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Biology

Coloration immunofluorescente pour la visualisation des protéines associées à l’hétérochromatine dans les glandes salivaires de la drosophile

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62408
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

Ce protocole vise à visualiser les agrégats d’hétérochromatine dans les cellules de polytène de drosophile.

Abstract

La visualisation des agrégats d’hétérochromatine par immunostaining peut être provocante. De nombreux composants mammifères de la chromatine sont conservés chez Drosophila melanogaster. Par conséquent, c’est un excellent modèle pour étudier la formation et l’entretien de l’hétérochromatine. Les cellules polyténisées, telles que celles trouvées dans les glandes salivaires des larves de D. melanogaster du troisième stade, fournissent un excellent outil pour observer la chromatine amplifiée près de mille fois et ont permis aux chercheurs d’étudier les changements dans la distribution de l’hétérochromatine dans le noyau. Bien que l’observation des composants de l’hétérochromatine puisse être effectuée directement dans des préparations chromosomiques polytènes, la localisation de certaines protéines peut être modifiée par la gravité du traitement. Par conséquent, la visualisation directe de l’hétérochromatine dans les cellules complète ce type d’étude. Dans ce protocole, nous décrivons les techniques immunostaining utilisées pour ce tissu, l’utilisation des anticorps fluorescents secondaires, et la microscopie confocale d’observer ces agrégats d’hétérochromatine avec une plus grande précision et détail.

Introduction

Depuis les premières études d’Emil Heitz1,l’hétérochromatine a été considérée comme un régulateur important des processus cellulaires tels que l’expression des gènes, la séparation méiotique et mitotique des chromosomes et le maintien de la stabilité du génome2,3,4.

L’hétérochromatine est principalement divisée en deux types: l’hétérochromatine constitutive qui définit de manière caractéristique les séquences répétitives, et les éléments transposables qui sont présents à des sites chromosomiques spécifiques tels que les télomères et les centromères. Ce type d’hétérochromatine est principalement défini épigénétiquement par des marques d’histones spécifiques telles que la di ou tri-méthylation de la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9me3) et la liaison de la protéine hétérochromatine 1a (HP1a)5,6. D’autre part, l’hétérochromatine facultative se localise à travers les bras du chromosome et se compose principalement de gènes7,8. L’immunomarquage de blocs d’hétérochromatine dans les cellules métaphases, ou l’observation d’agrégats d’hétérochromatine dans les cellules interphases, a dévoilé beaucoup de lumière dans la compréhension de la formation et de la fonction des régions hétérochromatiques9.

L’utilisation de la drosophile comme système modèle a permis le développement d’outils essentiels pour étudier l’hétérochromatine sans l’utilisation de la microscopie électronique10. Depuis la description de la panachation de l’effet de position et la découverte de protéines associées à l’hétérochromatine, telles que HP1a, et de modifications post-traductionnelles des histones, de nombreux groupes ont développé plusieurs techniques immunohistochimiques qui permettent la visualisation de ces régions hétérochromatiques10,11.

Ces techniques sont basées sur l’utilisation d’anticorps spécifiques qui reconnaissent les protéines associées à l’hétérochromatine ou les marques d’histones. Pour chaque type de cellule et anticorps, les conditions de fixation et de perméabilisation doivent être déterminées empiriquement. En outre, les conditions peuvent varier si des procédés mécaniques supplémentaires tels que des techniques d’écrasement sont utilisés. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation des glandes salivaires de drosophile d’étudier les foyers hétérochromatiques. Les glandes salivaires ont des cellules polyténisées qui contiennent plus de 1 000 copies du génome, fournissant ainsi une vue amplifiée de la plupart des caractéristiques de la chromatine, à l’exception de l’ADN satellite et de certaines régions hétérochromatiques qui sont sous-répliquées. Néanmoins, les régions d’hétérochromatine sont facilement visualisées dans des préparations de chromosome de polytène, mais les techniques d’écrasement peuvent parfois perturber des complexes caractéristiques liés à la chromatine ou l’architecture de chromatine. Par conséquent, l’immunolocalisation des protéines dans le tissu entier des glandes salivaires peut dépasser ces effets indésirables. Nous avons utilisé ce protocole pour détecter plusieurs protéines liées à la chromatine, et nous avons démontré que ce protocole combiné avec des stocks de drosophile mutants peut être utilisé pour étudier la perturbation de l’hétérochromatine12.

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Protocol

1. Culture de larves du troisième stade

  1. Préparez 1 litre de milieux standards en ajoutant 100 g de levure, 100 g de sucre de canne entier non raffiné, 16 g de gélose, 10 mL d’acide propionique et 14 g de gélatine. Dissoudre tous les ingrédients sauf la levure dans 800 mL d’eau du robinet, puis dissoudre la levure. Autoclave immédiatement pendant 30 minutes.
    1. Ensuite, laissez le support refroidir à 60 °C et ajoutez l’acide propionique à une concentration finale de 0,01 %. Laissez la bouteille reposer jusqu’à ce que la gélatine soit formée.
  2. Pour optimiser la culture de larves de 3o stades, collectez d’abord des adultes âgés de 5 à 10 jours et placez-en 50 (25 mâles et 25 femelles) dans une large bouteille à col de milieux standard.
  3. Placez la bouteille avec les mouches dans un incubateur à température contrôlée à 25 °C jusqu’à ce que le nombre d’œufs pondus soit de 50 (environ 12 heures pour la souche de type sauvage).
  4. Une fois le temps d’incubation terminé, retirez les adultes et transférez-les dans une nouvelle bouteille pour répéter la procédure. Laisser les embryons grandir à 18 °C pendant 72 heures
    REMARQUE : Pour en savoir plus sur les conditions de maintien du stock de drosophiles, voir Tennessen &Thymmel13.

2. Collecte de larves

  1. Pour la collecte des larves, choisissez les larves errantes qui n’ont pas de spiracles everted. Après l’éversion des spiracles, la larve entre dans la phase prépupale, tout en conservant d’excellents chromosomes polytènes adaptés à l’analyse. Ce n’est qu’après 12 heures que les cellules de la glande salivaire commencent à se préparer à la mort cellulaire programmée14,15.
  2. Prenez quinze larves de 3° et mettez-les dans un verre de montre pour les laver. Puis les transférer dans une solution saline glacée ou PBS (1x PBS : NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mMNa2HPO4,2 mMKH2PO4,ajuster le pH à 7,4).
  3. Disséquer 15 à 30 paires de glandes salivaires (ou autant que possible en 30 minutes) dans du PBS froid avec des inhibiteurs de la protéase au microscope stéréoscopique. Transférer les glandes salivaires dans un tube de 1,5 mL avec du PBS glacé.
  4. Laver une fois avec 1 mL de PBS plus inhibiteurs de la protéase. Attendez que le tissu atteigne le fond du tube.
  5. Après le lavage, retirez le PBS avec une pipette de 1000 μL. Veillez à ne pas toucher le tissu.
    1. Alternativement, disséquer les glandes salivaires dans 5 mL de PBS pour éliminer le besoin de cette étape de lavage et passer à l’étape 3 en transférant les glandes salivaires à 0,5 mL du tampon de fixation Ruvkun décrit ci-dessous.

3. Fixation des tissus des glandes salivaires

  1. Après avoir retiré le PBS de la dernière étape, ajouter directement 0,5 mL de tampon de fixation Ruvkun 1x, avec 50% de méthanol (ajouter 0,5 mL de méthanol) et 2% de formaldéhyde.
    REMARQUE: 2x la solution de Ruvkun est 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES à pH 7,4.
  2. Incuber pendant 2 heures à 4 °C avec une rotation douce.

4. Lavage des tissus des glandes salivaires

  1. Effectuer un lavage par rotation de 5 minutes avec 1 mL de tampon Tris/Triton (100 mM Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 et 1 mM EDTA).
    REMARQUE: Attendez que le tissu atteigne le fond du tube.

5. Perméabilisation

  1. Incuber les glandes salivaires dans 1 mL de Tris/Triton X-100 (le même que ci-dessus). Pour certaines protéines, il peut être nécessaire d’ajouter 1% β-mercaptoéthanol.
  2. Incuber pendant 2 heures à 37 ° C avec une légère secousse (300 rpm).

6. Étape de préservation (facultatif)

REMARQUE: Si vous ne procèdez pas immédiatement à l’incubation avec l’anticorps, conservez le tissu comme suit.

  1. Laver avec 1 mL de tamponBO3 (0,01 MH3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) puis incuber dansBO3/10mM de TNT à 37°C avec de légères secousses (300 rpm) pendant 15 minutes.
  2. A la fin de la période d’incubation, effectuer un lavage avec 1 mL de tamponBO3 seul.
    REMARQUE: Attendez que le tissu atteigne le fond du tube.
  3. Ajouter 1 mL de PBS. Conservez le tissu de cette solution à 4 °C jusqu’à 72 heures, puis passez à l’étape suivante. Cette étape est particulièrement utile lorsque vous travaillez avec différentes souches mutantes qui peuvent présenter un cycle de vie retardé, de sorte que l’immunodétection peut être effectuée en même temps avec les contrôles.

7. Blocage des tissus

  1. Incuber les glandes salivaires dans 1 mL de tampon B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) pendant 2 heures à température ambiante avec rotation.

8. Immunomarquage

  1. Retirez tout le tampon B et ajoutez le tampon A (PBS + BSA 0,1%) plus l’anticorps d’intérêt.
    REMARQUE: Nous utilisons le HP1a C1A9c (anticorps concentré) de Hybridoma Bank jusqu’à 1:3000. Lors de l’utilisation des C1A9 (surnageant), nous avons essayé de 1:100 à une dilution de 1:500 et toute dilution entre ce rang fonctionne bien) pendant la nuit à 4 oC avec rotation. À ce stade, il est important que la secousse ne soulève pas de bulles qui pourraient endommager l’anticorps.

9. Lavage immunomarquage

  1. Effectuer des lavages de 3 x 15 minutes avec tampon B sous agitation à température ambiante en utilisant 1 mL à chaque fois.
  2. Transférer les glandes au tampon B avec l’anticorps secondaire couplé à un fluorophore pendant 2 heures sous rotation à 4 oC (l’anticorps secondaire Alexa fluor 568 Invitrogen a été utilisé 1:3000).
    1. Couvrez le tube avec une feuille de papier d’aluminium pour protéger l’anticorps secondaire de la lumière.
  3. Effectuer des lavages de 2 x 15 minutes à température ambiante en rotation avec 1 mL de tampon B.
  4. Incuber avec un marqueur d’ADN tel que Sytox (prendre 2 μL de stock de 5 mM et dissoudre dans 1 mL de tampon B) ou Hoechst (prendre 1 μL de stock de 10 mg/mL et dissoudre dans 1 mL de tampon B) pendant 10 minutes à température ambiante avec rotation.
  5. Effectuer un lavage avec le tampon B et une fois avec du PBS, chaque lavage durant 10 minutes tout en tournant à température ambiante.
    REMARQUE: N’oubliez pas de le protéger de la lumière.

10. Imagerie

  1. Montez les glandes salivaires sur un toboggan, en faisant une piscine avec une lamelle.
  2. Mettez les glandes salivaires au milieu de la piscine et couvrez de citifluor AF1 pour éviter la formation de bulles prolongeant le liquide visqueux partout. Ensuite, scellez tous les côtés avec du vernis à ongles clair.
  3. Observer sous un microscope à fluorescence ou confocal. Si l’échantillon ne doit pas être observé le même jour, conserver à l’abri de la lumière à 4 °C.
  4. Utilisez GraphPad Prism 6 pour générer tous les graphiques et analyses statistiques.
  5. Analyser les données de la distribution de HP1a dans les glandes salivaires en utilisant le test de Kruskal-Wallis. La signification statistique a été fixée à (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****).

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Representative Results

Les résultats représentatifs de l’immunomarquage de HP1a dans les glandes salivaires de la drosophile sont illustrés à la figure 1. Un résultat positif est d’observer un point focal(figure 1a)(agrégat ou condensat hétérochromatique). Un résultat négatif est l’absence de signal ou un signal dispersé. Parfois, un double signal peut être observé, c’est-à-dire avec un point double (Figure 1c), mais il se produit généralement en plus petites quantités.

L’analyse des données peut être représentée sous forme de graphiques à barres, en comparant la distribution de HP1a dans différents arrière-plans mutants. Par exemple, dans la figure 2, nous pouvons voir que 98% des noyaux de type sauvage présentent une distribution d’un point focal et 2% des noyaux présentent deux foyers, tandis que chez le mutant, la proportion change et la présence de deux foyers augmente à 40%.

La figure 3 montre des résultats représentatifs de l’immunomarquage H3k9me3 dans les glandes salivaires de la drosophile. Nous pouvons observer un point focal (Figure 3b) qui ressemble à l’immunomarquage HP1a, (agrégat ou condensat hétérochromatique). Un signal double ou triple (Figure 3c) peut être vu en de rares occasions dans les souches de type sauvage.

Figure 1
Figure 1. Image confocale représentative de microscopie de glande salivaire immunostaining avec de l’anticorps de HP1a du type sauvage (poids). a)ADN (signal cyan), HP1a (signal magenta) et barre d’échelle de fusion 100 μm. En immunomarquage pour HP1a, un noyau avec un point focal est marqué d’une flèche blanche et un noyau avec deux foyers avec une boîte en pointillés. La colonne de droite montre une image agrandie d’un seul noyau avec une barre d’échelle de 5 μm. b) distribution focale. c) distribution de deux foyers. Les deux noyaux sont marqués d’une ligne pointillée blanche. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Des exemples résultent du comptage de la distribution des foyers de noyaux de l’immunomarquage de HP1a. La première barre représente le comptage des noyaux de type sauvage (wt), comme dans la figure 1. La deuxième barre représente une souche mutante qui affecte cette distribution. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Image confocale représentative de microscopie de glande salivaire immunostaining avec l’anticorps H3K9me3 du type sauvage (poids). a) ADN (signal cyan), H3K9me3 (signal magenta) et barre d’échelle de fusion 100 μm. Dans l’immunomarquage pour H3K9me3.La colonne de droite montre une image agrandie d’un seul noyau avec une barre d’échelle de 5 μm. b) un noyau avec une distribution focale. c) distribution de trois foyers. Les deux noyaux sont marqués d’une ligne pointillée blanche. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La fonction cellulaire des organismes eucaryotes peut définir la structure 3D dans le noyau, qui est soutenue par des interactions entre différentes protéines avec la chromatine et diverses molécules, y compris l’ARN. Au cours des trois dernières années, les condensats biologiques qui ont eu de la pertinence, y compris l’hétérochromatine, ont joué un rôle fondamental dans la détermination de la séparation de phase favorisant l’organisation spatiale nucléaire distincte de la chromatine active et répressive 16,17,18.

L’hétérochromatine est essentielle pour préserver les fonctions cellulaires et l’identité. Auparavant, on pensait que ces zones denses n’étaient pas transcrites. Cependant, maintenant que nous disposons de technologies plus puissantes, nous pouvons voir que l’hétérochromatine est non seulement transcrite mais aussi un processus fondamental pour maintenir l’échafaudage du noyau et est sensible aux processus développementaux ou pathologiques12,19. En outre, certains gènes intégrés dans l’hétérochromatine péricentrique ont besoin d’un environnement hétérochromatique pour fonctionner correctement. Les mutations HP1a réduisent l’expression de la lumière et des gènes roulés, qui ont été les premiers à être découverts19. Ces gènes sont essentiels à la survie de l’organisme et se trouvent dans des blocs d’hétérochromatine. En conséquence, malgré sa capacité à induire le silence, ce composant particulier du génome a le potentiel d’être très dynamique20. Dans un équilibre complexe entre les types liés à la chromatine et diffus qui peuvent être contrôlés par divers contextes biologiques, des protéines associées à l’hétérochromatine telles que HP1a existent également. Il a également été suggéré récemment que les propriétés de séparation de phase sont démontrées par l’assemblage de condensats d’hétérochromatine21,22.

Il existe un certain nombre d’articles dans lesquels les auteurs ont effectué l’immunomarquage à montage entier de noyaux de glandes salivaires de drosophile en utilisant des protocoles différents et parfois plus simples23,24. Dans ce cas, nous avons adapté un protocole décrit pour la première fois dans C. elegans25, et ensuite utilisé dans les glandes salivaires de la drosophile par plusieurs groupes26,27,28,29 et l’avons combiné avec l’utilisation de la microscopie confocale et des organismes mutants. Ce protocole permet également la visualisation de différents types de protéines, notamment de facteurs de transcription tels que XPD, XPB et TBP27,mais aussi de protéines liées à l’hétérochromatine telles que HP1a et de marques d’histones telles que H3K9me3, ce qui le positionne comme un protocole pour une large utilisation dans ce tissu. Il a également l’avantage que le tissu peut être stocké à une étape intermédiaire sans affecter la bande chromosomique polytène.

Ce protocole est fiable et rentable en raison de l’utilisation d’un anticorps spécifique pour visualiser la protéine HP1a. L’étape critique de ce protocole est d’éviter de perdre les glandes pendant les lavages et d’attendre que le tissu soit au fond. L’avantage d’utiliser des glandes salivaires est qu’une vue 3D du noyau et de sa conformation peut être obtenue facilement, contrairement à la technique du chromosome polytène qui nécessite une perturbation mécanique de la cellule et peut endommager la chromatine. Lors de l’exécution de ce protocole, un soin particulier doit être pris lors des étapes de lavage. S’il n’est pas soigneusement exécuté, le tissu se brisera et il ne serait pas possible d’obtenir des images de haute qualité.

Pour évaluer l’importance de l’absence de liaison de l’ARN aux régions ou protéines observées, il est nécessaire d’ajouter un lavage avec le tampon C (tampon B sans EDTA) et d’ajouter 100 μM de RNase. Ce lavage doit être effectué pendant 1 h à 37 °C comme décrit précédemment. Le lavage doit être effectué avant l’étape où des molécules sont ajoutées pour observer l’ADN (entre les étapes 9.3 et 9.4).

La microscopie confocale peut ne pas sembler être une méthodologie très nouvelle pour répondre aux questions des condensats d’hétérochromatine25,30,mais il a été extrêmement utile d’identifier la délocalisation de la protéine HP1a dans les noyaux de drosophile, ce qui suggère de graves problèmes dans la structure de la chromatine qui peuvent être évalués avec d’autres techniques plus en profondeur. Malgré ses limites, il peut être utilisé en combinaison avec la microscopie à haute résolution comme première approche pour appliquer de nouvelles techniques pour clarifier l’activité biologique qui module l’assemblage, le contrôle et les fonctions du condensat d’hétérochromatine31. Certaines de ces nouvelles méthodologies qui se concentrent sur les interactions moléculaires et biophysiques entre l’hétérochromatine, l’ARN et les protéines associées à l’hétérochromatine sont rassemblées à partir de cet ensemble de méthodes pour tester les condensats d’hétérochromatine.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions Marco Antonio Rosales Vega et Abel Segura d’avoir pris certaines des images confocales, Carmen Muñoz pour la préparation des médias et le Dr Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui et le Dr Chris Wood de la LMNA pour des conseils sur l’utilisation des microscopes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 11351904 brand not critical
16% formaldehyde Thermo Scientific 28908
AF1 Citifluor Ted pella 19470 25 mL
BSA, Molecular Biology Grade Roche 10735078001 brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free
protease inhibitors		 Merck 5892953001
Coverslip Corning CLS285022-200EA 22x22, brand not critical
DTT Sigma d9779 brand not critical
EDTA Sigma E5134 brand not critical
EGTA brand not critical
Glass slide Gold seal 3011 brand not critical
H3BO3 Baker 0084-01 brand not critical
H3K9me3 Abcam 8889
HP1a Hybridoma Bank C1A9 Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl Baker 3040-01 brand not critical
Methanol Baker 9070-03 brand not critical
NaCl Sigma 71376 brand not critical
NaOH brand not critical
PIPES brand not critical
Rotator Thermo Scientific 13-687-12Q  Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C Eppendorf 13527550 SmartBlock 1.5 mL
Tris Milipore 648311 brand not critical
Triton X-100 Sigma T8787 100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710 25 mL, brand not critical

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References

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Biologie Numéro 174 Drosophila melanogaster hétérochromatine glandes salivaires chromatine immunomarquage HP1a
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