Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Drosophila Tükürük Bezlerinde Heterokromatin İlişkili Proteinlerin Görselleştirilmesi için İmmünofluoresan Boyama

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62408
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

Bu protokol, Drosophila politen hücrelerindeki heterokromatin agregalarını görselleştirmeyi amaçlamaktadır.

Abstract

Heterokromatin agregalarının immünostainleme ile görselleştirilmesi zor olabilir. Kromatin birçok memeli bileşeni Drosophila melanogaster'da korunur. Bu nedenle, heterokromatin oluşumunu ve bakımını incelemek için mükemmel birmodeldir. Üçüncü instar D. melanogaster larvalarının tükürük bezlerinde bulunanlar gibi politenize hücreler, yaklaşık bin kez yükseltilen kromatinleri gözlemlemek için mükemmel bir araç sağlar ve araştırmacıların çekirdekteki heterokromatin dağılımındaki değişiklikleri incelemelerine izin verir. Heterokromatin bileşenlerinin gözlemi doğrudan politen kromozom preparatlarında yapılsa da, bazı proteinlerin lokalizasyonu tedavinin şiddeti ile değiştirilebilir. Bu nedenle, hücrelerde heterokromatin'in doğrudan görselleştirilmesi bu tür bir çalışmayı tamamlar. Bu protokolde, bu doku için kullanılan immünostaining tekniklerini, sekonder floresan antikorların kullanımını ve bu heterokromatin agregalarını daha fazla hassasiyet ve ayrıntıyla gözlemlemek için konfokal mikroskopiyi açıklıyoruz.

Introduction

Emil Heitz1'inilk çalışmalarından bu yana heterokromatin gen ekspresyonu, kromozomların meiotik ve mitotik ayrılması ve genom stabilitesinin korunması gibi hücresel süreçlerin önemli bir düzenleyicisi olarak kabul edilmiştir2,3,4.

Heterokromatin esas olarak iki türe ayrılır: karakteristik olarak tekrarlayan dizileri tanımlayan konsitutive heterokromatin ve telomerler ve centromeres gibi belirli kromozom bölgelerinde bulunan transpoze edilebilir elementler. Bu tür heterokromatin esas olarak H3 (H3K9me3) histone 9 lizin di veya tri-metilasyonu ve Heterokromatin proteini 1a (HP1a)5,6bağlanması gibi spesifik histone izleri ile epigenetik olarak tanımlanır. Öte yandan, öğretim üyesi heterokromatin kromozomun kollarında lokalize eder ve esas olarak gelişimsel olarak susturulmuş genlerden oluşur7,8. Metafaz hücrelerindeki heterokromatin bloklarının immünostainasyonu veya ara hücrelerdeki heterokromatin agregalarının gözlemlenmesi, heterokromatik bölgelerin oluşumu ve işlevinin anlaşılmasında çok fazla ışık ortaya çıkarmıştır9.

Drosophila'nın bir model sistemi olarak kullanılması, elektron mikroskopisi kullanmadan heterokromatin çalışması için gerekli aletlerin geliştirilmesine izin10. Pozisyon etkisi değişkenliğinin tanımlanması ve HP1a gibi heterokromatin ilişkili proteinlerin keşfi ve çeviri sonrası değişikliklerden bu yana, birçok grup bu heterokromatik bölgelerin görselleştirilmesine izin veren çeşitli immünohistokimyasal teknikler geliştirmiştir10,11.

Bu teknikler, heterokromatin ilişkili proteinleri veya histone izlerini tanıyan spesifik antikorların kullanımına dayanmaktadır. Her hücre tipi ve antikor için fiksasyon ve permeabilizasyon koşulları ampirik olarak belirlenmelidir. Ayrıca, ezme teknikleri gibi ek mekanik işlemler kullanılırsa koşullar değişebilir. Bu protokolde, heterokromatik odakları incelemek için Drosophila tükürük bezlerinin kullanımını açıklıyoruz. Tükürük bezleri, genomun 1.000'den fazla kopyasını içeren politenize hücrelere sahiptir, böylece uydu DNA'sı ve çoğaltılmış olan bazı heterokromatik bölgeler hariç, kromatin özelliklerinin çoğunun genişletilmiş bir görünümünü sağlar. Bununla birlikte, heterokromatin bölgeleri politen kromozom preparatlarında kolayca görselleştirilir, ancak kabarma teknikleri bazen karakteristik kromatin bağlı kompleksleri veya kromatin mimarisini bozabilir. Bu nedenle, tüm tükürük bezi dokusundaki proteinlerin immünolokalizasyonu bu istenmeyen etkileri aşabilir. Bu protokolü birkaç kromatin bağlı proteini tespit etmek için kullandık ve mutant Drosophila stokları ile birlikte bu protokolün heterokromatin bozulmasını incelemek için kullanılabileceğini gösterdik12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Üçüncü instar larva kültürü

  1. 100 g maya, 100 g arıtılmamış tam kamış şekeri, 16 g agar, 10 mL propiyonik asit ve 14 g jelatin ekleyerek 1 litre standart ortam hazırlayın. Maya hariç tüm malzemeleri 800 mL musluk suyunda çözün ve ardından mayayı çözün. 30 dakika boyunca hemen otoklavlayın.
    1. Daha sonra, ortamın 60 ° C'ye soğumasını bekleyin ve son konsantrasyona% 0.01 propiyonik asit ekleyin. Jelatin oluşana kadar şişeyi bekletin.
  2. 3o instar larva kültürünü optimize etmek için, önce 5 ila 10 günlük yetişkinleri toplayın ve 50 'yi (25 erkek ve 25 kadın) geniş bir boyun standart medya şişesine yerleştirin.
  3. Sinekleri içeren şişeyi, yumurtlanan yumurta sayısı 50 olana kadar (vahşi tip suş için yaklaşık 12 saat) 25 ° C'de kontrollü bir sıcaklık inkübatörüne yerleştirin.
  4. Kuluçka süresi bittikten sonra, yetişkinleri çıkarın ve prosedürü tekrarlamak için yeni bir şişeye aktarın. Embriyoların 72 saat boyunca 18 °C'de büyümesine izin verin
    NOT: Drosophila stok bakım koşulları hakkında daha fazla şey için tennessen > Thymmel13'e bakın.

2. Larva koleksiyonu

  1. Larva koleksiyonu için hiç spiracles olmayan gezgin larvaları seçin. Spiracles'ın eversiyondan sonra larva prepupal aşamaya girer ve analiz için uygun mükemmel politen kromozomlarını korur. Sadece 12 saat sonra tükürük bezinin hücreleri programlanmış hücre ölümü için hazırlanmaya başlar14,15.
  2. On beş 3 ° başlangıç larvası alın ve yıkamak için bir saat camına koyun. Ardından bunları buz gibi bir tuzlu su çözeltisine veya PBS'ye aktarın (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH'ı 7,4'e ayarlayın).
  3. Stereoskopik mikroskop altında proteaz inhibitörleri ile soğuk PBS'de 15 ila 30 çift tükürük bezini (veya 30 dakikada mümkün olduğunca çok) parçalara ayrıştırın. Tükürük bezlerini buz gibi PBS ile 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
  4. 1 mL PBS artı proteaz inhibitörleri ile bir kez yıkayın. Dokunun tüpün dibine ulaşmasını bekleyin.
  5. Yıkamadan sonra PBS'yi 1000 μL pipetle çıkarın. Dokuya dokunmamaya dikkat edin.
    1. Alternatif olarak, bu yıkama adımına olan ihtiyacı ortadan kaldırmak için tükürük bezlerini 5 mL PBS'de parçalara ayrıştırın ve tükürük bezlerini aşağıda açıklanan Ruvkun sabitleme tamponunun 0,5 mL'sine aktararak 3.

3. Tükürük bezi doku fiksasyonu

  1. PBS'yi son adımdan çıkardıktan sonra, doğrudan% 50 metanol (0.5 mL metanol ekleyin) ve% 2 formaldehit ile 0.5 mL 1x Ruvkun sabitleme tamponu ekleyin.
    NOT: 2x Ruvkun çözeltisi 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, pH 7.4'te 30 mM BORULAR'dır.
  2. Hafif dönüş ile 4 °C'de 2 saat kuluçkaya yaslanın.

4. Tükürük bezi doku yıkama

  1. 1 mL Tris/Triton tamponu (100 mM Tris pH 7,4, %1 Triton X-100 ve 1 mM EDTA) ile 5 dakikalık bir dönüş yıkaması gerçekleştirin.
    NOT: Dokunun tüpün altına ulaşmasını bekleyin.

5. Permeabilizasyon

  1. Tükürük bezlerini 1 mL Tris/Triton X-100'de kuluçkaya yatırın (yukarıdakiyle aynı). Bazı proteinler için% 1 β-mercaptoethanol eklemek gerekebilir.
  2. Hafif sallama (300 rpm) ile 37 ° C'de 2 saat kuluçkaya yaslanın.

6. Koruma adımı (isteğe bağlı)

NOT: Antikor ile hemen inkübasyona devam etmiyorsanız, dokuyu aşağıdaki gibi koruyun.

  1. 1 mL BO3 tamponu (0,01 M H3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) ile yıkayın ve ardından37° C'de BO 3 /10 mM DTT'de hafif sallanarak (300 rpm) 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  2. Kuluçka süresinin sonunda, sadece 1 mL BO3 tamponu ile bir yıkama gerçekleştirin.
    NOT: Dokunun tüpün altına ulaşmasını bekleyin.
  3. 1 mL PBS ekleyin. Bu çözeltideki dokuyu 4 °C'de 72 saate kadar koruyun ve ardından bir sonraki adıma geçin. Bu adım, gecikmiş bir yaşam döngüsü sunabilecek farklı mutant suşlarıyla çalışırken özellikle yararlıdır, bu nedenle immünodeteksiyon kontrollerle birlikte aynı anda gerçekleştirilebilir.

7. Doku engelleme

  1. Tükürük bezlerini 1 mL Tampon B'de (PBS + % 0.1 BSA + % 0.5 Triton X-100 + 1 mM EDTA) oda sıcaklığında 2 saat boyunca rotasyonla kuluçkaya yatırın.

8. İmmünasyon

  1. Tüm B tamponlarını çıkarın ve A tamponu (PBS + % 0.1 BSA) artı faiz antikoru ekleyin.
    NOT: Hybridoma Bank'tan 1:3000'e kadar HP1a C1A9c (konsantre antikor) kullanıyoruz. C1A9'ları (supernatant) kullanırken 1:100 ila 1:500 seyreltmeyi denedik ve bu rütbe arasındaki herhangi bir seyreltme iyi çalışıyor) bir gecede 4 oC'de rotasyonla. Bu noktada, titremenin antikora zarar verebilecek kabarcıkları yükseltmemesi önemlidir.

9. İmmünasyon yıkama

  1. Her seferinde 1 mL kullanarak oda sıcaklığında karıştırma altında B tamponu ile 3 x 15 dakikalık yıkamalar gerçekleştirin.
  2. Bezleri B tamponu ile birlikte ikincil antikor ile birlikte 4 oC'de dönme altında 2 saat boyunca bir florofora aktarın (ikincil antikor Alexa flor 568 Invitrogen 1:3000 kullanıldı).
    1. İkincil antikorun ışıktan korunması için tüpü alüminyum kağıt folyo ile örtün.
  3. 1 mL Tampon B ile rotasyon sırasında oda sıcaklığında 2 x 15 dakikalık yıkamalar gerçekleştirin.
  4. Sytox (2 μL 5 mM stok alın ve 1 mL Tampon B'de çözün) veya Hoechst (10 mg/mL stokun 1 μL'sinde alın ve 1 mL Tampon B'de çözün) gibi bir DNA işaretleyicisi ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rotasyonla inkübte edin.
  5. B Tamponu ile bir yıkama yapın ve PBS ile bir kez, her biri oda sıcaklığında dönerken 10 dakika süren yıkama.
    NOT: Işıktan korumayı unutmayın.

10. Görüntüleme

  1. Tükürük bezlerini bir kaydırağa monte edin, kapaklı bir havuz haline getirin.
  2. Tükürük bezlerini havuzun ortasına koyun ve viskoz sıvıyı her yere uzatan kabarcıkların oluşumunu önlemek için AF1 citifluor ile örtün. Sonra tüm tarafları açık oje ile kapatın.
  3. Floresan veya konfokal mikroskop altında gözlemleyin. Numune aynı gün gözlemlenmeyecekse, 4 °C'de ışıktan uzak durun.
  4. Tüm grafikleri ve istatistiksel analizleri oluşturmak için GraphPad Prism 6'yı kullanın.
  5. Kruskal-Wallis testini kullanarak tükürük bezlerindeki HP1a dağılımından elde edilen verileri analiz edin. İstatistiksel önem (p < 0.05*, < 0.01 **, < 0.001***, < 0.0001**** olarak belirlendi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Drosophila tükürük bezlerinde HP1a immünostaininginingin temsili sonuçları Şekil 1'degösterilmiştir. Olumlu bir sonuç, bir odak noktasını gözlemlemektir (Şekil 1a) (heterokromatik agrega veya yoğuşma). Negatif sonuç sinyal veya dağınık sinyal değildir. Bazen çift noktalı, yani çift noktalı (Şekil 1c) çift sinyal gözlenebilir, ancak genellikle daha küçük miktarlarda meydana gelir.

Veri analizi, HP1a'nın farklı mutant arka planlardaki dağılımını karşılaştırarak çubuk grafikler olarak temsil edilebilir. Örneğin, Şekil 2'de vahşi tip çekirdeklerin% 98'inin bir odak noktasının dağılımını ve çekirdeğin% 2'sinin iki odak noktası sunduğunu, mutantta ise oranın değiştiğini ve iki odak varlığının% 40'a arttığını görebiliriz.

Şekil 3, Drosophila tükürük bezlerinde temsili H3k9me3 immünostaining sonuçlarını göstermektedir. HP1a immünostainingine benzeyen bir odak noktasını(Şekil 3b)gözlemleyebiliriz (heterokromatik agrega veya yoğuşma). Vahşi tip suşlarda nadir durumlarda çift veya üçlü sinyal (Şekil 3c) görülebilir.

Figure 1
Şekil 1. Vahşi tipten (wt) HP1a antikor ile tükürük bezi immünostaining gelen temsili konfokal mikroskopi görüntüsü. a)DNA (siyan sinyali), HP1a (macenta sinyali) ve birleştirme ölçek çubuğu 100 μm. HP1a için immünostainingde, odak noktası olan bir çekirdek beyaz bir ok ve noktalı çizgi kutusuna sahip iki odaklı bir çekirdek ile işaretlenir. Sağ sütun, 5 μm ölçekçubuğuna sahip tek bir çekirdeğin büyütülmüş görüntüsünü gösterir. c) iki odak dağılımı. Her iki çekirdek de beyaz kesik çizgi ile işaretlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. Örnekler,HP1a immünostaining'in çekirdek odak dağılımının sayılmasından kaynaklanmıştır. İlk çubuk, Şekil 1'deolduğu gibi vahşi tip çekirdeklerin (wt) sayımını temsil eder. İkinci çubuk, bu dağılımı etkileyen bir mutant suşunu temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. Vahşi tipten (wt) H3K9me3 antikoru ile tükürük bezi immünostaining gelen temsili konfokal mikroskopi görüntüsü. a)DNA (siyan sinyali), H3K9me3 (macenta sinyali) ve birleştirme ölçek çubuğu 100 μm. H3K9me3 için immünostaining.Sağ sütun, 5 μm ölçekçubuğuna sahip tek bir çekirdeğin büyütülmüş görüntüsünü gösterir. c) üç odak dağılımı. Her iki çekirdek de beyaz kesik çizgi ile işaretlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ökaryotik organizmaların hücresel işlevi, kromatin ile farklı proteinler ve RNA dahil olmak üzere çeşitli moleküller arasındaki etkileşimlerle desteklenen çekirdek içindeki 3D yapıyı tanımlayabilir. Son üç yılda, heterokromatin de dahil olmak üzere alaka düzeyi olan biyolojik kondensatlar, aktif ve baskıcı kromatin 16 , 17,18'inayrı nükleer mekansal organizasyonuna teşvik eden faz ayrımının belirlenmesinde temel bir rol üstlenmiştir.

Heterokromatin hücre fonksiyonlarını ve kimliğini korumak için gereklidir. Daha önce bu yoğun bölgelerin yazıya dökülemediği düşünülüyordu. Bununla birlikte, artık daha güçlü teknolojilere sahip olduğumuza göre, heterokromatin sadece yazıya dökülmediğini, aynı zamanda çekirdeğin iskelesini korumak için temel bir süreç olduğunu ve gelişimsel veya patolojik süreçlere duyarlı olduğunu görebiliriz12,19. Ayrıca, perisantrik heterokromatin'e gömülü bazı genlerin düzgün çalışması için heterokromatik bir ortama ihtiyacı vardır. HP1a mutasyonları, ilk keşfedilen19olan ışık ve yuvarlanmış genlerin ekspresyonunun azaltılması . Bu genler organizmanın hayatta kalması için gereklidir ve heterokromatin bloklarında bulunur. Sonuç olarak, susturma yeteneğine rağmen, bu tuhaf genom bileşeni çok dinamik olma potansiyeline sahiptir20. Çeşitli biyolojik bağlamlar tarafından kontrol edilebilen kromatin bağlı ve dağınık tipler arasındaki karmaşık dengede, HP1a gibi heterokromatin ilişkili proteinler de mevcuttur. Ayrıca son zamanlarda faz ayırma özelliklerinin heterokromatin kondensatlarının montajı ile gösterildiği öne sürüldü21,22.

Yazarların drosophila tükürük bezi çekirdeğinin farklı ve bazen daha basit protokolleri kullanarak tamamen monte immünostainingini gerçekleştirdikleri bir dizi makale vardır23,24. Bu durumda, ilk olarak C. elegans25'te açıklanan ve daha sonra Drosophila tükürük bezlerinde26 , 27,28,29 birkaç grup tarafından kullanılan bir protokolü uyarladık ve konfokal mikroskopi ve mutant organizmaların kullanımıyla birleştirdik. Bu protokol ayrıca XPD, XPB ve TBP27gibi transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere farklı protein türlerinin görselleştirilmesine izin verir, aynı zamanda HP1a gibi heterokromatin bağlı proteinler ve bu dokuda geniş kullanım için bir protokol olarak konumlandıran H3K9me3 gibi histone işaretleri. Ayrıca dokunun politen kromozom bantlamayı etkilemeden bir ara adımda depolanabilmesi avantajına sahiptir.

Bu protokol, HP1a proteinini görüntülemek için belirli bir antikorun kullanılması nedeniyle güvenilir ve uygun maliyetlidir. Bu protokoldeki kritik adım, yıkamalar sırasında bezleri kaybetmekten ve dokunun dibe vurmasını beklemekten kaçınmaktır. Tükürük bezlerini kullanmanın avantajı, hücrenin mekanik bir bozulmasını gerektiren ve kromatinlere zarar verebilen politen kromozom tekniğinin aksine, çekirdeğin ve konformasyonunun 3D görünümünün kolayca elde edilebilmesidir. Bu protokol yapılırken yıkama adımları sırasında özel özen gösterilmelidir. Dikkatli bir şekilde yapılmazsa, doku kırılır ve yüksek kaliteli görüntüler elde etmek mümkün olmazdı.

RNA'nın gözlenen bölgelere veya proteinlere bağlanmamasının önemini değerlendirmek için, Tampon C (EDTA'sız Tampon B) ile bir yıkama eklemek ve 100 μM RNase eklemek gerekir. Bu yıkama daha önce açıklandığı gibi 37 °C'de 1 saat boyunca yapılmalıdır. Yıkama, DNA'yı gözlemlemek için moleküllerin eklendiği adımdan önce yapılmalıdır (9.3 ve 9.4 adımları arasında).

Konfokal mikroskopi, heterokromatin kondensatları25,30sorularını ele almak için çok yeni bir metodoloji gibi görünmeyebilir, ancak Drosophila çekirdeğindeki HP1a proteininin delokalizasyonunu tanımlamak son derece yararlı olmuştur, bu da kromatin yapısında diğer tekniklerle daha ayrıntılı olarak değerlendirilebilecek ciddi sorunlar olduğunu göstermektedir. Sınırlamasına rağmen, heterokromatin kondensat montajını, kontrolünü ve fonksiyonlarını modüle eden biyolojik aktiviteyi netleştirmek için yeni teknikler uygulamak için ilk yaklaşım olarak yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile birlikte kullanılabilir31. Heterokromatin, RNA ve heterokromatin ilişkili proteinler arasındaki moleküler ve biyofiziksel etkileşimlere odaklanan bu yeni metodolojilerden bazıları, heterokromatin kondensatlarını test etmek için bu yöntem kümesinden toplanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Marco Antonio Rosales Vega ve Abel Segura'ya bazı konfokal görüntüleri aldıkları için, medya hazırlığı için Carmen Muñoz'a ve mikroskopların kullanımı konusunda tavsiyeler için LMNA'dan Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui ve Dr. Chris Wood'a teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 11351904 brand not critical
16% formaldehyde Thermo Scientific 28908
AF1 Citifluor Ted pella 19470 25 mL
BSA, Molecular Biology Grade Roche 10735078001 brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free
protease inhibitors		 Merck 5892953001
Coverslip Corning CLS285022-200EA 22x22, brand not critical
DTT Sigma d9779 brand not critical
EDTA Sigma E5134 brand not critical
EGTA brand not critical
Glass slide Gold seal 3011 brand not critical
H3BO3 Baker 0084-01 brand not critical
H3K9me3 Abcam 8889
HP1a Hybridoma Bank C1A9 Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl Baker 3040-01 brand not critical
Methanol Baker 9070-03 brand not critical
NaCl Sigma 71376 brand not critical
NaOH brand not critical
PIPES brand not critical
Rotator Thermo Scientific 13-687-12Q  Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C Eppendorf 13527550 SmartBlock 1.5 mL
Tris Milipore 648311 brand not critical
Triton X-100 Sigma T8787 100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710 25 mL, brand not critical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).
  2. Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
  3. Kasinathan, B., et al. Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila. Elife. , 1-31 (2020).
  4. Lifschytz, E., Hareven, D. Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).
  5. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  6. Lee, Y. C. G., et al. Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin. PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).
  7. Koryakov, D. E., et al. The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).
  8. Cao, R., et al. Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing. Science. 298 (5595), 1039 (2002).
  9. Hines, K. A., et al. Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading. Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).
  10. Elgin, S. C. R., Reuter, G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).
  11. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  12. Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription. BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).
  13. Tennessen, J. M., Thummel, C. S. Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila. Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).
  14. Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling. Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).
  15. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).
  16. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  17. Larson, A. G., Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).
  18. Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α. Methods in Enzymology. , (2018).
  19. Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).
  20. Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster. Trends in Genetics. , (2019).
  21. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  22. Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
  23. Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes. Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).
  24. Kolesnikova, T. D., et al. Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene. Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).
  25. Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).
  26. Messina, G., et al. Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization. Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).
  27. Aguilar-Fuentes, J., et al. p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model. PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).
  28. Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes. Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).
  29. Farkaš, R., Mechler, B. M. The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response. Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).
  30. Zhang, P., Spradling, A. C. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).
  31. Stormo, B. M., Fox, D. T. Polyteny: still a giant player in chromosome research. Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).

Tags

Biyoloji Sayı 174 Drosophila melanogaster,heterokromatin tükürük bezleri kromatin immünostaining HP1a
<em>Drosophila</em> Tükürük Bezlerinde Heterokromatin İlişkili Proteinlerin Görselleştirilmesi için İmmünofluoresan Boyama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meyer-Nava, S., Zurita, M.,… More

Meyer-Nava, S., Zurita, M., Valadez-Graham, V. Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands. J. Vis. Exp. (174), e62408, doi:10.3791/62408 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter