Summary
Dieses Protokoll zielt darauf ab, Heterochromatin-Aggregate in Drosophila-Polyten-Zellen zu visualisieren.
Abstract
Die Visualisierung von Heterochromatin-Aggregaten durch Immunfärbung kann eine Herausforderung sein. Viele Säugetierkomponenten von Chromatin sind in Drosophila melanogaster konserviert. Daher ist es ein ausgezeichnetes Modell, um die Bildung und Aufrechterhaltung von Heterochromatin zuuntersuchen. Polytenisierte Zellen, wie sie in Speicheldrüsen von Larven des dritten InstarS D. melanogaster gefunden werden, bieten ein hervorragendes Werkzeug, um das Chromatin fast tausendmal verstärkt zu beobachten, und haben es forschern ermöglicht, Veränderungen in der Verteilung von Heterochromatin im Kern zu untersuchen. Obwohl die Beobachtung von Heterochromatinkomponenten direkt in Polytenchromosompräparaten durchgeführt werden kann, kann die Lokalisation einiger Proteine durch die Schwere der Behandlung verändert werden. Daher ergänzt die direkte Visualisierung von Heterochromatin in Zellen diese Art von Studie. In diesem Protokoll beschreiben wir die für dieses Gewebe verwendeten Immunfärbungstechniken, die Verwendung sekundärer fluoreszierender Antikörper und die konfokale Mikroskopie, um diese Heterochromatinaggregate genauer und detaillierter zu beobachten.
Introduction
Seit den frühen Studien zu Emil Heitz1gilt Heterochromatin als wichtiger Regulator zellulärer Prozesse wie Genexpression, meiotische und mitotische Trennung von Chromosomen und die Aufrechterhaltung der Genomstabilität2,3,4.
Heterochromatin wird hauptsächlich in zwei Typen unterteilt: konstitutives Heterochromatin, das charakteristisch repetitive Sequenzen definiert, und transponierbare Elemente, die an bestimmten Chromosomenstellen wie den Telomeren und Zentromeren vorhanden sind. Diese Art von Heterochromatin wird hauptsächlich epigenetisch durch spezifische Histonmarkierungen wie die Di- oder Trimethylierung von Lysin 9 des Histons H3 (H3K9me3) und die Bindung des Heterochromatinproteins 1a (HP1a)5,6definiert. Auf der anderen Seite lokalisiert fakultatives Heterochromatin durch die Arme des Chromosoms und besteht hauptsächlich aus entwicklungsstillierten Genen7,8. Die Immunfärbung von Heterochromatinblöcken in Metaphasenzellen oder die Beobachtung von Heterochromatinaggregaten in Interphasenzellen hat viel Licht in das Verständnis der Bildung und Funktion heterochromatischer Regionenenthüllt 9.
Die Verwendung von Drosophila als Modellsystem hat die Entwicklung wesentlicher Werkzeuge zur Untersuchung von Heterochromatin ohne den Einsatz von Elektronenmikroskopie ermöglicht10. Seit der Beschreibung der Positionseffektvariegation und der Entdeckung von Heterochromatin-assoziierten Proteinen wie HP1a und histon-posttranslationalen Modifikationen haben viele Gruppen mehrere immunhistochemische Techniken entwickelt, die eine Visualisierung dieser heterochromatischen Regionen ermöglichen10,11.
Diese Techniken basieren auf der Verwendung spezifischer Antikörper, die Heterochromatin-assoziierte Proteine oder Histonmarkierungen erkennen. Für jeden Zelltyp und Antikörper müssen die Fixations- und Permeabilisationsbedingungen empirisch bestimmt werden. Die Bedingungen können auch variieren, wenn zusätzliche mechanische Verfahren wie Quetschtechniken verwendet werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von Drosophila Speicheldrüsen zur Untersuchung heterochromatischer Herde. Speicheldrüsen haben polytenisierte Zellen, die mehr als 1.000 Kopien des Genoms enthalten, so dass eine verstärkte Ansicht der meisten Chromatinmerkmale, mit Ausnahme der Satelliten-DNA und einiger heterochromatischer Regionen, die unterrepliziert sind, möglich ist. Dennoch sind Heterochromatinregionen in Polytenchromosompräparaten leicht sichtbar, aber die Squashing-Techniken können manchmal charakteristische Chromatin-gebundene Komplexe oder die Chromatin-Architektur stören. Daher kann die Immunlokalisierung von Proteinen im gesamten Speicheldrüsengewebe diese unerwünschten Effekte übertreffen. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um mehrere Chromatin-gebundene Proteine nachzuweisen, und wir haben gezeigt, dass dieses Protokoll in Kombination mit mutierten Drosophila-Beständen verwendet werden kann, um Heterochromatin-Störung zu untersuchen12.
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Protocol
1. Dritte Instar-Larvenkultur
- Bereiten Sie 1 Liter Standardmedien vor, indem Sie 100 g Hefe, 100 g unraffinierten Vollrohrzucker, 16 g Agar, 10 ml Propionsäure und 14 g Gelatine hinzufügen. Alle Zutaten außer der Hefe in 800 ml Leitungswasser auflösen und dann die Hefe auflösen. Autoklaven Sofort für 30 Minuten.
- Danach das Medium auf 60 °C abkühlen lassen und Propionsäure zu einer Endkonzentration von 0,01% hinzufügen. Lassen Sie die Flasche stehen, bis sich die Gelatine gebildet hat.
- Um die 3o-Instar-Larvenkultur zu optimieren, sammeln Sie zunächst 5 bis 10 Tage alte Erwachsene und legen Sie 50 (25 Männchen und 25 Weibchen) in eine breite Halsflasche mit Standardmedien.
- Stellen Sie die Flasche mit den Fliegen in einen kontrollierten Temperaturinkubator bei 25 ° C, bis die Anzahl der gelegten Eier 50 beträgt (ca. 12 Stunden für den Wildtypstamm).
- Nachdem die Inkubationszeit vorbei ist, entfernen Sie die Erwachsenen und übertragen Sie sie in eine neue Flasche, um den Vorgang zu wiederholen. Lassen Sie die Embryonen 72 Stunden lang bei 18 °C wachsen
HINWEIS: Weitere Informationen zu den Lagerhaltungsbedingungen für Drosophila finden Sie unter Tennessen & Thymmel13.
2. Larvensammlung
- Für die Larvensammlung wählen Sie die wandernden Larven, die keine everted Spiracles haben. Nach der Eversion der Spiralen tritt die Larve in das Vorbereitungsstadium ein, während sie ausgezeichnete Polytenchromosomen behält, die für die Analyse geeignet sind. Erst nach 12 Stunden beginnen sich die Zellen der Speicheldrüse auf den programmierten Zelltod vorzubereiten14,15.
- Nehmen Sie fünfzehn 3° Instar-Larven und legen Sie sie in ein Wachglas, um sie zu waschen. Anschließend in eine eiskalte Kochsalzlösung oder PBS überführen (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4,pH auf 7,4 einstellen).
- Sezieren Sie 15 bis 30 Speicheldrüsenpaare (oder so viele wie möglich in 30 Minuten) in kaltem PBS mit Proteasehemmern unter dem stereoskopischen Mikroskop. Die Speicheldrüsen in ein 1,5 ml Röhrchen mit eiskaltem PBS überführen.
- Einmal mit 1 ml PBS plus Proteasehemmer waschen. Warten Sie, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat.
- Nach dem Waschen das PBS mit einer 1000 μL Pipette entfernen. Achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu berühren.
- Alternativ sezieren Sie die Speicheldrüsen in 5 ml PBS, um diesen Waschschritt zu eliminieren, und fahren Sie mit Schritt 3 fort, indem Sie die Speicheldrüsen auf 0,5 ml des unten beschriebenen Ruvkun-Fixierpuffers übertragen.
3. Fixierung von Speicheldrüsengewebe
- Nachdem Sie das PBS aus dem letzten Schritt entfernt haben, fügen Sie direkt 0,5 ml 1x Ruvkun-Fixierpuffer mit 50% Methanol (0,5 ml Methanol hinzufügen) und 2% Formaldehyd hinzu.
HINWEIS: 2x Ruvkun Lösung ist 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES bei pH 7,4. - 2 Stunden bei 4 °C bei leichter Rotation inkubieren.
4. Speicheldrüsengewebe waschen
- Führen Sie eine 5-minütige Rotationswäsche mit 1 ml Tris/Triton-Puffer durch (100 mM Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 und 1 mM EDTA).
HINWEIS: Warten Sie, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat.
5. Permeabilisierung
- Inkubieren Sie die Speicheldrüsen in 1 ml Tris / Triton X-100 (das gleiche wie oben). Für einige Proteine kann es notwendig sein, 1% β-Mercaptoethanol hinzuzufügen.
- 2 Stunden bei 37°C bei leichtem Schütteln (300 U/min) inkubieren.
6. Konservierungsschritt (optional)
HINWEIS: Wenn Sie nicht sofort mit der Inkubation mit dem Antikörper fortfahren, bewahren Sie das Gewebe wie folgt auf.
- Mit 1 mLBO3 Puffer (0,01 M H3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) waschen und dann in BO3 /10mM DTT bei 37°C unter leichtem Schütteln (300 U/min) für 15 Minuten inkubieren.
- Am Ende der Inkubationszeit eine Wäsche mit 1 mlBO3-Puffer allein durchführen.
HINWEIS: Warten Sie, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat. - Fügen Sie 1 ml PBS hinzu. Bewahren Sie das Gewebe in dieser Lösung bei 4 °C für bis zu 72 Stunden auf und fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt fort. Dieser Schritt ist besonders hilfreich bei der Arbeit mit verschiedenen mutierten Stämmen, die einen verzögerten Lebenszyklus aufweisen können, so dass die Immundetektion gleichzeitig mit den Kontrollen durchgeführt werden kann.
7. Gewebeblockierung
- Inkubieren Sie die Speicheldrüsen in 1 ml Puffer B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit Rotation.
8. Immunfärbung
- Entfernen Sie alle Puffer B und fügen Sie Puffer A (PBS + 0,1% BSA) plus Antikörper von Interesse hinzu.
HINWEIS: Wir verwenden den HP1a C1A9c (konzentrierter Antikörper) von Hybridoma Bank bis zu 1:3000. Bei der Verwendung des C1A9s (Überstand) haben wir versucht, von 1:100 bis zu einer 1:500 Verdünnung zu gehen und jede Verdünnung zwischen diesem Rang funktioniert gut) über Nacht bei 4 oC mit Rotation. An dieser Stelle ist es wichtig, dass das Schütteln keine Blasen aufwirft, die den Antikörper schädigen könnten.
9. Immunhaltiges Waschen
- Führen Sie 3 x 15-minütige Wäschen mit Puffer B unter Rühren bei Raumtemperatur mit jeweils 1 ml durch.
- Übertragen Sie die Drüsen zusammen mit dem sekundären Antikörper, der an ein Fluorophor gekoppelt ist, für 2 Stunden unter Rotation bei 4 oC in Puffer B (sekundärer Antikörper Alexa Fluor 568 Invitrogen wurde 1:3000 verwendet).
- Bedecken Sie das Röhrchen mit Aluminiumpapierfolie, um den sekundären Antikörper vor dem Licht zu schützen.
- Führen Sie 2 x 15-minütige Waschungen bei Raumtemperatur während der Rotation mit 1 ml Puffer B durch.
- Mit einem DNA-Marker wie Sytox (2 μL von 5 mM Stamm nehmen und in 1 ml Puffer B auflösen) oder Hoechst (1 μL 10 mg/ml Stamm nehmen und in 1 ml Puffer B auflösen) für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Rotation inkubieren.
- Führen Sie eine Wäsche mit Buffer B und einmal mit PBS durch, wobei jede Wäsche 10 Minuten dauert, während Sie bei Raumtemperatur rotieren.
HINWEIS: Denken Sie daran, es vor dem Licht zu schützen.
10. Bildgebung
- Montieren Sie die Speicheldrüsen auf einer Rutsche und machen Sie einen Pool mit einem Coverlip.
- Legen Sie die Speicheldrüsen in die Mitte des Pools und bedecken Sie sie mit AF1 Citifluor, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, die die viskose Flüssigkeit überall ausdehnen. Dann versiegeln Sie alle Seiten mit klarem Nagellack.
- Unter einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop beobachten. Wenn die Probe nicht am selben Tag beobachtet wird, lagern Sie sie lichthalb bei 4 °C.
- Verwenden Sie GraphPad Prism 6, um alle Diagramme und statistischen Analysen zu generieren.
- Analysieren Sie die Daten der HP1a-Verteilung in Speicheldrüsen mit dem Kruskal-Wallis-Test. Die statistische Signifikanz wurde auf (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****) festgelegt.
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Representative Results
Repräsentative Ergebnisse der HP1a-Immunfärbung in Drosophila-Speicheldrüsen sind in Abbildung 1 dargestellt. Ein positives Ergebnis ist die Beobachtung eines Brennpunktes (Abbildung 1a) (heterochromatisches Aggregat oder Kondensat). Ein negatives Ergebnis ist kein Signal oder ein dispergiertes Signal. Manchmal kann ein Doppelsignal beobachtet werden, dh mit einem Doppelpunkt (Abbildung 1c), aber es tritt normalerweise in kleineren Mengen auf.
Die Datenanalyse kann als Balkendiagramm dargestellt werden, wobei die Verteilung von HP1a innerhalb verschiedener Mutantenhintergründe verglichen wird. Zum Beispiel können wir in Abbildung 2 sehen, dass 98% der Wildtypkerne eine Verteilung von einem Brennpunkt aufweisen und 2% der Kerne zwei Herde aufweisen, während sich in der Mutante der Anteil ändert und das Vorhandensein von zwei Herden auf 40% zunimmt.
Abbildung 3 zeigt repräsentative H3k9me3-Immunfärbungsergebnisse in Drosophila-Speicheldrüsen. Wir können einen Brennpunkt(Abbildung 3b)beobachten, der dem HP1a-Immunfärbung ähnelt (heterochromatisches Aggregat oder Kondensat). Ein Doppel- oder Dreifachsignal (Abbildung 3c) ist bei den Wildtypstämmen in seltenen Fällen zu sehen.
Abbildung 1. Repräsentative konfokale Mikroskopieaufnahme von Speicheldrüsenimmunfärbung mit HP1a-Antikörper vom Wildtyp (wt). a) DNA (Cyan-Signal), HP1a (Magenta-Signal) und Merge-Skala Bar 100 μm. Bei der Immunfärbung für HP1a wird ein Kern mit einem Brennpunkt mit einem weißen Pfeil und ein Kern mit zwei Herden mit einem gepunkteten Linienkasten markiert. Die rechte Spalte zeigt ein vergrößertes Bild eines einzelnen Kerns mit einem Skalenbalken von 5 μm. b) Fokalverteilung. c) Zwei-Foci-Verteilung. Beide Kerne sind mit einer weißen gestrichelten Linie markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Beispiele ergeben sich aus der Zählung der Kernherde verteilung vonhp1a immunstaining. Der erste Balken stellt die Zählung der Wildtypkerne (wt) dar, wie in Abbildung 1. Der zweite Balken stellt einen mutierten Stamm dar, der diese Verteilung beeinflusst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Repräsentative konfokale Mikroskopieaufnahme aus Speicheldrüsenimmunfärbung mit H3K9me3-Antikörper vom Wildtyp (wt). a) DNA (Cyan-Signal), H3K9me3 (Magenta-Signal) und Merge-Skala bar 100 μm. Bei der Immunfärbung für H3K9me3 zeigt die rechte Spalte ein vergrößertes Bild eines einzelnen Kerns mit einem Skalenbalken von 5 μm. b) einen Kern mit einer fokalen Verteilung. c) Verteilung mit drei Schwerpunkten. Beide Kerne sind mit einer weißen gestrichelten Linie markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die zelluläre Funktion eukaryotischer Organismen kann die 3D-Struktur innerhalb des Kerns definieren, die durch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen mit Chromatin und verschiedenen Molekülen einschließlich RNA unterstützt wird. In den letzten drei Jahren haben die biologischen Kondensate, die relevant waren, einschließlich Heterochromatin, eine grundlegende Rolle bei der Bestimmung der Phasentrennung gespielt, die die ausgeprägte nukleare räumliche Organisation von aktivem und repressivem Chromatin fördert 16,17,18.
Heterochromatin ist essentiell, um Zellfunktionen und Identität zu erhalten. Bisher dachte man, dass diese dichten Gebiete nicht transkribiert wurden. Jetzt, da wir über leistungsfähigere Technologien verfügen, können wir jedoch sehen, dass das Heterochromatin nicht nur transkribiert wird, sondern auch ein grundlegender Prozess zur Aufrechterhaltung des Gerüsts des Kerns ist und empfindlich auf Entwicklungs- oder pathologische Prozessereagiert 12,19. Außerdem benötigen bestimmte Gene, die in perizentrisches Heterochromatin eingebettet sind, eine heterochromatische Umgebung, um richtig zu funktionieren. HP1a-Mutationen reduzieren die Expression der Licht- und Rollegene, die als erste entdeckt wurden19. Diese Gene sind überlebenswichtig für den Organismus und finden sich in Heterochromatinblöcken. Infolgedessen hat diese eigenartige Genomkomponente trotz ihrer Fähigkeit, Stummschaltung zu induzieren, das Potenzial, sehr dynamisch zu sein20. In einem komplexen Gleichgewicht zwischen chromatingebundenen und diffusen Typen, das durch verschiedene biologische Kontexte gesteuert werden kann, existieren auch Heterochromatin-assoziierte Proteine wie HP1a. Es wurde auch kürzlich vorgeschlagen, dass Phasentrennungseigenschaften durch die Anordnung von Heterochromatinkondensaten21,22gezeigt werden.
Es gibt eine Reihe von Arbeiten, in denen die Autoren eine Ganzkörperimmunfärbungvon Drosophila-Speicheldrüsenkernen unter Verwendung verschiedener und manchmal einfacherer Protokolle durchgeführt haben23, 24. In diesem Fall adaptierten wir ein Protokoll, das zuerst in C. elegans25beschrieben und anschließend in Drosophila Speicheldrüsen von mehreren Gruppen26,27,28,29 verwendet wurde, und kombinierten es mit der Verwendung von konfokaler Mikroskopie und mutierten Organismen. Dieses Protokoll ermöglicht auch die Visualisierung verschiedener Arten von Proteinen, einschließlich Transkriptionsfaktoren wie XPD, XPB und TBP27,aber auch heterochromatingebundener Proteine wie HP1a und Histonmarkierungen wie H3K9me3, was es als Protokoll für den breiten Einsatz in diesem Gewebe positioniert. Es hat auch den Vorteil, dass das Gewebe in einem Zwischenschritt gespeichert werden kann, ohne die Polytenchromosomenbanding zu beeinträchtigen.
Dieses Protokoll ist zuverlässig und kostengünstig aufgrund der Verwendung eines spezifischen Antikörpers zur Anzeige des HP1a-Proteins. Der entscheidende Schritt in diesem Protokoll besteht darin, den Verlust der Drüsen während der Waschungen zu vermeiden und darauf zu warten, dass das Gewebe den Boden erreicht. Der Vorteil der Verwendung von Speicheldrüsen besteht darin, dass eine 3D-Ansicht des Kerns und seiner Konformation leicht erhalten werden kann, im Gegensatz zur Polytenchromosomtechnik, die eine mechanische Störung der Zelle erfordert und das Chromatin schädigen kann. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist bei den Waschschritten besondere Vorsicht geboten. Wenn es nicht sorgfältig durchgeführt wird, bricht das Gewebe und es wäre nicht möglich, qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten.
Um die Bedeutung der fehlenden Bindung von RNA an die beobachteten Regionen oder Proteine zu bewerten, ist es notwendig, eine Wäsche mit Buffer C (Buffer B ohne EDTA) hinzuzufügen und 100 μM RNase hinzuzufügen. Diese Wäsche sollte wie zuvor beschrieben für 1 h bei 37 °C durchgeführt werden. Das Waschen sollte vor dem Schritt erfolgen, bei dem Moleküle hinzugefügt werden, um die DNA zu beobachten (zwischen den Schritten 9.3 und 9.4).
Die konfokale Mikroskopie mag nicht wie eine sehr neue Methodik erscheinen, um Fragen der Heterochromatinkondensate25,30zu beantworten, aber es war äußerst nützlich, die Delokalisierung des HP1a-Proteins in Drosophila-Kernen zu identifizieren, was auf schwerwiegende Probleme in der Chromatinstruktur hindeutet, die mit anderen Techniken gründlicher bewertet werden können. Trotz seiner Einschränkung kann es in Kombination mit hochauflösender Mikroskopie als erster Ansatz zur Anwendung neuartiger Techniken zur Klärung der biologischen Aktivität verwendet werden, die die Aufbau, Kontrolle und Funktionen von Heterochromatinkondensat moduliert31. Einige dieser neuen Methoden, die sich auf die molekularen und biophysikalischen Wechselwirkungen zwischen Heterochromatin, RNA und Heterochromatin-assoziierten Proteinen konzentrieren, stammen aus dieser Reihe von Methoden, um Heterochromatinkondensate zu testen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Wir danken Marco Antonio Rosales Vega und Abel Segura für die Aufnahme einiger der konfokalen Bilder, Carmen Muñoz für die Medienvorbereitung und Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui und Dr. Chris Wood von der LMNA für Ratschläge zur Verwendung der Mikroskope.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
| 16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
| BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
| Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
| Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22x22, brand not critical |
| DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
| EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
| EGTA | brand not critical | ||
| Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
| H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
| H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
| HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
| KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
| Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
| NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
| NaOH | brand not critical | ||
| PIPES | brand not critical | ||
| Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
| Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
| Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |
References
- Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).
- Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
- Kasinathan, B., et al. Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila. Elife. , 1-31 (2020).
- Lifschytz, E., Hareven, D. Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).
- Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
- Lee, Y. C. G., et al. Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin. PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).
- Koryakov, D. E., et al. The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).
- Cao, R., et al. Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing. Science. 298 (5595), 1039 (2002).
- Hines, K. A., et al. Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading. Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).
- Elgin, S. C. R., Reuter, G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).
- Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
- Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription. BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).
- Tennessen, J. M., Thummel, C. S. Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila. Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).
- Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling. Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M.
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
- Larson, A. G., Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).
- Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α. Methods in Enzymology. , (2018).
- Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).
- Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster. Trends in Genetics. , (2019).
- Strom, A. R., et al.
- Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
- Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes. Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).
- Kolesnikova, T. D., et al. Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene. Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).
- Messina, G., et al. Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization. Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).
- Aguilar-Fuentes, J., et al. p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model. PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).
- Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes. Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).
- Farkaš, R., Mechler, B. M. The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response. Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).
- Zhang, P., Spradling, A. C. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).
- Stormo, B. M., Fox, D. T. Polyteny: still a giant player in chromosome research. Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).
