Summary
このプロトコルは、ショ ウジョウバエ ポリテン細胞のヘテロクロマチン集合体を可視化することを目的としている。
Abstract
免疫染色によるヘテロクロマチン凝集体の可視化は困難な場合があります。クロマチンの多くの哺乳類成分は、ショ ウジョウバエのメラノガスター で保存されている。したがって、ヘテロクロマチンの形成とメンテナンスを研究するための優れたモデルです。 第3インスター D.メラノガスター 幼虫の唾液腺に見られるような多テン化された細胞は、クロマチンが1000回近く増幅するのを観察するための優れたツールを提供し、研究者は核中のヘテロクロマチンの分布の変化を研究することを可能にしました。ヘテロクロマチン成分の観察はポリテーン染色体製剤で直接行うことができるが、一部のタンパク質の局在化は治療の重症度によって変化する可能性がある。したがって、細胞内のヘテロクロマチンの直接可視化は、この種の研究を補完する。本プロトコルでは、この組織に用いられる免疫染色技術、二次蛍光抗体の使用、および共焦点顕微鏡を用いて、これらのヘテロクロマチン凝集体をより精密かつ詳細に観察する方法について述べる。
Introduction
エミール・ハイツ1の初期研究以来、ヘテロクロマチンは、遺伝子発現、染色体のmeioticおよびmitotic分離、およびゲノム安定性2、3、4の維持などの細胞プロセスの重要な調節因子と考えられてきました。
ヘテロクロマチンは、主に、反復配列を特徴的に定義する構成ヘテロクロマチンと、テロメアやセントロメレスなどの特定の染色体部位に存在する変容可能な要素の2つに分けられます。この種のヘテロクロマチンは、ヒストンH3のリシン9のジまたはトリメチル化(H3K9me3)およびヘテロクロマチンタンパク質1a(HP1a)5,6の結合などの特異的ヒストンマークによって主にエピジェネティックに定義される。一方、栄養性ヘテロクロマチンは染色体の腕を通して局所化し、主に発達的に沈黙した遺伝子7、8から構成される。メタフェーズ細胞におけるヘテロクロマチンブロックの免疫染色、または相間細胞におけるヘテロクロマチン凝集体の観察は、ヘテロクロマティック領域9の形成および機能の理解において多くの光を明らかにした。
モデルシステムとしてのショウジョウバエの使用により、電子顕微鏡10を使用せずにヘテロクロマチンを研究するための必須ツールの開発が可能になった。HP1aなどのヘテロクロマチン関連タンパク質の位置効果変化や発見、ヒストン翻訳後修飾の記述以来、多くのグループはこれらの異球領域10,11の可視化を可能にするいくつかの免疫組織化学的手法を開発してきた。
これらの技術は、ヘテロクロマチン関連タンパク質またはヒストンマークを認識する特定の抗体の使用に基づいています。細胞の種類や抗体ごとに、固定および透過性の条件を経験的に決定する必要があります。また、スカッシュ技術などの追加の機械的プロセスを使用する場合にも条件が異なる場合があります。このプロトコルでは、ショ ウジョウバエ 唾液腺を用いて異血球性病巣を研究することを説明する。唾液腺は、ゲノムの1,000部以上を含む多着細胞を有しており、衛星DNAおよび複製中の一部の異血球領域を除いて、クロマチンの特徴の大部分を増幅したビューを提供する。それにもかかわらず、ヘテロクロマチン領域はポリテーン染色体製剤で容易に可視化されるが、スカッシュ技術は、特徴的なクロマチン結合複合体またはクロマチンアーキテクチャを破壊する場合がある。したがって、唾液腺組織全体におけるタンパク質の免疫局在化は、これらの望ましくない効果を上回る可能性がある。我々は、いくつかのクロマチン結合タンパク質を検出するためにこのプロトコルを使用しており、我々は、変異型 ショウジョウバエ 株と組み合わせたこのプロトコルは、ヘテロクロマチン破壊12を研究するために使用することができることを実証した。
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Protocol
1. 第三のインスター幼虫文化
- 1リットルの酵母、100gの未精製の全てのサトウキビ砂糖、16gの寒天、プロピオン酸10mL、ゼラチン14gを加えて、標準培地を1リットル用意します。800mLの水道水に酵母以外の成分をすべて溶解し、酵母を溶解します。30分間すぐにオートクレーブ。
- その後、培地を60°Cまで冷却し、プロピオン酸を最終濃度0.01%に加えます。ゼラチンが形成されるまでボトルを立たせます。
- 3oインスター幼虫培養を最適化するには、まず5〜10日の成人を収集し、標準培地の広い首のボトルに50(男性25人と女性25人)を配置します。
- ハエと一緒にボトルを25°Cの制御温度インキュベーターに入れ、産卵数が50個(野生型株の場合は約12時間)になるまで置きます。
- インキュベーション時間が経過したら、成人を取り除き、新しいボトルに移して手順を繰り返します。胚を18°Cで72時間成長させる
注: ショウジョウバエ 在庫のメンテナンス条件の詳細については、テネシー州とティンメル13を参照してください。
2. 幼虫コレクション
- 幼虫のコレクションのためにスピラクレスを全く持っていない放浪幼虫を選択してください。スピラクルの発分後、幼虫は、分析に適した優れたポリテーン染色体を保持しながら、準備段階に入ります。唾液腺の細胞は14,15のプログラム細胞死に備え始めるのが12時間後に行われます。
- 15 3°インスターの幼虫を取り、それらを洗うために時計ガラスに入れてください。次に、氷冷生理食液またはPBS(1x PBS:137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2mM KH 2 PO 4、2 mM KH2PO4、pHを7.4に調整)に移します。
- 立体顕微鏡下でプロテアーゼ阻害剤を用いた冷たいPBSで15〜30対の唾液腺(または30分でできるだけ多く)を解剖する。唾液腺を氷冷PBSで1.5mLチューブに移します。
- PBSとプロテアーゼ阻害剤の1 mLで1回洗浄します。組織がチューブの底に達するのを待ちます。
- 洗浄後、1000 μL ピペットでPBSを取り出します。ティッシュに触れないように注意してください。
- あるいは、この洗浄工程の必要性を排除するためにPBSの5mLで唾液腺を解剖し、以下に記載のルブクン固定緩衝液の0.5mLに唾液腺を移すことによってステップ3に進む。
3. 唾液腺組織固定
- 最後のステップからPBSを取り除いた後、50%メタノール(メタノールの0.5 mLを追加)と2%ホルムアルデヒドで、1x Ruvkun固定バッファーの0.5 mLを直接追加します。
注:2xルヴクン溶液は、160 mM KCl、40 mM NaCl、20 mM EGTA、30 mMパイプpH 7.4です。 - 4°Cで2時間、軽い回転でインキュベートします。
4. 唾液腺組織洗浄
- トリス/トリトンバッファー(100 mMトリスpH 7.4、1%トリトンX-100および1 mM EDTA)の1 mLで1 5分間の回転洗浄を行います。
メモ:組織がチューブの底に到達するのを待ちます。
5. パーメビルゼーション
- トリス/トリトンX-100の1mLで唾液腺をインキュベートする(上記と同じ)。一部のタンパク質では、1%βメルカプトエタノールを添加する必要があります。
- 軽い振盪(300rpm)で37°Cで2時間インキュベートする。
6. 保存手順(オプション)
注:抗体をインキュベーションに直ちに進まない場合は、以下のように組織を保存してください。
- 1 mLの BO3 バッファー (0.01 M H3BO3 pH 9.2 + 0.01 M NaOH) で洗浄し、37 °Cで BO3/10 mM DTT を 15 分間軽度の振盪 (300 rpm) でインキュベートします。
- インキュベーション期間の終わりに、1 mLのBO3 緩衝液単独で洗浄を行う。
メモ:組織がチューブの底に到達するのを待ちます。 - PBSを1 mL追加します。この溶液中の組織を最大72時間4°Cで保存し、次のステップに進みます。このステップは、遅延ライフサイクルを提示する可能性のある異なる変異株を扱う場合に特に有用であり、免疫検出はコントロールと同時に行うことができる。
7. 組織ブロッキング
- 唾液腺をバッファーB(PBS + 0.1% BSA + 0.5% トリトン X-100 + 1 mM EDTA)の1 mLで室温で2時間培養します。
8. 免疫染色
- すべてのバッファーBを取り外し、目的の抗体を加えて、バッファーA(PBS + 0.1%BSA)を加えます。
注:ハイブリドーマバンクのHP1a C1A9c(濃縮抗体)は、1:3000まで使用します。C1A9s(上清)を使用する場合、我々は1:100から1:500希釈に試みており、このランク間の希釈はうまく機能します) 一晩で4 oCで回転します。この時点で、揺れが抗体に損傷を与える可能性のある気泡を発生しないことが重要です。
9. 免疫染色洗浄
- 毎回1mLを用いて室温で撹拌下でバッファーBで3 x 15分の洗剤を行う。
- 4oCで2時間回転下で2時間、フルオロフォアに結合した二次抗体と共に緩衝Bに腺を移す(2次抗体Alexa fluor 568 Invitrogenは1:3000を使用した)。
- 二次抗体を光から保護するために、チューブをアルミ製のホイルで覆います。
- バッファーBの1 mLで回転しながら室温で2 x 15分の洗剤を行います。
- シトックス(5mMストックの2μLを取り、バッファBの1mLに溶解する)またはHoechst(10mg/mLストックの1μLを取り、バッファBの1mLに溶解する)などのDNAマーカーを室温で10分間インキュベートします。
- バッファーBで1回、PBSで1回洗浄を行い、各洗浄は室温で回転しながら10分間持続します。
注:光から保護することを忘れないでください。
10. イメージング
- 唾液腺をスライドに取り付け、カバースリップ付きのプールを作ります。
- 唾液腺をプールの真ん中に入れ、AF1シティフルオールで覆い、粘性液体を広げる気泡の形成を避けます。その後、透明なマニキュアですべての側面をシールします。
- 蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で観察します。同じ日にサンプルが観測されない場合は、光から離して4°Cで保管してください。
- グラフパッドプリズム6を使用して、すべてのグラフと統計分析を生成します。
- クリュスカル・ウォリス検定を用いて唾液腺のHP1a分布のデータを分析します。統計的有意性は(0.05*、0.01**<0.01**、< 0.001***、<0.0001****
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Representative Results
ショウジョウバエ唾液腺におけるHP1a免疫染色の代表的な結果を図1に示す。肯定的な結果は、1つの焦点(図1a)(不均一な凝集または凝縮物)を観察する。負の結果は信号または分散信号ではありません。二重信号、つまり二重点(図1c)を観測できる場合がありますが、通常は少量で発生します。
データ分析は、異なる変異背景内のHP1a分布を比較して、棒グラフとして表すことができる。例えば、 図2 では、野生型核の98%が1つの焦点の分布を提示し、核の2%が2つの病巣を存在させるのに対し、突然変異体では割合が変化し、2つの病巣の存在が40%に増加することがわかります。
図3は、 ショウジョウバエ 唾液腺における代表的なH3k9me3免疫染色結果を示す。HP1a免疫染色(不均一凝集体または凝縮物)に類似した1つの焦点(図3b)を観察することができる。野生型株では、稀に二重または三重の信号(図3c)が見られる。
図 1.代表的な共焦点顕微鏡画像は、野生型からHP1a抗体を用いた唾液腺免疫染色(wt)からなる。)DNA(シアンシグナル)、HP1a(マゼンタシグナル)、およびマージスケールバー100μm。HP1aの免疫染色では、焦点を持つ核は白い矢印と、点線のボックスを持つ2つの病巣を有する核でマークされる。右の列は、スケールバーが5μmの単一核の拡大画像を示しています。 c)2 つの病巣分布。両方の核は白い破線でマークされています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.HP1a免疫染色の核病巣分布をカウントすることから得られた例。 最初のバーは、 図 1のように、野生型核 (wt) のカウントを表します。2 番目のバーは、この分布に影響を与える変異株を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.代表共焦点顕微鏡画像は、野生型由来のH3K9me3抗体による唾液腺免疫染色(wt)からの免疫染色からなる。)DNA(シアンシグナル)、H3K9me3(マゼンタシグナル)およびマージスケールバー100μm。H3K9me3.の免疫染色では、右のカラムは、スケールバーが5μmの単一核の拡大画像を示しています。 c)3つの病巣分布。両方の核は白い破線でマークされています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
真核生物の細胞機能は、核内の3D構造を定義することができ、これはクロマチンとの異なるタンパク質とRNAを含む様々な分子との相互作用によって支えられる。過去3年間で、ヘテロクロマチンを含む関連性を有する生物学的凝縮物は、活性クロマチン16、17、18の明確な核空間組織を促進する相分離の決定において基本的な役割を果たしてきた。
ヘテロクロマチンは、細胞の機能と同一性を維持するために不可欠です.以前は、これらの密集した領域は転写されていないと考えられていた。しかし、より強力な技術を持った今、ヘテロクロマチンは転写されるだけでなく、核の足場を維持するための基本的なプロセスであり、発達過程または病理学的プロセス12、19に敏感であることがわかります。また、心枢性ヘテロクロマチンに埋め込まれた特定の遺伝子は、正常に機能するためにヘテロクロマティック環境を必要とします。HP1a変異は光と転がった遺伝子の発現を低下させ、最初に発見された19.これらの遺伝子は、生物の生存に不可欠であり、ヘテロクロマチンブロックに見られる。その結果、サイレンシングを誘導する能力にもかかわらず、この特異なゲノム成分は非常に動的である可能性を有する20。様々な生物学的文脈によって制御できるクロマチン結合型と拡散型の複雑なバランスでは、HP1aのようなヘテロクロマチン関連タンパク質も存在する。また、最近では、相分離特性がヘテロクロマチン凝縮物21,22の集合体によって示されるということも示唆された。
著者らは、異なる、時には単純なプロトコル23、24を使用してショウジョウバエ唾液腺核の全実装免疫染色を行った論文が数多くある。この場合、最初にC.elegans25に記載されたプロトコルを適応させ、その後、ショウジョウバエ唾液腺で複数のグループ26、27、28、29によって使用され、共焦点顕微鏡および突然変異体の使用と組み合わせた。このプロトコルはまた、XPD、XPBおよびTBP27などの転写因子を含む異なるタイプのタンパク質の視覚化を可能にするが、HP1aなどのヘテロクロマチン結合タンパク質およびH3K9me3のようなヒストンマークも、この組織で広く使用するためのプロトコルとして位置付ける。また、ポリテーン染色体バンディングに影響を与えることなく、中間工程で組織を保存できるという利点があります。
このプロトコルはHP1aタンパク質を見るために特定の抗体を使用することによる信頼でき、費用効果が大きい。このプロトコルの重要なステップは、くすの間に腺を失い、組織が底を打つのを待つことです。唾液腺を用いるという利点は、細胞の機械的破壊を必要とし、クロマチンに損傷を与える可能性のあるポリテン染色体技術とは対照的に、核とその立体構造の3Dビューが容易に得られる点である。このプロトコルを実行する際には、洗浄手順中に特別な注意を払う必要があります。慎重に行われなければ、組織が壊れ、高品質の画像を得ることは不可能であろう。
観察されている領域またはタンパク質へのRNAの結合の欠如の重要性を評価するためには、バッファC(EDTAなしのバッファB)で洗浄を加え、100μMのRNaseを添加する必要があります。この洗浄は、前述のように37°Cで1時間行う必要があります。洗浄は、DNAを観察するために分子を添加するステップの前に行う必要があります(ステップ9.3と9.4の間)。
共焦点顕微鏡は、ヘテロクロマチン凝縮体25,30の問題に対処する新しい方法論とは思えないかもしれませんが、ショウジョウバエ核におけるHP1aタンパク質の脱局化を同定することは非常に有用であり、他の技術でより徹底的に評価できるクロマチン構造の重大な問題を示唆しています。その制限にもかかわらず、ヘテロクロマチン凝縮体アセンブリ、制御、および機能31を調節する生物学的活性を明らかにする新規手法を適用する第一の手法として、高解像度顕微鏡と組み合わせて使用することができる。ヘテロクロマチン、RNA、ヘテロクロマチン関連タンパク質の分子および生物物理学的相互作用に焦点を当てたこれらの新しい方法論のいくつかは、ヘテロクロマチン凝縮物を試験するこの一連の方法から収集されます。
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Disclosures
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
Acknowledgments
マルコ・アントニオ・ロサレス・ベガとアベル・セグラは、メディアの準備のためにカルメン・ムニョス、メディアの準備のためにカルメン・ムニョス博士、M.Cアンドレス・サラレギ、LMNAのクリス・ウッド博士に顕微鏡の使用に関するアドバイスをしてくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
| 16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
| BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
| Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
| Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22x22, brand not critical |
| DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
| EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
| EGTA | brand not critical | ||
| Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
| H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
| H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
| HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
| KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
| Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
| NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
| NaOH | brand not critical | ||
| PIPES | brand not critical | ||
| Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
| Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
| Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |
References
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