Summary
Dit protocol is bedoeld om heterochromatine aggregaten in Drosophila polytene cellen te visualiseren.
Abstract
Visualisatie van heterochromatineaggregaten door immunostaining kan een uitdaging zijn. Veel zoogdiercomponenten van chromatine worden bewaard in Drosophila melanogaster. Daarom is het een uitstekend model om de vorming en het onderhoud van heterochromatine tebestuderen. Gepolyteniseerde cellen, zoals die gevonden in speekselklieren van derde instar D. melanogaster larven, bieden een uitstekend hulpmiddel om de chromatine versterkt bijna duizend keer te observeren en hebben onderzoekers in staat gesteld om veranderingen in de verdeling van heterochromatine in de kern te bestuderen. Hoewel de observatie van heterochromatinecomponenten direct in polytene-chromosoompreparaten kan worden uitgevoerd, kan de lokalisatie van sommige eiwitten worden gewijzigd door de ernst van de behandeling. Daarom is de directe visualisatie van heterochromatine in cellen een aanvulling op dit type studie. In dit protocol beschrijven we de immunostainingtechnieken die voor dit weefsel worden gebruikt, het gebruik van secundaire fluorescerende antilichamen en confocale microscopie om deze heterochromatineaggregaten nauwkeuriger en gedetailleerder te observeren.
Introduction
Sinds de vroege studies van Emil Heitz1wordt heterochromatine beschouwd als een belangrijke regulator van cellulaire processen zoals genexpressie, meiotische en mitotische scheiding van chromosomen en het behoud van genoomstabiliteit2,3,4.
Heterochromatine is voornamelijk onderverdeeld in twee soorten: constitutieve heterochromatine die kenmerkend repetitieve sequenties definieert, en transponeerbare elementen die aanwezig zijn op specifieke chromosoomplaatsen zoals de telomeren en centromeren. Dit type heterochromatine wordt voornamelijk epigenetisch gedefinieerd door specifieke histontekens zoals de di- of trimethylatie van lysine 9 van histon H3 (H3K9me3) en de binding van het Heterochromatine-eiwit 1a (HP1a)5,6. Aan de andere kant lokaliseert facultatieve heterochromatine zich via de armen van het chromosoom en bestaat het voornamelijk uit ontwikkelingsstiltegenen7,8. Immunostaining van heterochromatineblokken in metafasecellen, of de observatie van heterochromatineaggregaten in interfasecellen, heeft veel licht onthuld in het begrip van de vorming en functie van heterochromatische gebieden9.
Het gebruik van Drosophila als modelsysteem heeft de ontwikkeling van essentiële instrumenten mogelijk maken om heterochromatine te bestuderen zonder het gebruik van elektronenmicroscopie10. Sinds de beschrijving van positie-effectvariëtatie en de ontdekking van heterochromatine-geassocieerde eiwitten, zoals HP1a, en histon post-translationele modificaties, hebben veel groepen verschillende immunohistochemische technieken ontwikkeld die visualisatie van deze heterochromatische gebieden10,11mogelijk maken .
Deze technieken zijn gebaseerd op het gebruik van specifieke antilichamen die heterochromatine-geassocieerde eiwitten of histonen herkennen. Voor elk celtype en antilichaam moeten de fixatie- en permeabilisatieomstandigheden empirisch worden bepaald. Ook kunnen de omstandigheden variëren als aanvullende mechanische processen zoals squashtechnieken worden gebruikt. In dit protocol beschrijven we het gebruik van Drosophila speekselklieren om heterochromatische foci te bestuderen. Speekselklieren hebben gepolyteniseerde cellen die meer dan 1.000 kopieën van het genoom bevatten, waardoor een versterkt beeld wordt verkregen van de meeste chromatinekenmerken, met uitzondering van satelliet-DNA en sommige heterochromatische gebieden die worden gerepliceerd. Niettemin worden heterochromatinegebieden gemakkelijk gevisualiseerd in polytene-chromosoompreparaten, maar de squashtechnieken kunnen soms karakteristieke chromatinegebonden complexen of de chromatinearchitectuur verstoren. Daarom kan immunolokalisatie van eiwitten in het hele speekselklierweefsel deze ongewenste effecten overtreffen. We hebben dit protocol gebruikt om verschillende chromatine gebonden eiwitten te detecteren, en we hebben aangetoond dat dit protocol in combinatie met mutante Drosophila-voorraden kan worden gebruikt om heterochromatineverstoring te bestuderen12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Derde instar larvencultuur
- Bereid 1 liter standaard media door toevoeging van 100 g gist, 100 g ongeraffineerde hele rietsuiker, 16 g agar, 10 ml propionzuur en 14 g gelatine. Los alle ingrediënten behalve de gist op in 800 ml leidingwater en los vervolgens de gist op. Autoclaaf onmiddellijk gedurende 30 minuten.
- Laat de media daarna afkoelen tot 60 °C en voeg propionzuur toe aan een eindconcentratie van 0,01%. Laat de fles staan tot de gelatine gevormd is.
- Om de 3o instar larvencultuur te optimaliseren, verzamel eerst 5-tot-10-daagse oude volwassenen en plaats 50 (25 mannetjes en 25 vrouwtjes) in een brede nekfles met standaardmedia.
- Plaats de fles met de vliegen in een incubator met gecontroleerde temperatuur op 25 °C tot het aantal gelegde eieren 50 is (ongeveer 12 uur voor de wilde stam).
- Nadat de incubatietijd voorbij is, verwijdert u de volwassenen en zet u ze over in een nieuwe fles om de procedure te herhalen. Laat de embryo's 72 uur groeien bij 18 °C
OPMERKING: Voor meer informatie over drosophila voorraad onderhoudsvoorwaarden, zie Tennessen & Thymmel13.
2. Larven collectie
- Kies voor larvenverzameling de zwervende larven die nooit spiracles hebben. Na de eversie van de spiracles komt de larve in het prepupale stadium, met behoud van uitstekende polytene-chromosomen die geschikt zijn voor analyse. Pas na 12 uur beginnen de cellen van de speekselklier zich voor te bereiden op geprogrammeerde celdood14,15.
- Neem vijftien 3° instar larven en doe ze in een horlogeglas om ze te wassen. Breng ze vervolgens over naar een ijskoude zoutoplossing of PBS (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4,stel de pH in op 7,4).
- Ontleed 15 tot 30 paar speekselklieren (of zoveel mogelijk in 30 minuten) in koud PBS met proteaseremmers onder de stereoscopische microscoop. Breng de speekselklieren over naar een buis van 1,5 ml met ijskoud PBS.
- Was eenmaal met 1 ml PBS plus proteaseremmers. Wacht tot het weefsel de bodem van de buis bereikt.
- Verwijder na het wassen de PBS met een pipet van 1000 μL. Zorg ervoor dat je het weefsel niet aanraakt.
- Als alternatief ontleedt u de speekselklieren in 5 ml PBS om de noodzaak voor deze wasstap te elimineren en gaat u verder met stap 3 door de speekselklieren over te brengen naar 0,5 ml van de Ruvkun-fixatiebuffer die hieronder wordt beschreven.
3. Speekselklierweefselfixatie
- Voeg na het verwijderen van de PBS van de laatste stap direct 0,5 ml 1x Ruvkun-fixatiebuffer toe, met 50% methanol (voeg 0,5 ml methanol toe) en 2% formaldehyde.
OPMERKING: 2x Ruvkun oplossing is 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES bij pH 7.4. - Incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C met milde rotatie.
4. Speekselklierweefsel wassen
- Voer een rotatiewas van 5 minuten uit met 1 ml Tris/Triton buffer (100 mM Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 en 1 mM EDTA).
OPMERKING: Wacht tot het weefsel de onderkant van de buis bereikt.
5. Permeabilisatie
- Incubeer de speekselklieren in 1 ml Tris/Triton X-100 (hetzelfde als hierboven). Voor sommige eiwitten kan het nodig zijn om 1% β-mercaptoethanol toe te voegen.
- Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C met licht schudden (300 tpm).
6. Conserveringsstap (optioneel)
OPMERKING: Als u niet onmiddellijk doorgaat naar de incubatie met het antilichaam, bewaar dan het weefsel als volgt.
- Wassen met 1 ml BO3 buffer (0,01 M H3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) en vervolgens incuberen in BO3/10 mM DTT bij 37 ° C met mild schudden (300 tpm) gedurende 15 minuten.
- Voer aan het einde van de incubatieperiode alleen een wasbeurt uit met alleen 1 ml BO3-buffer.
OPMERKING: Wacht tot het weefsel de onderkant van de buis bereikt. - Voeg 1 ml PBS toe. Bewaar het weefsel in deze oplossing tot 72 uur bij 4 °C en ga dan verder met de volgende stap. Deze stap is vooral nuttig bij het werken met verschillende mutante stammen die een vertraagde levenscyclus kunnen vertonen, zodat de immunodetection tegelijkertijd samen met de controles kan worden uitgevoerd.
7. Weefselblokkering
- Incubeer de speekselklieren in 1 ml buffer B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met rotatie.
8. Immunostaining
- Verwijder alle buffer B en voeg buffer A (PBS + 0,1% BSA) plus antilichaam van belang toe.
OPMERKING: We gebruiken de HP1a C1A9c (geconcentreerd antilichaam) van Hybridoma Bank tot 1:3000. Bij gebruik van de C1A9s (supernatans) hebben we geprobeerd van 1:100 tot een 1:500 verdunning en elke verdunning tussen deze rang werkt goed) 's nachts bij 4 oC met rotatie. Op dit punt is het belangrijk dat het schudden geen bellen opwekt die het antilichaam kunnen beschadigen.
9. Immunostaining wassen
- Wasbeurten van 3 x 15 minuten met buffer B onder roeren bij kamertemperatuur met telkens 1 ml.
- Breng de klieren over naar buffer B samen met het secundaire antilichaam gekoppeld aan een fluorofoor gedurende 2 uur onder rotatie bij 4 oC (secundair antilichaam Alexa fluor 568 Invitrogen werd gebruikt 1:3000).
- Bedek de buis met aluminiumpapierfolie om het secundaire antilichaam tegen het licht te beschermen.
- Was 2 x 15 minuten bij kamertemperatuur tijdens het draaien met 1 ml buffer B.
- Incubeer met een DNA-marker zoals Sytox (neem 2 μL van 5 mM bouillon en los op in 1 ml buffer B) of Hoechst (neem 1 μL van 10 mg/ml bouillon en los op in 1 ml buffer B) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met rotatie.
- Voer één wasbeurt uit met buffer B en eenmaal met PBS, elke was duurt 10 minuten terwijl u op kamertemperatuur draait.
OPMERKING: Vergeet niet om het te beschermen tegen het licht.
10. Beeldvorming
- Monteer de speekselklieren op een glijbaan en maak een zwembad met een afdeklip.
- Plaats de speekselklieren in het midden van het zwembad en bedek met AF1 citifluor om de vorming van bellen te voorkomen die de stroperige vloeistof over de hele plaats verlengen. Sluit vervolgens alle zijkanten af met duidelijke nagellak.
- Observeer onder een fluorescentie- of confocale microscoop. Als het monster niet op dezelfde dag wordt waargenomen, berg het dan bij 4 °C uit de buurt van licht op.
- Gebruik GraphPad Prism 6 om alle grafieken en statistische analyses te genereren.
- Analyseer de gegevens van HP1a-distributie in speekselklieren met behulp van de Kruskal-Wallis-test. De statistische significantie werd vastgesteld op (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten van HP1a immunostaining in drosophila speekselklieren zijn weergegeven in figuur 1. Een positief resultaat is het waarnemen van één brandpunt (figuur 1a) (heterochromatisch aggregaat of condensaat). Een negatief resultaat is geen signaal of een verspreid signaal. Soms kan een dubbel signaal worden waargenomen, dat wil zeggen met een dubbel punt(figuur 1c),maar het komt meestal in kleinere hoeveelheden voor.
Gegevensanalyse kan worden weergegeven als staafgrafieken, waarbij de verdeling van HP1a binnen verschillende mutante achtergronden wordt vergeleken. In figuur 2 zien we bijvoorbeeld dat 98% van de kernen van het wilde type een verdeling van één brandpunt vertoont en 2% van de kernen twee foci, terwijl in de mutant het aandeel verandert en de aanwezigheid van twee foci toeneemt tot 40%.
Figuur 3 toont representatieve H3k9me3 immunostaining resultaten in Drosophila speekselklieren. We kunnen één brandpunt(figuur 3b)waarnemen dat lijkt op het HP1a-immunostaining (heterochromatisch aggregaat of condensaat). Een dubbel of drievoudig signaal (figuur 3c) is in zeldzame gevallen te zien bij wilde soorten.
Figuur 1. Representatief confocale microscopiebeeld van speekselklier immunostaining met HP1a antilichaam van wild type (wt). a) DNA (cyaansignaal), HP1a (magentasignaal) en samenvoegschaalbalk 100 μm. Bij immunostaining voor HP1a wordt een kern met een brandpunt gemarkeerd met een witte pijl en een kern met twee foci met een stippellijnvak. De rechterkolom toont een uitvergrote afbeelding van een enkele kern met een schaalbalk van 5 μm. b) brandpuntsverdeling. c) twee foci distributie. Beide kernen zijn gemarkeerd met een witte stippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Voorbeelden zijn het tellen van kernen foci distributie vanHP1a immunostaining. De eerste balk geeft het tellen van de kernen van het wilde type (wt) weer, zoals in figuur 1. De tweede staaf vertegenwoordigt een mutante stam die deze verdeling beïnvloedt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Representatief confocaal microscopiebeeld van speekselklier immunostaining met H3K9me3 antilichaam van wild type (wt). a) DNA (cyaansignaal), H3K9me3 (magentasignaal) en samenvoegschaalbalk 100 μm. In immunostaining voor H3K9me3.De rechterkolom toont een vergroot beeld van een enkele kern met een schaalbalk van 5 μm. b) een kern met een focale verdeling. c) drie foci distributie. Beide kernen zijn gemarkeerd met een witte stippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De cellulaire functie van eukaryotische organismen kan de 3D-structuur in de kern definiëren, die wordt ondersteund door interacties tussen verschillende eiwitten met chromatine en verschillende moleculen, waaronder RNA. In de afgelopen drie jaar hebben de biologische condensaten die relevant zijn geweest, waaronder heterochromatine, een fundamentele rol gespeeld bij de bepaling van de fasescheiding ter bevordering van de afzonderlijke nucleaire ruimtelijke organisatie van actief en repressief chromatine 16,17,18.
Heterochromatine is essentieel voor het behoud van celfuncties en identiteit. Eerder werd gedacht dat deze dichte gebieden niet werden getranscribeerd. Nu we echter krachtigere technologieën hebben, kunnen we zien dat de heterochromatine niet alleen wordt getranscribeerd, maar ook een fundamenteel proces om de steiger van de kern te behouden en gevoelig is voor ontwikkelings- of pathologische processen12,19. Bovendien hebben bepaalde genen ingebed in pericentrische heterochromatine een heterochromatische omgeving nodig om goed te functioneren. HP1a-mutaties verminderen de expressie van de licht- en rolgenen, die als eerste werden ontdekt19. Deze genen zijn essentieel voor de overleving van het organisme en worden gevonden in heterochromatineblokken. Als gevolg hiervan heeft deze eigenaardige genoomcomponent, ondanks zijn vermogen om geluiddemping te induceren, het potentieel om zeer dynamisch te zijn20. In een complexe balans tussen chromatinegebonden en diffuse types die door verschillende biologische contexten kunnen worden gecontroleerd, bestaan ook heterochromatine-geassocieerde eiwitten zoals HP1a. Onlangs werd ook gesuggereerd dat fasescheidingseigenschappen worden aangetoond door de assemblage van heterochromatinecondensaten21,22.
Er zijn een aantal artikelen waarin de auteurs immunostaining van drosophila speekselklierkernen uitvoerden met behulp van verschillende en soms eenvoudigere protocollen23,24. In dit geval pasten we een protocol aan dat eerst werd beschreven in C. elegans25, en vervolgens werd gebruikt in Drosophila speekselklieren door verschillende groepen26,27,28,29 en combineerde het met het gebruik van confocale microscopie en mutante organismen. Dit protocol maakt ook visualisatie van verschillende soorten eiwitten mogelijk, waaronder transcriptiefactoren zoals XPD, XPB en TBP27, maar ook heterochromatinegebonden eiwitten zoals HP1a en histontekens zoals H3K9me3, die het positioneert als een protocol voor breed gebruik in dit weefsel. Het heeft ook het voordeel dat het weefsel in een tussenstap kan worden opgeslagen zonder polytene-chromosoombanding aan te tasten.
Dit protocol is betrouwbaar en kosteneffectief door het gebruik van een specifiek antilichaam om het HP1a-eiwit te bekijken. De cruciale stap in dit protocol is om te voorkomen dat de klieren verloren gaan tijdens het wassen en wachten tot het weefsel naar beneden zakt. Het voordeel van het gebruik van speekselklieren is dat een 3D-weergave van de kern en de conformatie ervan gemakkelijk kan worden verkregen, in tegenstelling tot de polytene-chromosoomtechniek die een mechanische verstoring van de cel vereist en het chromatine kan beschadigen. Tijdens het uitvoeren van dit protocol moet speciale zorg worden genomen tijdens de wasstappen. Als het niet zorgvuldig wordt uitgevoerd, zal het weefsel breken en zou het niet mogelijk zijn om afbeeldingen van hoge kwaliteit te verkrijgen.
Om het belang te evalueren van het gebrek aan binding van RNA aan de regio's of eiwitten die worden waargenomen, is het noodzakelijk om een wasbeurt toe te voegen met buffer C (buffer B zonder EDTA) en 100 μM RNase toe te voegen. Deze was moet worden uitgevoerd gedurende 1 uur bij 37 °C zoals eerder beschreven. Wassen moet worden gedaan vóór de stap waarin moleculen worden toegevoegd om het DNA te observeren (tussen stap 9.3 en 9.4).
Confocale microscopie lijkt misschien geen zeer nieuwe methodologie om vragen over heterochromatinecondensaten25,30aan te pakken, maar het is uiterst nuttig geweest om delocalisatie van het HP1a-eiwit in Drosophila-kernen te identificeren, wat wijst op ernstige problemen in chromatinestructuur die grondiger met andere technieken kunnen worden geëvalueerd. Ondanks de beperking kan het worden gebruikt in combinatie met microscopie met hoge resolutie als een eerste benadering om nieuwe technieken toe te passen om de biologische activiteit te verduidelijken die heterochromatinecondensaatassemblage, -controle en -functies moduleert31. Sommige van deze nieuwe methodologieën die zich richten op de moleculaire en biofysische interacties tussen heterochromatine, RNA en heterochromatine-geassocieerde eiwitten worden verzameld uit deze reeks methoden om heterochromatinecondensaten te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.
Acknowledgments
We danken Marco Antonio Rosales Vega en Abel Segura voor het maken van enkele confocale beelden, Carmen Muñoz voor mediavoorbereiding en Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui en Dr. Chris Wood van het LMNA voor advies over het gebruik van de microscopen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
| 16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
| BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
| Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
| Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22x22, brand not critical |
| DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
| EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
| EGTA | brand not critical | ||
| Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
| H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
| H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
| HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
| KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
| Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
| NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
| NaOH | brand not critical | ||
| PIPES | brand not critical | ||
| Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
| Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
| Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |
References
- Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).
- Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
- Kasinathan, B., et al. Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila. Elife. , 1-31 (2020).
- Lifschytz, E., Hareven, D. Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).
- Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
- Lee, Y. C. G., et al. Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin. PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).
- Koryakov, D. E., et al. The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).
- Cao, R., et al. Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing. Science. 298 (5595), 1039 (2002).
- Hines, K. A., et al. Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading. Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).
- Elgin, S. C. R., Reuter, G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).
- Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
- Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription. BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).
- Tennessen, J. M., Thummel, C. S. Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila. Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).
- Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling. Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M.
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
- Larson, A. G., Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).
- Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α. Methods in Enzymology. , (2018).
- Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).
- Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster. Trends in Genetics. , (2019).
- Strom, A. R., et al.
- Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
- Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes. Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).
- Kolesnikova, T. D., et al. Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene. Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).
- Messina, G., et al. Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization. Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).
- Aguilar-Fuentes, J., et al. p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model. PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).
- Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes. Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).
- Farkaš, R., Mechler, B. M. The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response. Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).
- Zhang, P., Spradling, A. C. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).
- Stormo, B. M., Fox, D. T. Polyteny: still a giant player in chromosome research. Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).
