. En los últimos tres años, los condensados biológicos que han tenido relevancia, incluida la heterocromatina, han tomado un papel fundamental en la determinación de la separación de fases promoviendo la organización espacial nuclear distinta de la cromatina activa y represiva 16,17,18.
La heterocromatina es esencial para preservar las funciones celulares y la identidad. Anteriormente se pensaba que estas áreas densas no fueron transcritas. Sin embargo, ahora que contamos con tecnologías más potentes, podemos ver que la heterocromatina no sólo se transcribe sino que también es un proceso fundamental para mantener el andamio del núcleo y es sensible a procesos de desarrollo o patológicos12,19. Además, ciertos genes incrustados en la heterocromatina pericéntrica necesitan un entorno heterocromático para funcionar correctamente. Las mutaciones hp1a reducen la expresión de los genes light y laminado, que fueron los primeros en serdescubiertos 19. Estos genes son esenciales para la supervivencia del organismo y se encuentran en bloques de heterocromatina. Como resultado, a pesar de su capacidad para inducir el silenciamiento, este peculiar componente del genoma tiene el potencial de ser muy dinámico20. En un equilibrio complejo entre los tipos ligados a la cromatina y difusos que pueden ser controlados por diversos contextos biológicos, también existen proteínas asociadas a la heterocromatina como la HP1a. También se sugirió recientemente que las propiedades de separación de fases se muestran mediante el ensamblaje de condensados de heterocromatina21,22.
Hay una serie de artículos en los que los autores llevaron a cabo inmunotensión de montaje completo de núcleos de glándulas salivales de Drosophila utilizando protocolos diferentes y a veces más simples23,24. En este caso adaptamos un protocolo descrito por primera vez en C. elegans25,y posteriormente utilizado en las glándulas salivales de Drosophila por varios grupos26,27,28,29 y lo combinamos con el uso de microscopía confocal y organismos mutantes. Este protocolo también permite la visualización de diferentes tipos de proteínas, incluyendo factores de transcripción como XPD, XPB y TBP27,pero también proteínas ligadas a heterocromatina como HP1a y marcas de histonas como H3K9me3, lo que lo posiciona como un protocolo para un amplio uso en este tejido. También tiene la ventaja de que el tejido se puede almacenar en un paso intermedio sin afectar las bandas cromosómicas del politeno.
Este protocolo es fiable y rentable debido al uso de un anticuerpo específico para ver la proteína HP1a. El paso crítico en este protocolo es evitar perder las glándulas durante los lavados y esperar a que el tejido toque fondo. La ventaja de utilizar glándulas salivales es que se puede obtener fácilmente una vista 3D del núcleo y su conformación, en contraste con la técnica cromosómica politeno que requiere una interrupción mecánica de la célula y puede dañar la cromatina. Durante la realización de este protocolo, se debe tener especial cuidado durante los pasos de lavado. Si no se realiza cuidadosamente, el tejido se romperá, y no sería posible obtener imágenes de alta calidad.
Para evaluar la importancia de la falta de unión del ARN a las regiones o proteínas que se están observando, es necesario añadir un lavado con Buffer C (Buffer B sin EDTA) y añadir 100 μM de ARNasa. Este lavado debe llevarse a cabo durante 1 h a 37 °C como se describió anteriormente. El lavado debe hacerse antes de la etapa donde se añaden moléculas para observar el ADN (entre los pasos 9.3 y 9.4).
La microscopía confocal puede no parecer una metodología muy nueva para abordar cuestiones de condensados de heterocromatina25,30,pero ha sido extremadamente útil para identificar la deslocalización de la proteína HP1a en los núcleos de Drosophila, lo que sugiere problemas graves en la estructura de la cromatina que se pueden evaluar con otras técnicas más a fondo. A pesar de su limitación, puede ser utilizado en combinación con microscopía de alta resolución como primer acercamiento para aplicar nuevas técnicas para aclarar la actividad biológica que modula el ensamblaje, control y funciones del condensado de heterocromatina31. Algunas de estas nuevas metodologías que se centran en las interacciones moleculares y biofísicas entre heterocromatina, ARN y proteínas asociadas a la heterocromatina se recopilan de este conjunto de métodos para probar condensados de heterocromatina.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos a Marco Antonio Rosales Vega y Abel Segura por tomar algunas de las imágenes confocales, a Carmen Muñoz por la preparación de los medios y al Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui y al Dr. Chris Wood del LMNA por el asesoramiento sobre el uso de los microscopios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
| 16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
| BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
| Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
| Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22x22, brand not critical |
| DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
| EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
| EGTA | brand not critical | ||
| Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
| H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
| H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
| HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
| KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
| Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
| NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
| NaOH | brand not critical | ||
| PIPES | brand not critical | ||
| Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
| Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
| Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |
References
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