Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تلطيخ immunofluorescent لتصور البروتينات المرتبطة Heterochromatin في الغدد اللعابية Drosophila

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62408
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى تصور مجاميع الهتيروماتين في خلايا البوليتين Drosophila.

Abstract

يمكن أن يكون تصور مجاميع الهتيروماتين عن طريق التصبغ المناعي أمرا صعبا. يتم الحفاظ على العديد من مكونات الثدييات من الكروماتين في Drosophila melanogaster. لذلك، وهو نموذج ممتاز لدراسة تشكيل heterochromatin والصيانة. الخلايا المتعددة، مثل تلك الموجودة في الغدد اللعابية من يرقات نجمة النستار الثالثة D. melanogaster، توفر أداة ممتازة لمراقبة الكروماتين تضخيم ما يقرب من ألف مرة، وسمحت للباحثين لدراسة التغيرات في توزيع التركروماتين في النواة. على الرغم من أن مراقبة مكونات هيتيركروماتين يمكن أن تتم مباشرة في مستحضرات كروموسوم البوليتين ، يمكن تغيير توطين بعض البروتينات من خلال شدة العلاج. لذلك ، فإن التصور المباشر للتركروماتين في الخلايا يكمل هذا النوع من الدراسة. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف تقنيات التصبغ المناعي المستخدمة لهذا النسيج، واستخدام الأجسام المضادة الفلورية الثانوية، والمجهر البؤري لمراقبة هذه المجاميع الهتيروماتين بمزيد من الدقة والتفاصيل.

Introduction

منذ الدراسات المبكرة لإميل هيتز1، يعتبر هيتيركروماتين منظما مهما للعمليات الخلوية مثل التعبير الجيني ، والفصل الميوتي والميتوتيك للكروموسومات ، والحفاظ على استقرار الجينوم2و3و4.

وينقسم الهتيروماتين أساسا إلى نوعين: هيتيركروماتين التأسيسية التي تحدد بشكل مميز تسلسل المتكررة، والعناصر القابلة للانتقال التي توجد في مواقع كروموسوم محددة مثل التيلوميرات والقنطورات. هذا النوع من heterochromatin هو تعريف أساسا اللاجينية من قبل علامات الهستون محددة مثل دي أو ثلاثي ميثيل ليسين 9 من الهستون H3 (H3K9me3) وربط بروتين هيتيروكروماتين 1a (HP1a)5,6. من ناحية أخرى، لغات heterochromatin الكلية من خلال ذراعي الكروموسوم ويتكون أساسا من الجينات صامتة تنمويا7،8. وقد كشف عن التئاس المناعة من كتل heterochromatin في خلايا ميتافيزي، أو مراقبة المجاميع heterochromatin في الخلايا بين المراحل، الكثير من الضوء في فهم تشكيل ووظيفة المناطق غير لوني9.

وقد سمح استخدام Drosophila كنظام نموذجي لتطوير الأدوات الأساسية لدراسة الهتيروماتين دون استخدام المجهر الإلكتروني10. منذ وصف تأثير الموقف المتنوع واكتشاف البروتينات المرتبطة بالهيتوكروماتين ، مثل HP1a ، وتعديلات ما بعد الهستون بعد الترجمية ، طورت العديد من المجموعات العديد من التقنيات الكيميائية المناعية التي تسمح بتصور هذه المناطق غير اللونية10،11.

وتستند هذه التقنيات على استخدام أجسام مضادة محددة تتعرف على البروتينات المرتبطة بالهتيروماتين أو علامات الهستون. لكل نوع الخلية والأجسام المضادة، يجب تحديد شروط التثبيت والتهيئة تجريبيا. أيضا، قد تختلف الظروف إذا تم استخدام عمليات ميكانيكية إضافية مثل تقنيات السحق. في هذا البروتوكول، ونحن نصف استخدام الغدد اللعابية Drosophila لدراسة بؤر غير لونية. الغدد اللعابية لديها خلايا متعددة الأضلاع تحتوي على أكثر من 1000 نسخة من الجينوم ، مما يوفر رؤية مكبرة لمعظم ميزات الكروماتين ، باستثناء الحمض النووي للأقمار الصناعية وبعض المناطق غير اللونية التي تخضع للتكفير. ومع ذلك ، يتم تصور مناطق heterochromatin بسهولة في مستحضرات كروموسوم البوليتين ، ولكن تقنيات السحق قد تعطل في بعض الأحيان المجمعات المميزة المرتبطة بالكروماتين أو بنية الكروماتين. لذلك ، يمكن أن يتجاوز تحديد موقع المناعة للبروتينات في أنسجة الغدة اللعابية الكاملة هذه الآثار غير المرغوب فيها. لقد استخدمنا هذا البروتوكول للكشف عن العديد من البروتينات المقيدة بالكروماتين ، وأثبتنا أن هذا البروتوكول جنبا إلى جنب مع مخزونات Drosophila المتحولة يمكن استخدامه لدراسة اضطراب الهتيروماتين12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. زراعة يرقات النجوم الثالثة

  1. إعداد 1 لتر من وسائل الإعلام القياسية بإضافة 100 غرام من الخميرة، 100 غرام من السكر قصب كامل غير المكرر، 16 غرام من أجار، 10 مل من حمض البروبيونيك و 14 غرام من الجيلاتين. حل جميع المكونات باستثناء الخميرة في 800 مل من ماء الصنبور ومن ثم حل الخميرة. الأوتوكلاف على الفور لمدة 30 دقيقة.
    1. بعد ذلك، دع الوسائط تبرد إلى 60 درجة مئوية وأضف حمض البروبيونيك إلى التركيز النهائي بنسبة 0.01٪. دع الزجاجة تقف حتى يتم تشكيل الجيلاتين.
  2. لتحسين استزراع يرقات النجوم 3o ، قم أولا بجمع البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 5 و 10 أيام ووضع 50 (25 ذكرا و 25 أنثى) في زجاجة عنق واسعة من الوسائط القياسية.
  3. ضع الزجاجة مع الذباب في حاضنة درجة حرارة خاضعة للرقابة عند 25 درجة مئوية حتى يبلغ عدد البيض الموضوع 50 (حوالي 12 ساعة للسلالة البرية).
  4. بعد انتهاء فترة الحضانة، قم بإزالة البالغين ونقلهم إلى زجاجة جديدة لتكرار الإجراء. دع الأجنة تنمو عند 18 درجة مئوية لمدة 72 ساعة
    ملاحظة: لمزيد من المعلومات حول ظروف صيانة المخزون Drosophila، راجع تينيسين وThymmel13.

2. جمع اليرقات

  1. لجمع اليرقات اختيار اليرقات الهائمة التي لم يكن لديك القرصنة everted. بعد انعكاس القرصنة ، تدخل اليرقة المرحلة الإعدادية ، مع الاحتفاظ بكروموسومات البوليتين الممتازة المناسبة للتحليل. فقط بعد 12 ساعة تبدأ خلايا الغدة اللعابية في الاستعداد لموت الخلاياالمبرمجة 14،15.
  2. خذ يرقات نجمة 15 درجة 3 ووضعها في كوب ساعة لغسلها. ثم نقلها إلى محلول ملحي الجليد الباردة أو برنامج تلفزيوني (1x PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, ضبط درجة الحموضة إلى 7.4).
  3. تشريح 15 إلى 30 زوجا من الغدد اللعابية (أو أكبر عدد ممكن في 30 دقيقة) في برنامج تلفزيوني الباردة مع مثبطات البروتيز تحت المجهر مجسمة. نقل الغدد اللعابية إلى أنبوب 1.5 مل مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
  4. غسل مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى مثبطات بروتياز. انتظر حتى يصل النسيج إلى أسفل الأنبوب.
  5. بعد الغسيل، قم بإزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة 1000 ميكرولتر. الحرص على عدم لمس الأنسجة.
    1. بدلا من ذلك، تشريح الغدد اللعابية في 5 مل من برنامج تلفزيوني للقضاء على الحاجة إلى هذه الخطوة الغسيل والمضي قدما إلى الخطوة 3 عن طريق نقل الغدد اللعابية إلى 0.5 مل من العازلة إصلاح Ruvkun المذكورة أدناه.

3. تثبيت أنسجة الغدة اللعابية

  1. بعد إزالة برنامج تلفزيوني من الخطوة الأخيرة، إضافة مباشرة 0.5 مل من 1x Ruvkun تحديد العازلة، مع 50٪ الميثانول (إضافة 0.5 مل من الميثانول) و 2٪ الفورمالديهايد.
    ملاحظة: 2x روفكون الحل هو 160 MM KCl، 40 mM NaCl، 20 M EGTA، 30 mM PIPES في pH 7.4.
  2. حضانة لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية مع تناوب معتدل.

4. غسل أنسجة الغدة اللعابية

  1. نفذ غسل دوران واحد لمدة 5 دقائق مع 1 مل من مخزن Tris/Triton المؤقت (100 mM Tris pH 7.4 و 1٪ Triton X-100 و 1 mM EDTA).
    ملاحظة: انتظر حتى يصل النسيج إلى أسفل الأنبوب.

5. البيرميلات

  1. احتضان الغدد اللعابية في 1 مل من تريس / تريتون X-100 (نفس أعلاه). بالنسبة لبعض البروتينات قد يكون من الضروري إضافة 1٪ β ميركابتوثانول.
  2. حضانة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف (300 دورة في الدقيقة).

6. خطوة الحفظ (اختياري)

ملاحظة: إذا لم يتم الشروع فورا في الحضانة مع الأجسام المضادة، حافظ على النسيج كما يلي.

  1. اغسل مع 1 مل من المخزن المؤقت BO3 (0.01 M H3BO3 درجة الحموضة 9.2 + 0.01 M NaOH) ثم احتضن في BO3/10 mM DTT عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف (300 دورة في الدقيقة) لمدة 15 دقيقة.
  2. في نهاية فترة الحضانة، قم بإجراء غسل مع 1 مل من المخزن المؤقت BO3 وحده.
    ملاحظة: انتظر حتى يصل النسيج إلى أسفل الأنبوب.
  3. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني. الحفاظ على الأنسجة في هذا الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة ومن ثم المضي قدما في الخطوة التالية. هذه الخطوة مفيدة بشكل خاص عند العمل مع سلالات متحولة مختلفة قد تمثل دورة حياة متأخرة ، لذلك يمكن إجراء التنميتين المناعي في نفس الوقت مع عناصر التحكم.

7. حجب الأنسجة

  1. احتضان الغدد اللعابية في 1 مل من العازلة B (برنامج تلفزيوني + 0.1٪ BSA + 0.5٪ تريتون X-100 + 1 mM EDTA) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع التناوب.

8. التثبيط المناعي

  1. إزالة كافة المخزن المؤقت B وإضافة المخزن المؤقت A (PBS + 0.1٪ BSA) بالإضافة إلى الأجسام المضادة ذات الفائدة.
    ملاحظة: نستخدم HP1a C1A9c (الأجسام المضادة المركزة) من Hybridoma Bank حتى الساعة 1:3000. عند استخدام C1A9s (supernatant) حاولنا من 1:100 إلى 1:500 التخفيف وأي تخفيف بين هذه الرتبة يعمل بشكل جيد) بين عشية وضحاها في 4 OC مع التناوب. عند هذه النقطة من المهم أن الهز لا يثير فقاعات التي قد تضر الأجسام المضادة.

9. الغسيل المناعي

  1. قم بإجراء عمليات غسل لمدة 3 × 15 دقيقة مع العازلة B تحت التحريك في درجة حرارة الغرفة باستخدام 1 مل في كل مرة.
  2. نقل الغدد إلى العازلة B جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة الثانوية إلى جانب الفلوروفور لمدة 2 ساعة تحت دوران في 4 oC (تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور 568 Invitrogen 1:3000).
    1. قم بتغطية الأنبوب بورق الألومنيوم لحماية الجسم المضاد الثانوي من الضوء.
  3. نفذ يغسل 2 × 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء الدوران مع 1 مل من العازلة B.
  4. احتضان مع علامة الحمض النووي مثل Sytox (اتخاذ 2 ميكرولتر من المخزون 5 mM وتذوب في 1 مل من العازلة B) أو Hoechst (اتخاذ 1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل المخزون وتذوب في 1 مل من العازلة B) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التناوب.
  5. نفذ غسيلا واحدا مع Buffer B ومرة واحدة مع PBS ، يستمر كل غسل لمدة 10 دقائق أثناء الدوران في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تذكر لحمايته من الضوء.

10. التصوير

  1. جبل الغدد اللعابية على الشريحة، مما يجعل بركة مع غطاء.
  2. وضع الغدد اللعابية في منتصف حمام السباحة وتغطي مع AF1 citifluor لتجنب تشكيل فقاعات تمديد السائل لزج في جميع أنحاء المكان. ثم ختم جميع الجوانب مع طلاء الأظافر واضحة.
  3. مراقبة تحت المجهر مضان أو confocal. إذا كانت العينة لن يتم ملاحظتها في نفس اليوم، فخزنها بعيدا عن الضوء عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  4. استخدم GraphPad Prism 6 لإنشاء جميع الرسوم البيانية والتحليلات الإحصائية.
  5. تحليل البيانات من توزيع HP1a في الغدد اللعابية باستخدام اختبار كروسكال واليس. تم تعيين الأهمية الإحصائية في (ص < 0.05*، < 0.01 **، < 0.001***، < 0.0001****).)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تظهر النتائج التمثيلية ل HP1a المناعية في الغدد اللعابية Drosophila في الشكل 1. والنتيجة الإيجابية هي ملاحظة نقطة محورية واحدة(الشكل 1a)(تجميع أو مكثفات غير لونية). والنتيجة السلبية هي عدم وجود إشارة أو إشارة مشتتة. في بعض الأحيان يمكن ملاحظة إشارة مزدوجة ، أي بنقطة مزدوجة(الشكل 1c)، ولكنها تحدث عادة بكميات أصغر.

يمكن تمثيل تحليل البيانات كرسم بياني شريطي، مقارنة توزيع HP1a ضمن خلفيات متحولة مختلفة. على سبيل المثال، في الشكل 2 يمكننا أن نرى أن 98٪ من نواة النوع البري تقدم توزيع نقطة محورية واحدة و 2٪ من النواة تقدم بؤرتين، في حين أن في المتحولة، تتغير النسبة، ويزيد وجود بؤرتين إلى 40٪.

يظهر الشكل 3 نتائج التمثيل H3k9me3 المناعية في الغدد اللعابية Drosophila. يمكننا ملاحظة نقطة محورية واحدة(الشكل 3ب)تشبه الاحتواء المناعي HP1a ، (تجميع لوني أو مكثفات). ويمكن رؤية إشارة مزدوجة أو ثلاثية(الشكل 3C)في مناسبات نادرة في سلالات نوع البرية.

Figure 1
الشكل 1. صورة المجهر الكونفوجكال التمثيلية من الالتقاوين المناعي للغدد اللعابية مع الأجسام المضادة HP1a من النوع البري (wt). أ)الحمض النووي (إشارة سماوية)، HP1a (إشارة أرجواني)، ودمج شريط مقياس 100 ميكرومتر. في الاحتواء المناعي لHP1a ، يتم وضع علامة على نواة ذات نقطة محورية بسهم أبيض ونواة مع بؤرتين مع مربع خط منقط. يظهر العمود الأيمن صورة مكبرة لنواة واحدة مع شريط مقياس من 5 ميكرومتر ب) التوزيع البؤري. ج) توزيع بؤرتين. تم وضع علامة على كلا النواة بخط أبيض متقطع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. تنتج الأمثلة عن عد توزيع بؤر النواة من الاحتواء المناعيHP1a. يمثل الشريط الأول عد النوى البرية (wt) ، كما هو الحال في الشكل 1. يمثل الشريط الثاني سلالة متحولة تؤثر على هذا التوزيع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. صورة المجهر الكونفوجكال التمثيلية من الالتقاوين المناعي للغدد اللعابية مع الأجسام المضادة H3K9me3 من النوع البري (wt). أ)الحمض النووي (إشارة سماوية)، H3K9me3 (إشارة أرجوانية) ودمج شريط مقياس 100 ميكرومتر. في الاحتواء المناعي لH3K9me3.The العمود الأيمن يظهر صورة مكبرة من نواة واحدة مع شريط مقياس من 5 ميكرومتر ب)نواة مع توزيع بؤري. ج) توزيع بؤر ثلاثة. تم وضع علامة على كلا النواة بخط أبيض متقطع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن للوظيفة الخلوية للكائنات الحية النواة تحديد الهيكل ثلاثي الأبعاد داخل النواة ، والذي تدعمه التفاعلات بين البروتينات المختلفة مع الكروماتين والجزيئات المختلفة بما في ذلك الحمض النووي الريبي. في السنوات الثلاث الماضية، والمكثفات البيولوجية التي لها أهمية، بما في ذلك هيتيركروماتين، وقد اتخذت دورا أساسيا في تحديد فصل المرحلة تعزيز التنظيم المكاني النووي المتميز من الكروماتين النشطة والقمعية 16،17،18.

هيتيركروماتين ضروري للحفاظ على وظائف الخلية وهويتها. في السابق كان يعتقد أن هذه المناطق الكثيفة لم يتم نسخها. ومع ذلك ، الآن بعد أن أصبح لدينا تقنيات أكثر قوة ، يمكننا أن نرى أن heterochromatin ليس فقط منسوخا ولكن أيضا عملية أساسية للحفاظ على سقالة النواة وحساسة للعمليات التنموية أو المرضية12،19. الى جانب ذلك، بعض الجينات جزءا لا يتجزأ من heterochromatin pericentric تحتاج إلى بيئة غير لونية لتعمل بشكل صحيح. طفرات HP1a تقلل من التعبير عن الجينات الخفيفة والمتدحرجة ، والتي كانت أول من تم اكتشافه19. هذه الجينات ضرورية لبقاء الكائن الحي وتوجد في كتل هيتيركروماتين. ونتيجة لذلك ، على الرغم من قدرته على الحث على إسكات ، وهذا العنصر الجينوم غريبة لديها القدرة على أن تكون ديناميكية جدا20. في توازن معقد بين أنواع الكروماتين المرتبطة والناشرة التي يمكن التحكم فيها من خلال سياقات بيولوجية مختلفة ، توجد أيضا بروتينات مرتبطة بالهتيروماتين مثل HP1a. كما اقترح مؤخرا أن تظهر خصائص المرحلة فصل من قبل تجميع المكثفات heterochromatin21،22.

هناك عدد من الأوراق التي قام فيها المؤلفون باحتواء مناعة كاملة من نواة الغدة اللعابية Drosophila باستخدام بروتوكولات مختلفة وأبسط في بعض الأحيان23،24. في هذه الحالة قمنا بتكييف بروتوكول وصف لأول مرة في C. elegans25، واستخدمنا لاحقا في الغدد اللعابية Drosophila من قبل عدة مجموعات26،27،28،29 ودمجها مع استخدام المجهر الكونفوجكال والكائنات المتحولة. يسمح هذا البروتوكول أيضا بتصور أنواع مختلفة من البروتينات ، بما في ذلك عوامل النسخ مثل XPD و XPB و TBP27، ولكن أيضا البروتينات المقيدة بالهتيروماتين مثل HP1a وعلامات الهستون مثل H3K9me3 ، والتي يضعها كبروتوكول للاستخدام الواسع في هذا النسيج. كما أن لديها ميزة أن الأنسجة يمكن تخزينها في خطوة وسيطة دون التأثير على النطاقات الكروموسوم البوليتين.

هذا البروتوكول موثوق وفعال من حيث التكلفة بسبب استخدام الأجسام المضادة محددة لعرض البروتين HP1a. الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هو تجنب فقدان الغدد أثناء يغسل وانتظار الأنسجة إلى أسفل. ميزة استخدام الغدد اللعابية هي أنه يمكن الحصول على رؤية ثلاثية الأبعاد للنواة وتتشكل بسهولة ، على النقيض من تقنية كروموسوم البوليتين التي تتطلب اضطرابا ميكانيكيا في الخلية ويمكن أن تلحق الضرر بالكروماتين. أثناء تنفيذ هذا البروتوكول، يجب توخي الحذر الخاص أثناء خطوات الغسيل. إذا لم يتم تنفيذها بعناية ، فإن الأنسجة ستنكسر ، ولن يكون من الممكن الحصول على صور عالية الجودة.

لتقييم أهمية عدم ربط الحمض النووي الريبي للمناطق أو البروتينات التي يتم ملاحظتها ، من الضروري إضافة غسل مع العازلة C (العازلة B بدون EDTA) وإضافة 100 ميكرومتر من RNase. يجب أن يتم هذا الغسل لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية كما هو موضح سابقا. يجب أن يتم الغسيل قبل الخطوة التي تضاف فيها الجزيئات لمراقبة الحمض النووي (بين الخطوتين 9.3 و 9.4).

قد لا يبدو المجهر الكونفوكوكال وكأنه منهجية جديدة جدا لمعالجة أسئلة المكثفات heterochromatin25،30، ولكن كان من المفيد للغاية تحديد إزالة توطين بروتين HP1a في نواة Drosophila ، مما يشير إلى مشاكل حادة في بنية الكروماتين التي يمكن تقييمها باستخدام تقنيات أخرى بشكل أكثر شمولا. على الرغم من محدوديته، فإنه يمكن استخدامه في تركيبة مع المجهر عالية الدقة كنهج أول لتطبيق تقنيات جديدة لتوضيح النشاط البيولوجي الذي يعدل تجميع مكثفات هيتيركروماتين، والسيطرة، ووظائف31. يتم جمع بعض هذه المنهجيات الجديدة التي تركز على التفاعلات الجزيئية والبيوفيزيائية بين الهتيروماتين والحمرنا الريبي والبروتينات المرتبطة بالهيتوكروماتين من هذه المجموعة من الطرق لاختبار المكثفات هيتيركروماتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgments

نشكر ماركو أنطونيو روزاليس فيغا وهابيل سيغورا على التقاط بعض الصور الكونفوكوكال، وكارمن مونيوز لإعداد وسائل الإعلام، والدكتور أرتورو بيمنتل، .C أندريس ساراليغوي، والدكتور كريس وود من LMNA للحصول على المشورة بشأن استخدام المجاهر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 11351904 brand not critical
16% formaldehyde Thermo Scientific 28908
AF1 Citifluor Ted pella 19470 25 mL
BSA, Molecular Biology Grade Roche 10735078001 brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free
protease inhibitors		 Merck 5892953001
Coverslip Corning CLS285022-200EA 22x22, brand not critical
DTT Sigma d9779 brand not critical
EDTA Sigma E5134 brand not critical
EGTA brand not critical
Glass slide Gold seal 3011 brand not critical
H3BO3 Baker 0084-01 brand not critical
H3K9me3 Abcam 8889
HP1a Hybridoma Bank C1A9 Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl Baker 3040-01 brand not critical
Methanol Baker 9070-03 brand not critical
NaCl Sigma 71376 brand not critical
NaOH brand not critical
PIPES brand not critical
Rotator Thermo Scientific 13-687-12Q  Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C Eppendorf 13527550 SmartBlock 1.5 mL
Tris Milipore 648311 brand not critical
Triton X-100 Sigma T8787 100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710 25 mL, brand not critical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).
  2. Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
  3. Kasinathan, B., et al. Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila. Elife. , 1-31 (2020).
  4. Lifschytz, E., Hareven, D. Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).
  5. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  6. Lee, Y. C. G., et al. Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin. PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).
  7. Koryakov, D. E., et al. The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).
  8. Cao, R., et al. Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing. Science. 298 (5595), 1039 (2002).
  9. Hines, K. A., et al. Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading. Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).
  10. Elgin, S. C. R., Reuter, G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).
  11. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  12. Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription. BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).
  13. Tennessen, J. M., Thummel, C. S. Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila. Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).
  14. Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling. Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).
  15. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).
  16. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  17. Larson, A. G., Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).
  18. Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α. Methods in Enzymology. , (2018).
  19. Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).
  20. Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster. Trends in Genetics. , (2019).
  21. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  22. Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
  23. Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes. Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).
  24. Kolesnikova, T. D., et al. Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene. Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).
  25. Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).
  26. Messina, G., et al. Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization. Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).
  27. Aguilar-Fuentes, J., et al. p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model. PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).
  28. Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes. Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).
  29. Farkaš, R., Mechler, B. M. The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response. Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).
  30. Zhang, P., Spradling, A. C. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).
  31. Stormo, B. M., Fox, D. T. Polyteny: still a giant player in chromosome research. Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).

Tags

علم الأحياء، العدد 174، Drosophila الميلانوغاستر، هيتيركروماتين، الغدد اللعابية، الكروماتين، التصبغ المناعي، HP1a
تلطيخ immunofluorescent لتصور البروتينات المرتبطة Heterochromatin في الغدد <em>اللعابية Drosophila</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meyer-Nava, S., Zurita, M.,… More

Meyer-Nava, S., Zurita, M., Valadez-Graham, V. Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands. J. Vis. Exp. (174), e62408, doi:10.3791/62408 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter