Summary
Questo protocollo mira a visualizzare gli aggregati di eterocromatina nelle cellule di politene di Drosophila.
Abstract
La visualizzazione degli aggregati di eterocromatina mediante immunosocienza può essere impegnativa. Molti componenti mammiferi della cromatina sono conservati in Drosophila melanogaster. Pertanto, è un modello eccellente per studiare la formazione e la manutenzione dell'eterocromatina. Le cellule politenizzate, come quelle che si trovano nelle ghiandole salivari di larve di terzo instar D. melanogaster, forniscono uno strumento eccellente per osservare la cromatina amplificata quasi mille volte e hanno permesso ai ricercatori di studiare i cambiamenti nella distribuzione dell'eterocromatina nel nucleo. Sebbene l'osservazione dei componenti dell'eterocromatina possa essere effettuata direttamente nei preparati cromosomici di politene, la localizzazione di alcune proteine può essere alterata dalla gravità del trattamento. Pertanto, la visualizzazione diretta dell'eterocromatina nelle cellule completa questo tipo di studio. In questo protocollo, descriviamo le tecniche di immunostaining utilizzate per questo tessuto, l'uso di anticorpi fluorescenti secondari e la microscopia confocale per osservare questi aggregati di eterocromatina con maggiore precisione e dettaglio.
Introduction
Fin dai primi studi di Emil Heitz1,l'eterocromatina è stata considerata un importante regolatore dei processi cellulari come l'espressione genica, la separazione meiotica e mitotica dei cromosomi e il mantenimento della stabilità delgenoma 2,3,4.
L'eterocromatina è principalmente divisa in due tipi: l'eterocromatina costitutiva che definisce tipicamente sequenze ripetitive e gli elementi trasponibili presenti in specifici siti cromosomici come i telomeri e i centromeri. Questo tipo di eterocromatina è definito principalmente epigeneticamente da specifici segni istonosi come la di o trimetilazione della lisina 9 dell'istone H3 (H3K9me3) e il legame della proteina eterocromatina 1a (HP1a)5,6. D'altra parte, l'eterocromatina facultativa si localizza attraverso le braccia del cromosoma e consiste principalmente di geni silenziati per losviluppo 7,8. L'immunosottenizione di blocchi di eterocromatina nelle cellule metafase, o l'osservazione di aggregati di eterocromatina nelle cellule interfase, ha svelato molta luce nella comprensione della formazione e della funzione delle regioni eterocromomatiche9.
L'uso della Drosophila come sistema modello ha permesso lo sviluppo di strumenti essenziali per studiare l'eterocromatina senza l'uso della microscopia elettronica10. Dalla descrizione della variegatione dell'effetto posizione e dalla scoperta di proteine associate all'eterocromatina, come HP1a, e modifiche post-trasdutazionali istone, molti gruppi hanno sviluppato diverse tecniche immunoistochimiche che consentono la visualizzazione di queste regioni eterocromomatiche10,11.
Queste tecniche si basano sull'uso di anticorpi specifici che riconoscono proteine associate all'eterocromatina o segni istonali. Per ogni tipo di cellula e anticorpo, le condizioni di fissazione e permeabilizzazione devono essere determinate empiricamente. Inoltre, le condizioni possono variare se vengono utilizzati ulteriori processi meccanici come le tecniche di squashing. In questo protocollo, descriviamo l'uso delle ghiandole salivari della Drosophila per studiare i focolai eterocromatici. Le ghiandole salivari hanno cellule politenizzate che contengono più di 1.000 copie del genoma, fornendo così una visione amplificata della maggior parte delle caratteristiche della cromatina, ad eccezione del DNA satellitare e di alcune regioni eterocromatiche che sono sotto replicate. Tuttavia, le regioni dell'eterocromatina sono facilmente visualizzabili nei preparati cromosomici del politene, ma le tecniche di schiacciamento possono talvolta interrompere i complessi caratteristici legati alla cromatina o l'architettura della cromatina. Pertanto, l'immunolocalizzazione delle proteine in tutto il tessuto della ghiandola salivare può superare questi effetti indesiderati. Abbiamo utilizzato questo protocollo per rilevare diverse proteine legate alla cromatina, e abbiamo dimostrato che questo protocollo combinato con le scorte mutanti di Drosophila può essere utilizzato per studiare l'interruzione dell'eterocromatina12.
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Protocol
1. Terza cultura delle larve instar
- Preparare 1 litro di mezzi standard aggiungendo 100 g di lievito, 100 g di zucchero di canna intero non raffinato, 16 g di agar, 10 mL di acido propionico e 14 g di gelatina. Sciogliere tutti gli ingredienti tranne il lievito in 800 mL di acqua del rubinetto e quindi sciogliere il lievito. Autoclave immediatamente per 30 minuti.
- Successivamente, lasciare raffreddare il supporto a 60 °C e aggiungere acido propionico a una concentrazione finale dello 0,01%. Lasciare riposare la bottiglia fino a formare la gelatina.
- Per ottimizzare la cultura delle larve 3o instar, raccogli prima adulti di età da 5 a 10 giorni e posiziona 50 (25 maschi e 25 femmine) in un'ampia bottiglia di collo di media standard.
- Posizionare la bottiglia con le mosche in un incubatore di temperatura controllata a 25 °C fino a quando il numero di uova deposte è 50 (circa 12 ore per il ceppo di tipo selvatico).
- Al termine del tempo di incubazione, rimuovere gli adulti e trasferirli in una nuova bottiglia per ripetere la procedura. Lasciare crescere gli embrioni a 18 °C per 72 ore
NOTA: Per ulteriori informazioni sulle condizioni di manutenzione delle scorte di Drosophila, vedere Tennessen & Thymmel13.
2. Raccolta delle larve
- Per la raccolta delle larve scegli le larve errante che non hanno spiracoli estroversi. Dopo l'eversione degli spiracoli, la larva entra nello stadio prepupale, pur mantenendo eccellenti cromosomi di politene adatti all'analisi. Solo dopo 12 ore le cellule della ghiandola salivare iniziano a prepararsi per la morte cellulare programmata14,15.
- Prendi quindici larve instar di 3° e mettile in un bicchiere da orologio per lavarle. Quindi trasferirli in una soluzione salina ghiacciata o PBS (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4,regolare il pH a 7,4).
- Sezionare da 15 a 30 paia di ghiandole salivari (o il maggior numero possibile in 30 minuti) in PBS freddo con inibitori della proteasi al microscopio stereoscopico. Trasferire le ghiandole salivari in un tubo da 1,5 ml con PBS ghiacciato.
- Lavare una volta con 1 mL di PBS più inibitori della proteasi. Attendere che il tessuto raggiunga il fondo del tubo.
- Dopo il lavaggio, rimuovere il PBS con una pipetta da 1000 μL. Fare attenzione a non toccare il tessuto.
- In alternativa, sezionare le ghiandole salivari in 5 mL di PBS per eliminare la necessità di questa fase di lavaggio e procedere al passaggio 3 trasferendo le ghiandole salivari a 0,5 mL del tampone di fissaggio Ruvkun descritto di seguito.
3. Fissazione del tessuto della ghiandola salivare
- Dopo aver rimosso il PBS dall'ultimo passaggio, aggiungere direttamente 0,5 mL di tampone di fissaggio 1x Ruvkun, con 50% di metanolo (aggiungere 0,5 mL di metanolo) e 2% di formaldeide.
NOTA: 2x La soluzione di Ruvkun è di 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES a pH 7.4. - Incubare per 2 ore a 4 °C con una leggera rotazione.
4. Lavaggio del tessuto della ghiandola salivare
- Effettuare un lavaggio a rotazione di 5 minuti con 1 mL di tampone Tris/Triton (100 mM Tris pH 7.4, 1% Triton X-100 e 1 mM EDTA).
NOTA: Attendere che il tessuto raggiunga il fondo del tubo.
5. Permeabilizzazione
- Incubare le ghiandole salivari in 1 mL di Tris/Triton X-100 (lo stesso di cui sopra). Per alcune proteine potrebbe essere necessario aggiungere l'1% β-mercaptoetanolo.
- Incubare per 2 ore a 37 ° C con lievi scosse (300 giri/min).
6. Passaggio di conservazione (facoltativo)
NOTA: Se non si procede immediatamente all'incubazione con l'anticorpo, conservare il tessuto come segue.
- Lavare con 1 mL di TAMPONE BO3 (0,01 M H3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) e quindi incubare in BO3/10 mM DTT a 37 ° C con scuotimento lieve (300 giri/min) per 15 minuti.
- Alla fine del periodo di incubazione, eseguire un lavaggio con 1 mL di tampone BO3 da solo.
NOTA: Attendere che il tessuto raggiunga il fondo del tubo. - Aggiungere 1 mL di PBS. Conservare il tessuto in questa soluzione a 4 °C per un massimo di 72 ore e quindi procedere con il passaggio successivo. Questo passaggio è particolarmente utile quando si lavora con diversi ceppi mutanti che possono presentare un ciclo di vita ritardato, quindi l'immunodetezione può essere eseguita contemporaneamente insieme ai controlli.
7. Blocco dei tessuti
- Incubare le ghiandole salivari in 1 mL di Buffer B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Tritone X-100 + 1 mM EDTA) per 2 ore a temperatura ambiente con rotazione.
8. Immunostaining
- Rimuovere tutto il buffer B e aggiungere tampone A (PBS + 0,1% BSA) più anticorpo di interesse.
NOTA: Utilizziamo l'HP1a C1A9c (anticorpo concentrato) di Hybridoma Bank fino a 1:3000. Quando si utilizzano i C1A9 (supernatanti) abbiamo provato da 1:100 a una diluizione 1:500 e qualsiasi diluizione tra questo rango funziona bene) durante la notte a 4 oC con rotazione. A questo punto è importante che lo scuotimento non sollevi bolle che potrebbero danneggiare l'anticorpo.
9. Lavaggio immunostaining
- Eseguire lavaggi di 3 x 15 minuti con tampone B sotto agitazione a temperatura ambiente utilizzando 1 mL ogni volta.
- Trasferire le ghiandole nel tampone B insieme all'anticorpo secondario accoppiato a un fluorofore per 2 ore in rotazione a 4 oC (l'anticorpo secondario Alexa fluor 568 Invitrogen è stato utilizzato 1:3000).
- Coprire il tubo con un foglio di carta in alluminio per proteggere l'anticorpo secondario dalla luce.
- Effettuare lavaggi di 2 x 15 minuti a temperatura ambiente durante la rotazione con 1 mL di Tampone B.
- Incubare con un marcatore di DNA come Sytox (assumere 2 μL di 5 mM di stock e sciogliere in 1 mL di Tampone B) o Hoechst (assumere 1 μL di 10 mg/mL di stock e sciogliere in 1 mL di Buffer B) per 10 minuti a temperatura ambiente con rotazione.
- Effettuare un lavaggio con buffer B e una volta con PBS, ogni lavaggio della durata di 10 minuti mentre ruota a temperatura ambiente.
NOTA: Ricordati di proteggerlo dalla luce.
10. Imaging
- Montare le ghiandole salivari su uno scivolo, facendo una piscina con un coverslip.
- Mettere le ghiandole salivari al centro della piscina e coprire con AF1 citifluor per evitare la formazione di bolle che estendono il liquido viscoso in tutto il luogo. Quindi sigillare tutti i lati con smalto chiaro.
- Osservare sotto una fluorescenza o un microscopio confocale. Se il campione non deve essere osservato lo stesso giorno, conservare lontano dalla luce a 4 °C.
- Usa GraphPad Prism 6 per generare tutti i grafici e le analisi statistiche.
- Analizzare i dati della distribuzione HP1a nelle ghiandole salivari utilizzando il test Kruskal-Wallis. La significatività statistica è stata fissata a (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****).
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Representative Results
I risultati rappresentativi dell'immunoso immunosocienza HP1a nelle ghiandole salivari della Drosophila sono riportati nella figura 1. Un risultato positivo è quello di osservare un punto focale (figura 1a) (aggregato eterocromatico o condensa). Un risultato negativo è nessun segnale o segnale disperso. A volte si può osservare un doppio segnale, cioè con un doppio punto (Figura 1c), ma di solito si verifica in quantità minori.
L'analisi dei dati può essere rappresentata come grafici a barre, confrontando la distribuzione di HP1a all'interno di diversi sfondi mutanti. Ad esempio, nella figura 2 possiamo vedere che il 98% dei nuclei di tipo selvatico presenta una distribuzione di un punto focale e il 2% dei nuclei presenta due fuochi, mentre nel mutante la proporzione cambia e la presenza di due fuochi aumenta al 40%.
La figura 3 mostra risultati rappresentativi dell'immunosottenzione di H3k9me3 nelle ghiandole salivari della Drosophila. Possiamo osservare un punto focale (Figura 3b) che assomiglia all'immunostaining HP1a, (aggregato eterocromatico o condensa). Un segnale doppio o triplo (Figura 3c) può essere visto in rare occasioni nei ceppi di tipo selvaggio.
Figura 1. Immagine rappresentativa della microscopia confocale dall'immunosomica della ghiandola salivare con anticorpo HP1a di tipo selvatico (wt). a) DNA (segnale ciano), HP1a (segnale magenta) e barra di scala di unione 100 μm. Nell'immunostaining per HP1a, un nucleo con un punto focale è contrassegnato da una freccia bianca e un nucleo con due fuochi con una scatola di linea punteggiata. La colonna di destra mostra un'immagine ingrandita di un singolo nucleo con una barra di scala di 5 μm. b) distribuzione focale. e)distribuzione di due fuochi. Entrambi i nuclei sono contrassegnati da una linea tratteggiata bianca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Esempi derivano dal conteggio della distribuzione dei focolai di nuclei di immunosottenzionehp1a. La prima barra rappresenta il conteggio dei nuclei di tipo jolly (wt), come nella figura 1. La seconda barra rappresenta un ceppo mutante che influisce su questa distribuzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Immagine rappresentativa di microscopia confocale dall'immunoso immunosocienza della ghiandola salivare con anticorpo H3K9me3 di tipo selvatico (wt). a) DNA (segnale ciano), H3K9me3 (segnale magenta) e barra di scala di unione 100 μm. In immunostaining per H3K9me3.La colonna destra mostra un'immagine ingrandita di un singolo nucleo con una barra di scala di 5 μm. b) un nucleo con una distribuzione focale. e)tre distribuzione dei fuochi. Entrambi i nuclei sono contrassegnati da una linea tratteggiata bianca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La funzione cellulare degli organismi eucarioti può definire la struttura 3D all'interno del nucleo, che è supportata da interazioni tra diverse proteine con cromatina e varie molecole tra cui l'RNA. Negli ultimi tre anni, i condensati biologici che hanno avuto rilevanza, compresa l'eterocromatina, hanno assunto un ruolo fondamentale nella determinazione della separazione di fase promuovendo la distinta organizzazione spaziale nucleare della cromatina attiva e repressiva 16,17,18.
L'eterocromatina è essenziale per preservare le funzioni cellulari e l'identità. In precedenza si pensava che queste aree dense non fossero trascritte. Tuttavia, ora che abbiamo tecnologie più potenti, possiamo vedere che l'eterocromatina non è solo trascritta, ma anche un processo fondamentale per mantenere l'impalcatura del nucleo ed è sensibile ai processi di sviluppo o patologici12,19. Inoltre, alcuni geni incorporati nell'eterocromatina pericentrica hanno bisogno di un ambiente eterocromatico per funzionare correttamente. Le mutazioni hp1a riducono l'espressione dei geni leggeri e arrotolati, che sono stati i primi ad esserescoperti 19. Questi geni sono essenziali per la sopravvivenza dell'organismo e si trovano in blocchi di eterocromatina. Di conseguenza, nonostante la sua capacità di indurre il silenziamento, questa peculiare componente del genoma ha il potenziale per essere molto dinamica20. In un complesso equilibrio tra tipi legati alla cromatina e diffusi che possono essere controllati da vari contesti biologici, esistono anche proteine associate all'eterocromatina come l'HP1a. Recentemente è stato anche suggerito che le proprietà di separazione di fase sono mostrate dall'assemblaggio di condensati di eterocromatina21,22.
Ci sono una serie di documenti in cui gli autori hanno effettuato l'immunostaining a montaggio intero dei nuclei di ghiandola salivare drosophila utilizzando protocolli diversi e talvoltapiù semplici 23,24. In questo caso abbiamo adattato un protocollo descritto per la prima volta in C. elegans25,e successivamente utilizzato nelle ghiandole salivari della Drosophila dadiversi gruppi 26,27,28,29 e combinato con l'uso di microscopia confocale e organismi mutanti. Questo protocollo consente anche la visualizzazione di diversi tipi di proteine, inclusi fattori di trascrizione come XPD, XPB e TBP27, ma anche proteine legate all'eterocromatina come HP1a e segni istoni come H3K9me3, che lo posiziona come protocollo per un ampio utilizzo in questo tessuto. Ha anche il vantaggio che il tessuto può essere conservato in una fase intermedia senza influire sulla fasciatura cromosoma del politene.
Questo protocollo è affidabile ed economico grazie all'uso di un anticorpo specifico per visualizzare la proteina HP1a. Il passaggio critico di questo protocollo è evitare di perdere le ghiandole durante i lavaggi e attendere che il tessuto si suscriva. Il vantaggio dell'uso delle ghiandole salivari è che una visione 3D del nucleo e la sua conformazione possono essere ottenute facilmente, in contrasto con la tecnica del cromosoma politene che richiede un'interruzione meccanica della cellula e può danneggiare la cromatina. Durante l'esecuzione di questo protocollo, è necessario prestare particolare attenzione durante le fasi di lavaggio. Se non eseguita con cura, il tessuto si romperà e non sarebbe possibile ottenere immagini di alta qualità.
Per valutare l'importanza della mancanza di legame dell'RNA alle regioni o alle proteine che si osservano, è necessario aggiungere un lavaggio con tampone C (tampone B senza EDTA) e aggiungere 100 μM di RNasi. Questo lavaggio deve essere effettuato per 1 h a 37 °C come descritto in precedenza. Il lavaggio deve essere effettuato prima del passaggio in cui vengono aggiunte molecole per osservare il DNA (tra i passaggi 9.3 e 9.4).
La microscopia confocale potrebbe non sembrare una metodologia molto nuova per affrontare le questioni dei condensati di eterocromatina25,30, ma è stato estremamente utile identificare la delocalizzazione della proteina HP1a nei nuclei di Drosophila, il che suggerisce gravi problemi nella struttura della cromatina che possono essere valutati con altre tecniche in modo più approfondito. Nonostante la sua limitazione, può essere utilizzato in combinazione con la microscopia ad alta risoluzione come primo approccio per applicare nuove tecniche per chiarire l'attività biologica che modula l'assemblaggio, il controllo e le funzioni della condensa eterocromatina31. Alcune di queste nuove metodologie che si concentrano sulle interazioni molecolari e biofisiche tra eterocromatina, RNA e proteine associate all'eterocromatina sono raccolte da questo insieme di metodi per testare i condensati di eterocromatina.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo Marco Antonio Rosales Vega e Abel Segura per aver scattato alcune delle immagini confocali, Carmen Muñoz per la preparazione dei media e il Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui e il Dr. Chris Wood della LMNA per consigli sull'uso dei microscopi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
| 16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
| BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
| Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
| Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22x22, brand not critical |
| DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
| EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
| EGTA | brand not critical | ||
| Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
| H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
| H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
| HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
| KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
| Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
| NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
| NaOH | brand not critical | ||
| PIPES | brand not critical | ||
| Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
| Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
| Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |
References
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