Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Immunfluoreserende farging for visualisering av Heterochromatin assosierte proteiner i Drosophila spyttkjertler

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62408
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

Denne protokollen tar sikte på å visualisere heterochromatin aggregater i Drosophila polytene celler.

Abstract

Visualisering av heterochromatin aggregater ved immunstaining kan være utfordrende. Mange pattedyrkomponenter av kromatin er bevart i Drosophila melanogaster. Derfor er det en utmerket modell for å studere heterochromatindannelse og vedlikehold. Polyteniserte celler, som de som finnes i spyttkjertler av tredje instar D. melanogaster larver, gir et utmerket verktøy for å observere kromatin forsterket nesten tusen ganger og har tillatt forskere å studere endringer i fordelingen av heterokromatin i kjernen. Selv om observasjonen av heterokromatinkomponenter kan utføres direkte i polytene kromosompreparater, kan lokaliseringen av noen proteiner endres av alvorlighetsgraden av behandlingen. Derfor utfyller direkte visualisering av heterokromatin i celler denne typen studier. I denne protokollen beskriver vi immunoppfatningsteknikker som brukes for dette vevet, bruk av sekundære fluorescerende antistoffer og konfiskert mikroskopi for å observere disse heterokromatinaggregatene med større presisjon og detaljer.

Introduction

Siden de tidlige studiene av Emil Heitz1har heterokromatin blitt ansett som en viktig regulator av cellulære prosesser som genuttrykk, meiotisk og mititotisk separasjon av kromosomer og vedlikehold av genomstabilitet2,3,4.

Heterochromatin er hovedsakelig delt inn i to typer: konstituerende heterokromatin som karakteristisk definerer repeterende sekvenser og transponerbare elementer som er til stede på spesifikke kromosomsteder som telomerer og sentromerer. Denne typen heterokromatin er hovedsakelig definert epigenetisk av spesifikke histone merker som di eller tri-metylering av lysin 9 av histone H3 (H3K9me3) og bindingen av Heterochromatin protein 1a (HP1a)5,6. På den annen side lokaliserer fakultets heterochromatin gjennom kromosomets armer og består hovedsakelig av utviklingshemmelige gener7,8. Immunostaining av heterokromatinblokker i metafaseceller, eller observasjon av heterokromatinaggregater i interfaseceller, har avduket mye lys i forståelsen av dannelsen og funksjonen til heterokromatiske regioner9.

Bruken av Drosophila som modellsystem har gjort det mulig å utvikle essensielle verktøy for å studere heterokromatin uten bruk av elektronmikroskopi10. Siden beskrivelsen av posisjonseffektvariasjon og oppdagelsen av heterokromatin-assosierte proteiner, som HP1a og histone post-translasjonelle modifikasjoner, har mange grupper utviklet flere immunhiistokjemiske teknikker som tillater visualisering av disse heterochromatiske områdene10,11.

Disse teknikkene er basert på bruk av spesifikke antistoffer som gjenkjenner heterokromatin-assosierte proteiner eller histone merker. For hver celletype og antistoff må fikserings- og permeabiliseringsbetingelsene bestemmes empirisk. Forholdene kan også variere hvis ytterligere mekaniske prosesser som squashing teknikker brukes. I denne protokollen beskriver vi bruken av Drosophila spyttkjertler for å studere heterokromatisk foci. Spyttkjertler har polyteniserte celler som inneholder mer enn 1000 kopier av genomet, og gir dermed et forsterket syn på de fleste kromatinfunksjonene, med unntak av satellitt-DNA og noen heterokromatiske regioner som er under replikert. Likevel er heterokromatinregioner lett visualisert i polytene kromosompreparater, men squashingteknikkene kan noen ganger forstyrre karakteristiske kromatinbundne komplekser eller kromatinarkitekturen. Derfor kan immunokalisering av proteiner i hele spyttkjertelvev overgå disse uønskede effektene. Vi har brukt denne protokollen til å oppdage flere kromatinbundne proteiner, og vi har vist at denne protokollen kombinert med mutant Drosophila-aksjer kan brukes til å studere heterokromatinforstyrrelser12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tredje instar larver kultur

  1. Forbered 1 liter standardmedier ved å legge til 100 g gjær, 100 g uraffinert hele sukkerrør, 16 g agar, 10 ml propionsyre og 14 g gelatin. Løs opp alle ingrediensene unntatt gjæren i 800 ml vann fra springen og oppløs deretter gjæren. Autoklav umiddelbart i 30 minutter.
    1. Etterpå, la media avkjøle ned til 60 °C og tilsett propionsyre til en endelig konsentrasjon 0,01%. La flasken stå til gelatin er dannet.
  2. For å optimalisere 3o instar larver kultur, samle først 5-til-10-dagers gamle voksne og plasser 50 (25 menn og 25 kvinner) i en bred nakkeflaske med standardmedier.
  3. Plasser flasken med fluene i en kontrollert temperaturinkubator ved 25 °C til antall egg som legges er 50 (ca. 12 timer for den ville stammen).
  4. Etter at inkubasjonstiden er over, fjern de voksne og overfør dem til en ny flaske for å gjenta prosedyren. La embryoene vokse ved 18 °C i 72 timer
    MERK: For mer om Drosophila lagervedlikeholdsforhold, se Tennessen &Thymmel13.

2. Larver samling

  1. For larver samling velg vandrende larver som ikke har everted spiracles. Etter eversjon av spirakler går larven inn i prepupalstadiet, samtidig som den beholder gode polyfinkromosomer som er egnet for analyse. Først etter 12 timer begynner cellene i spyttkjertelen å forberede seg på programmert celledød14,15.
  2. Ta femten 3 ° instar larver og legg dem i et klokkeglass for å vaske dem. Overfør dem deretter til en iskald saltløsning eller PBS (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, juster pH til 7,4).
  3. Disseker 15 til 30 par spyttkjertler (eller så mange som mulig på 30 minutter) i kald PBS med proteasehemmere under det stereoskopiske mikroskopet. Overfør spyttkjertlene til et 1,5 ml rør med iskald PBS.
  4. Vask en gang med 1 ml PBS pluss proteasehemmere. Vent til vevet når bunnen av røret.
  5. Etter vasken, fjern PBS med en 1000 μL pipette. Pass på at du ikke berører vevet.
    1. Alternativt kan du dissekere spyttkjertlene i 5 ml PBS for å eliminere behovet for dette vasketrinnet og fortsette til trinn 3 ved å overføre spyttkjertlene til 0,5 ml Ruvkun-festebufferen beskrevet nedenfor.

3. Spyttkjertel vev fiksering

  1. Etter å ha fjernet PBS fra det siste trinnet, legg direkte til 0,5 ml 1x Ruvkun-fikseringsbuffer, med 50% metanol (tilsett 0,5 ml metanol) og 2% formaldehyd.
    MERK: 2x Ruvkun-oppløsning er 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM RØR ved pH 7,4.
  2. Inkuber i 2 timer ved 4 °C med mild rotasjon.

4. Spyttkjertel vev vask

  1. Utfør en 5-minutters rotasjonsvask med 1 ml Tris/Triton-buffer (100 mM Tris pH 7,4, 1 % Triton X-100 og 1 mM EDTA).
    MERK: Vent til vevet når bunnen av røret.

5. Permeabilisering

  1. Inkuber spyttkjertlene i 1 ml Tris/Triton X-100 (det samme som ovenfor). For noen proteiner kan det være nødvendig å legge til 1% β-mercaptoetanol.
  2. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C med mild risting (300 rpm).

6. Bevaring trinn (valgfritt)

MERK: Hvis du ikke fortsetter umiddelbart til inkubasjonen med antistoffet, må du bevare vevet på følgende måte.

  1. Vask med 1 ml BO3 buffer (0,01 M H3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) og inkuber deretter i BO3/10 mM DTT ved 37 ° C med mild risting (300 rpm) i 15 minutter.
  2. På slutten av inkubasjonsperioden, utfør en vask med 1 ml BO3 buffer alene.
    MERK: Vent til vevet når bunnen av røret.
  3. Tilsett 1 ml PBS. Bevar vevet i denne løsningen ved 4 °C i opptil 72 timer, og fortsett deretter med neste trinn. Dette trinnet er spesielt nyttig når du arbeider med forskjellige mutantstammer som kan presentere en forsinket livssyklus, slik at immunodeteksjonen kan utføres samtidig sammen med kontrollene.

7. Vevsblokkering

  1. Inkuber spyttkjertlene i 1 ml buffer B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) i 2 timer ved romtemperatur med rotasjon.

8. Immunstaining

  1. Fjern all buffer B og tilsett buffer A (PBS + 0,1% BSA) pluss antistoff av interesse.
    MERK: Vi bruker HP1a C1A9c (konsentrert antistoff) fra Hybridoma Bank opp til 1:3000. Ved bruk av C1A9s (supernatant) har vi prøvd fra 1:100 til en 1:500 fortynning og eventuell fortynning mellom denne rangeringen fungerer bra) over natten ved 4 oC med rotasjon. På dette tidspunktet er det viktig at ristingen ikke øker bobler som kan skade antistoffet.

9. Immunostaining vasking

  1. Utfør 3 x 15-minutters vask med buffer B under omrøring ved romtemperatur ved bruk av 1 ml hver gang.
  2. Overfør kjertlene til buffer B sammen med det sekundære antistoffet koblet til en fluorofor i 2 timer under rotasjon ved 4 oC (sekundært antistoff Alexa fluor 568 Invitrogen ble brukt 1:3000).
    1. Dekk røret med aluminiumspapirfolie for å beskytte det sekundære antistoffet mot lyset.
  3. Utfør 2 x 15-minutters vask ved romtemperatur mens rotasjon med 1 ml buffer B.
  4. Inkuber med en DNA-markør som Sytox (ta 2 μL 5 mM lager og oppløs i 1 ml buffer B) eller Hoechst (ta 1 μL 10 mg / ml lager og oppløs i 1 ml buffer B) i 10 minutter ved romtemperatur med rotasjon.
  5. Utfør en vask med buffer B og en gang med PBS, hver vask som varer i 10 minutter mens du roterer ved romtemperatur.
    MERK: Husk å beskytte den mot lyset.

10. Bildebehandling

  1. Monter spyttkjertlene på en sklie, og lag et basseng med deksler.
  2. Sett spyttkjertlene midt i bassenget og dekk med AF1 citifluor for å unngå dannelse av bobler som utvider den viskøse væsken over alt. Forsegle deretter alle sidene med klar neglelakk.
  3. Vær oppmerksom på under fluorescens eller konfokalt mikroskop. Hvis prøven ikke skal observeres samme dag, må du oppbevare den borte fra lyset ved 4 °C.
  4. Bruk GraphPad Prism 6 til å generere alle grafer og statistiske analyser.
  5. Analyser dataene fra HP1a-distribusjon i spyttkjertler ved hjelp av Kruskal-Wallis-testen. Statistisk signifikans ble satt til (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative resultater av HP1a-immunostaining i Drosophila spyttkjertler er vist i figur 1. Et positivt resultat er å observere ett fokuspunkt (figur 1a) (heterochromatisk aggregat eller kondensat). Et negativt resultat er ikke noe signal eller et spredt signal. Noen ganger kan man observere et dobbeltsignal, det vilt med et dobbeltpunkt (figur 1c), men det forekommer vanligvis i mindre mengder.

Dataanalyse kan representeres som stolpediagrammer, og sammenligner fordelingen av HP1a innenfor forskjellige mutantbakgrunner. For eksempel kan vi i figur 2 se at 98% av de ville typekjernene presenterer en fordeling av ett fokuspunkt og 2% av kjernene presenterer to foci, mens i mutanten endres andelen, og tilstedeværelsen av to foci øker til 40%.

Figur 3 viser representative H3k9me3 immunopprørende resultater i Drosophila spyttkjertler. Vi kan observere ett fokuspunkt (figur 3b) som ligner hp1a immunstaining( heterochromatisk aggregat eller kondensat). Et dobbelt- eller trippelsignal (figur 3c) kan ses ved sjeldne anledninger i de ville typestammene.

Figure 1
Figur 1. Representativt konfokalt mikroskopibilde fra spyttkjertelimmunostaining med HP1a-antistoff fra vill type (wt). a) DNA (cyan signal), HP1a (magenta signal) og slå sammen skala bar 100 μm. Ved immunisering for HP1a er en kjerne med fokuspunkt merket med en hvit pil og en kjerne med to fokuser med en prikkete linjeboks. Den høyre kolonnen viser et forstørret bilde av en enkelt kjerne med en skalalinje på 5 μm. b) brennvidde. c) to foci-fordelinger. Begge kjernene er merket med en hvit stiplet linje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Eksempler skyldes telling av nuklei foci-distribusjon avHP1a-immunstaining. Den første linjen representerer tellingen av wild-type nuclei (wt), som i figur 1. Den andre linjen representerer en mutantstamme som påvirker denne fordelingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Representativt konfokalt mikroskopibilde fra spyttkjertelimmunostaining med H3K9me3 antistoff fra vill type (wt). a) DNA (cyan signal), H3K9me3 (magenta signal) og slå sammen skala bar 100 μm. I immunostaining for H3K9me3.Den høyre kolonnen viser et forstørret bilde av en enkelt kjerne med en skala bar på 5 μm. b) en kjerne med en brennvidde. c) tre foci-fordeling. Begge kjernene er merket med en hvit stiplet linje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den cellulære funksjonen til eukaryote organismer kan definere 3D-strukturen i kjernen, som støttes av interaksjoner mellom forskjellige proteiner med kromatin og ulike molekyler, inkludert RNA. I løpet av de siste tre årene har de biologiske kondensatene som har hatt relevans, inkludert heterokromatin, tatt en grunnleggende rolle i bestemmelsen av faseseparasjonen som fremmer den distinkte kjernefysiske romlige organiseringen av aktiv og undertrykkende kromatin 16,17,18.

Heterochromatin er viktig for å bevare cellefunksjoner og identitet. Tidligere ble det antatt at disse tette områdene ikke ble transkribert. Men nå som vi har kraftigere teknologier, kan vi se at heterochromatin ikke bare transkriberes, men også en grunnleggende prosess for å opprettholde stillaset i kjernen og er følsom for utviklingsmessige eller patologiske prosesser12,19. Dessuten trenger visse gener innebygd i pericentric heterochromatin et heterochromatisk miljø for å fungere ordentlig. HP1a-mutasjoner reduserer uttrykket av de lette og rullede genene, som var de første som ble oppdaget19. Disse genene er avgjørende for organismens overlevelse og finnes i heterokromatinblokker. Som et resultat, til tross for sin evne til å indusere silencing, har denne særegne genomkomponenten potensial til å være svært dynamisk20. I en kompleks balanse mellom kromatinbundne og diffuse typer som kan kontrolleres av ulike biologiske sammenhenger, eksisterer også heterokromatinrelaterte proteiner som HP1a. Det ble også nylig antydet at faseseparasjonsegenskaper vises ved montering av heterokromatinkondensater21,22.

Det finnes en rekke papirer der forfatterne utførte helmontert immunostaining av Drosophila spyttkjertelkjerner ved hjelp av forskjellige og noen ganger enklere protokoller23,24. I dette tilfellet tilpasset vi en protokoll først beskrevet i C. elegans25, og deretter brukt i Drosophila spyttkjertler av flere grupper26,27,28,29 og kombinert den med bruk av konfokal mikroskopi og mutante organismer. Denne protokollen tillater også visualisering av ulike typer proteiner, inkludert transkripsjonsfaktorer som XPD, XPB og TBP27, men også heterokromatinbundne proteiner som HP1a og histonemerker som H3K9me3, som posisjonerer det som en protokoll for bred bruk i dette vevet. Det har også fordelen at vevet kan lagres på et mellomliggende trinn uten å påvirke polytene kromosombånd.

Denne protokollen er pålitelig og kostnadseffektiv på grunn av bruk av et spesifikt antistoff for å se HP1a-proteinet. Det kritiske trinnet i denne protokollen er å unngå å miste kjertlene under vask og vente på at vevet skal bunne ut. Fordelen med å bruke spyttkjertler er at en 3D-visning av kjernen og dens konformasjon lett kan oppnås, i motsetning til polyten kromosomteknikken som krever en mekanisk forstyrrelse av cellen og kan skade kromatinet. Mens du utfører denne protokollen, bør det tas spesiell forsiktighet under vasketrinnene. Hvis det ikke utføres nøye, vil vevet bryte, og det ville ikke være mulig å skaffe bilder av høy kvalitet.

For å evaluere viktigheten av mangel på binding av RNA til regionene eller proteinene som observeres, er det nødvendig å legge til en vask med Buffer C (Buffer B uten EDTA) og tilsett 100 μM RNase. Denne vasken skal utføres i 1 time ved 37 °C som tidligere beskrevet. Vasking bør gjøres før trinnet der molekyler legges til for å observere DNA (mellom trinn 9,3 og 9,4).

Konfokal mikroskopi virker kanskje ikke som en veldig ny metodikk for å løse spørsmål om heterokromatinkondensater25,30, men det har vært ekstremt nyttig å identifisere delokalisering av HP1a-proteinet i Drosophila-kjernene, noe som antyder alvorlige problemer i kromatinstruktur som kan evalueres med andre teknikker grundigere. Til tross for begrensningen kan den brukes i kombinasjon med høyoppløselig mikroskopi som en første tilnærming for å bruke nye teknikker for å avklare den biologiske aktiviteten som modulerer heterochromatinkondensatmontering, kontroll og funksjoner31. Noen av disse nye metodene som fokuserer på molekylære og biofysiske interaksjoner mellom heterokromatin, RNA og heterokromatin-assosierte proteiner, samles fra dette settet med metoder for å teste heterokromatinkondensater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Marco Antonio Rosales Vega og Abel Segura for å ha tatt noen av de konfiske bildene, Carmen Muñoz for medieforberedelse og Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui og Dr. Chris Wood fra LMNA for råd om bruk av mikroskopene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 11351904 brand not critical
16% formaldehyde Thermo Scientific 28908
AF1 Citifluor Ted pella 19470 25 mL
BSA, Molecular Biology Grade Roche 10735078001 brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free
protease inhibitors		 Merck 5892953001
Coverslip Corning CLS285022-200EA 22x22, brand not critical
DTT Sigma d9779 brand not critical
EDTA Sigma E5134 brand not critical
EGTA brand not critical
Glass slide Gold seal 3011 brand not critical
H3BO3 Baker 0084-01 brand not critical
H3K9me3 Abcam 8889
HP1a Hybridoma Bank C1A9 Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl Baker 3040-01 brand not critical
Methanol Baker 9070-03 brand not critical
NaCl Sigma 71376 brand not critical
NaOH brand not critical
PIPES brand not critical
Rotator Thermo Scientific 13-687-12Q  Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C Eppendorf 13527550 SmartBlock 1.5 mL
Tris Milipore 648311 brand not critical
Triton X-100 Sigma T8787 100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710 25 mL, brand not critical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).
  2. Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
  3. Kasinathan, B., et al. Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila. Elife. , 1-31 (2020).
  4. Lifschytz, E., Hareven, D. Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).
  5. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  6. Lee, Y. C. G., et al. Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin. PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).
  7. Koryakov, D. E., et al. The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).
  8. Cao, R., et al. Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing. Science. 298 (5595), 1039 (2002).
  9. Hines, K. A., et al. Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading. Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).
  10. Elgin, S. C. R., Reuter, G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).
  11. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  12. Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription. BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).
  13. Tennessen, J. M., Thummel, C. S. Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila. Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).
  14. Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling. Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).
  15. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).
  16. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  17. Larson, A. G., Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).
  18. Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α. Methods in Enzymology. , (2018).
  19. Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).
  20. Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster. Trends in Genetics. , (2019).
  21. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  22. Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
  23. Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes. Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).
  24. Kolesnikova, T. D., et al. Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene. Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).
  25. Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).
  26. Messina, G., et al. Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization. Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).
  27. Aguilar-Fuentes, J., et al. p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model. PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).
  28. Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes. Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).
  29. Farkaš, R., Mechler, B. M. The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response. Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).
  30. Zhang, P., Spradling, A. C. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).
  31. Stormo, B. M., Fox, D. T. Polyteny: still a giant player in chromosome research. Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).

Tags

Biologi Utgave 174 Drosophila melanogaster heterochromatin spyttkjertler kromatin immunostaining HP1a
Immunfluoreserende farging for visualisering av Heterochromatin assosierte proteiner i <em>Drosophila</em> spyttkjertler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meyer-Nava, S., Zurita, M.,… More

Meyer-Nava, S., Zurita, M., Valadez-Graham, V. Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands. J. Vis. Exp. (174), e62408, doi:10.3791/62408 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter