Подготовка гомогенатов скелетных мышц крыс для измерения нитратов и нитритов

Ji Won Park; Samantha M. Thomas; Lee J. Wylie; Andrew M. Jones; Anni Vanhatalo; Alan N. Schechter; Barbora Piknova

doi:10.3791/62427

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка гомогенатов скелетных мышц крыс для измерения нитратов и нитритов

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62427

⸱

29 июля 2021 г.

Ji Won Park^*¹ , Samantha M. Thomas^*¹ , Lee J. Wylie² , Andrew M. Jones² , Anni Vanhatalo² , Alan N. Schechter¹ , Barbora Piknova¹

¹Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, ²Sport and Health Sciences, College of Life and Environmental Sciences, St Luke’s Campus, University of Exeter

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протоколы для трех различных методов гомогенизации четырех различных групп мышц скелетной мышечной ткани крыс для измерения и сравнения уровней нитратов и нитритов. Кроме того, мы сравниваем различные веса образцов, чтобы выяснить, влияет ли размер образца ткани на результаты гомогенизации.

Аннотация

Ионы нитратов (NO₃^{-) когда-то} считались инертными конечными продуктами метаболизма оксида азота (NO). Тем не менее, предыдущие исследования показали, что ионы нитратов могут быть преобразованы обратно в NO у млекопитающих с помощью двухэтапного механизма восстановления: нитрат восстанавливается до нитритов (NO₂^-) в основном пероральными комменсальными бактериями, а затем нитрит восстанавливается до NO несколькими механизмами, в том числе с помощью белков, содержащих гем или молибден. Этот восстановительный нитратный путь способствует усилению NO-опосредованных сигнальных путей, особенно в сердечно-сосудистой системе и во время мышечных упражнений. Уровни нитратов в организме до такого использования определяются двумя различными источниками: эндогенным окислением NO и потреблением нитратов с пищей, главным образом из растений. Чтобы прояснить сложный цикл NO в физиологических условиях, мы дополнительно изучили динамику его метаболитов, нитратов и нитрит-ионов, которые относительно стабильны по сравнению с NO. В предыдущих исследованиях скелетные мышцы были идентифицированы как основной орган хранения ионов нитратов у млекопитающих, а также как прямой источник NO во время физических упражнений. Поэтому создание надежной методологии измерения уровней нитратов и нитритов в скелетных мышцах важно и должно быть полезно для расширения ее применения на другие образцы тканей. В этой статье подробно объясняется подготовка образцов скелетных мышц с использованием трех различных методов гомогенизации для измерения нитратов и нитритов и обсуждаются важные вопросы, связанные с процессами гомогенизации, включая размер образцов. Концентрации нитратов и нитритов также сравнивались по четырем различным группам мышц.

Введение

Оксид азота (NO), небольшая газообразная сигнальная молекула, играет решающую роль в физиологических и патофизиологических процессах¹. NO может быть продуцирован из L-аргинина эндогенными ферментами семейства синтазы оксида азота (NOS) до быстрого окисления до нитрата (NO₃^-) и, возможно, нитрита (NO₂^-) в крови и тканях ^2,3. Недавно было показано, что эти анионы восстанавливаются обратно до NO в системах^{млекопитающих 4}. Нитрат превращается в нитрит, главным образом, комменсальными бактериальными нитратредуктазами в полос....