Summary
Nous présentons des protocoles pour trois méthodes différentes d’homogénéisation de quatre groupes musculaires différents de tissu musculaire squelettique de rat afin de mesurer et de comparer les niveaux de nitrate et de nitrite. De plus, nous comparons différents poids d’échantillon pour déterminer si la taille de l’échantillon de tissu affecte les résultats de l’homogénéisation.
Abstract
On pensait autrefois que les ions nitrate (NO3-) étaient des produits finaux inertes du métabolisme de l’oxyde nitrique (NO). Cependant, des études antérieures ont démontré que les ions nitrate peuvent être reconvertis en NO chez les mammifères par un mécanisme de réduction en deux étapes: le nitrate étant réduit en nitrite (NO2-) principalement par des bactéries commensales orales, puis le nitrite étant réduit en NO par plusieurs mécanismes, y compris via des protéines contenant de l’hème ou du molybdène. Cette voie réductrice du nitrate contribue à améliorer les voies de signalisation médiées par le NO, en particulier dans le système cardiovasculaire et pendant l’exercice musculaire. Les niveaux de nitrate dans l’organisme avant cette utilisation sont déterminés par deux sources différentes: l’oxydation endogène du NO et l’apport alimentaire en nitrates, principalement à partir de plantes. Pour élucider le cycle complexe du NO dans des circonstances physiologiques, nous avons examiné plus en détail la dynamique de ses métabolites, les ions nitrate et nitrite, qui sont relativement stables par rapport au NO. Dans des études antérieures, le muscle squelettique a été identifié comme un organe de stockage majeur pour les ions nitrate chez les mammifères, ainsi qu’une source directe de NO pendant l’exercice. Par conséquent, l’établissement d’une méthodologie fiable pour mesurer les niveaux de nitrate et de nitrite dans le muscle squelettique est important et devrait être utile pour étendre son application à d’autres échantillons de tissus. Cet article explique en détail la préparation d’échantillons de muscles squelettiques, à l’aide de trois méthodes d’homogénéisation différentes, pour les mesures de nitrate et de nitrite et aborde des questions importantes liées aux processus d’homogénéisation, y compris la taille des échantillons. Les concentrations de nitrate et de nitrite ont également été comparées dans quatre groupes musculaires différents.
Introduction
L’oxyde nitrique (NO), une petite molécule de signalisation gazeuse, joue un rôle essentiel dans les processus physiologiques et physiopathologiques1. Le NO peut être produit à partir de la L-arginine par des enzymes endogènes de la famille des oxydes nitriques synthases (NOS) avant de subir une oxydation rapide en nitrate (NO 3-) et, éventuellement, en nitrite (NO 2-) dans le sang et les tissus 2,3. Récemment, il a été démontré que ces anions sont réduits à NO dans les systèmes de mammifères4. Le nitrate est converti en nitrite, principalement par les nitrates réductases bactériennes commensales dans la cavité buccale agissant sur les ions sécrétés par les glandes salivaires et directement ingérés 5, et dans une certaine mesure, par des enzymes de mammifères telles que la xanthine oxydoréductase 6,7. Le nitrite peut être réduit en NO par plusieurs mécanismes, y compris la désoxyhémoglobine8, la désoxymyoglobine9, les enzymes contenant du molybdène 10 et la réduction non enzymatique en présence de protons11,12.
Cette voie nitrate-nitrite-NO est améliorée dans des conditions hypoxiques où l’activité NOS est diminuée parce que NOS a besoin d’oxygène pour la générationde NO 4. De nombreuses études récentes ont rapporté des effets bénéfiques du nitrate alimentaire sur la régulation de la pression artérielle et la performance physique, suggérant que les voies de réduction des nitrates contribuent à l’augmentation de la signalisation du NO13,14,15. Des études antérieures ont montré que certains muscles squelettiques sont probablement les principaux lieux de stockage des nitrates dans le corps16. Comparé au sang ou à d’autres organes internes tels que le foie, le muscle squelettique (grand fessier) contient des niveaux significativement plus élevés de nitrate et a une masse substantielle dans le corps des mammifères. Il a été démontré que l’exercice sur tapis roulant améliorait la réduction des nitrates en nitrite et en NO dans les fessiers chez un rat modèle7. Ces résultats impliquent que certains muscles squelettiques pourraient être des sources importantes de NO par des voies de réduction des nitrates dans des situations physiologiques. Des études plus récentes suggèrent que ces résultats, y compris les changements dans les niveaux de nitrate musculaire pendant l’exercice, se produisent également chez les humains17.
Deux des auteurs actuels avaient déjà établi une méthode pour mesurer les niveaux de nitrate et de nitrite dans les échantillons de sang et d’autres liquides18. Cependant, lorsque les niveaux de ces anions dans les homogénats tissulaires ont été initialement analysés, les protocoles détaillés n’étaient pas disponibles. Pour comprendre la dynamique nitrate-nitrite-NO dans plusieurs organes différents, notre objectif était de développer une méthode précise et efficace pour mesurer les niveaux de nitrate et de nitrite dans les tissus de mammifères, y compris le muscle squelettique. Dans des études antérieures, des tissus de rongeurs ont été utilisés pour développer des processus d’homogénéisation fiables, puis analyser les teneurs en nitrates et nitrites dans ces homogénats 7,16,19. L’utilisation de cette méthode d’homogénéisation a été étendue aux échantillons de biopsie du muscle squelettique humain, où les valeurs ont été confirmées et, surtout, les valeurs observées pour le muscle par rapport au sang / plasma étaient dans des plages et des rapports similaires à ceux observés chez les rongeurs17. Au cours des dernières années, d’autres groupes ont également commencé à mesurer les niveaux de nitrates et de nitrites dans les homogénats des muscles squelettiques, rapportant des valeurs comparables à celles rapportées par notre groupe20,21.
Le but de ce document de protocole est de décrire en détail la préparation d’homogénats de muscles squelettiques en utilisant trois méthodes d’homogénéisation différentes pour la mesure ultérieure des niveaux de nitrate et de nitrite. De plus, les effets du poids tissulaire utilisé pour l’homogénéisation sur les valeurs de nitrate et de nitrite dans les échantillons de muscles squelettiques ont été examinés. Nous croyons que ces méthodes peuvent être facilement appliquées à d’autres types de tissus de mammifères. Récemment, en particulier dans le domaine de la physiologie de l’exercice, une attention particulière a été accordée aux différences possibles de physiologie nitrate/nitrite/NO selon les groupes musculaires. Nous rapportons également les quantités de nitrate et de nitrite dans quatre muscles de rongeurs différents et trouvons une distribution non uniforme des deux ions entre ces différents muscles; une observation qui nécessite une étude plus approfondie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le protocole animal a été approuvé par le Comité de soin et d’utilisation des animaux du NIDDK (ASP K049-MMB-20). Les animaux ont été manipulés et traités conformément au Guide de soin et d’utilisation des animaux de laboratoire disponible gratuitement sur le site Web de l’AAALAC.
1. Collection de muscles squelettiques de rat
- Pendant qu’un rat est sous anesthésie profonde (isoflurane à 5%, confirmée par l’absence de réaction au pincement de la queue / de la jambe), commencez la perfusion avec une solution saline contenant de l’héparine en plaçant une aiguille de 19 G dans un apex du ventricule gauche et en faisant une entaille sur l’oreillette droite. Laisser une solution saline contenant de l’héparine perfuser à travers les organes internes jusqu’à ce qu’au moins 1,5 litre / kg ait circulé dans les tissus. À ce stade, les animaux sont morts de l’exsanguination et les carcasses sont prêtes à être traitées pour le prélèvement d’échantillons.
REMARQUE: Il est essentiel d’obtenir une bonne perfusion, en particulier pour des mesures précises du nitrite, car le nitrite est oxydé en nitrate par l’hémoglobine restante. - Identifier les tissus musculaires cibles et les exciser des pattes postérieures22 à l’aide d’instruments chirurgicaux propres. Enlevez autant de graisse et de tissus conjonctifs des tissus musculaires que possible.
- Placez la quantité désirée de muscle dans un tube microcentrifugeux, puis placez-la sur de la glace sèche. Conservez les tubes remplis de tissu dans le congélateur à -80 °C.
REMARQUE: Dans le cas d’échantillons de biopsie humaine, épongez-les soigneusement immédiatement après le prélèvement avec de la gaze propre pour éliminer l’excès de sang.
2. Préparation à l’homogénéisation
- Préparation d’une solution préservant les nitrites (solution stop)
- Préparer une solution jaune clair contenant 890 mM de ferricyanure de potassium (K3Fe(CN)6) et 118 mM NEM (N-éthylmaléimide) dans de l’eau distillée, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de cristaux. Ajouter un tensioactif non ionique (détergent) dans un rapport de 1:9 (v/v, Tableau des matériaux) et mélanger doucement pour éviter la formation de mousse.
- Diluer la solution stop dans un rapport de 1:9 avec de l’eau distillée. Placer la solution d’arrêt diluée (rapport 1:5 entre le tissu musculaire et la solution d’arrêt diluée) dans le tube d’homogénéisation.
REMARQUE: Vingt milligrammes de tissu nécessiteront 100 μL de solution d’arrêt et 200 mg de tissu nécessiteront 1000 μL de solution d’arrêt dans le tube. La présence de détergent dans la solution ajoutée est essentielle pour la perturbation des membranes cellulaires. Tout détergent non ionique peut être utilisé, mais il faut veiller à ce qu’il n’interfère pas avec la méthode de chimiluminescence.
- Préparation des tissus
- Sortez le mouchoir du congélateur à -80 °C et décongelez-le lentement dans la glace. Retirez le reste de la graisse et du tissu conjonctif du muscle squelettique. Couper des morceaux de muscle squelettique et éponger sur de la gaze pour sécher.
- Pesez la quantité de tissu (20, 50 et 200 mg). Placez le muscle squelettique prépesé dans la solution d’arrêt dans les tubes d’homogénéisation ou placez le tissu prépesé dans un tube microcentrifuge propre pour une utilisation ultérieure.
3. Homogénéisation
- Homogénéisateur rotatif (Figure 1)
- Placez le tube de type M contenant le muscle squelettique prépesé et la solution d’arrêt pré-mesurée dans la machine. Homogénéiser chaque échantillon deux fois (en fonction du cycle d’homogénéisation le plus destructeur) et placer le tube sur de la glace immédiatement après chaque homogénéisation pendant 5 minutes pour refroidir.
- Centrifuger brièvement à 2 000 × g et 4 °C pendant 5 min. Replacez le tube complet sur de la glace et ajoutez le volume approprié de méthanol (≥ 99,9 %, 10 fois le poids du tissu). Vortex à fond pendant 15 s.
NOTE: Pour 20 mg de tissu, utilisez 200 μL de méthanol. Le méthanol est utilisé pour précipiter les protéines de l’homogénat tissulaire et n’interfère pas avec la méthode de chimiluminescence. Si une autre méthode de précipitation des protéines est utilisée, tester sa compatibilité avec la chimiluminescence. - Homogénéiser une fois de plus et incuber sur la glace pendant 30 min. Centrifuger les échantillons pendant 35 min à 4 °C et 3 500 × g. Aspirer le surnageant et mesurer les niveaux de nitrite/nitrate, ou stocker à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
- Homogénéisateur de billes (Figure 2)
- Placer le tissu musculaire squelettique dans un tube contenant des billes (rapport 1:5 pour la solution tissu/butée diluée) et homogénéiser deux fois pendant 45 s à la vitesse la plus élevée disponible sur l’instrument utilisé. Placer le tube sur de la glace immédiatement après chaque homogénéisation pendant 5 minutes pour refroidir.
- Centrifuger brièvement à l’aide d’une petite centrifugeuse de bureau (2 000 x g) pendant 5 secondes. Replacez le tube sur de la glace et ajoutez un volume approprié de méthanol (pureté ≥ 99,9 %, 10 fois le poids du tissu). Vortex à fond pendant 15 s.
NOTE 1: Pour 20 mg de tissu, utiliser 200 μL de méthanol.
NOTA 2: Le méthanol est utilisé pour précipiter les protéines de l’homogénat tissulaire et n’interfère pas avec la méthode de chimiluminescence. Si une autre méthode de précipitation des protéines est utilisée, tester sa compatibilité avec la chimiluminescence. - Homogénéiser à nouveau pendant 45 s à la vitesse la plus élevée disponible sur l’instrument utilisé. Incuber sur la glace pendant 30 min. Centrifugeuse à 17 000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirer le surnageant et mesurer les niveaux de nitrite/nitrate, ou stocker à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
- Pulvérisateur (Figure 3)
- Préparer des tubes contenant une solution d’arrêt diluée (5x le poids du tissu) et les peser. Noter le poids (tube + solution d’arrêt).
- Placez l’outil pulvérisateur d’azote liquide sur de la glace sèche et attendez environ 30 minutes pour qu’il atteigne la température désirée.
- À l’aide d’une pince à épiler refroidie dans de l’azote liquide, transférer un échantillon (poids du tissu déjà mesuré) dans le pulvérisateur. Ajoutez une petite cuillerée d’azote liquide pour vous assurer que le tissu est à la température de l’azote liquide.
- Une fois que 95% de l’azote liquide s’est vaporisé, placez l’outil de broyage sur le tissu et appuyez fermement. Vous devriez sentir l’écrasement de l’échantillon. À l’aide du maillet, frappez l’outil de concassage 3-5x.
- Vérifiez l’échantillon pour tout morceau restant à l’aide d’une cuillère refroidie à l’azote liquide. Après refroidissement dans de l’azote liquide, utilisez un morceau de papier de soie pour essuyer toute eau gelée avant de toucher le tissu. Si un morceau est présent, déplacez-le au centre, puis frappez 5 à 6 fois de plus avec le maillet.
- Lorsque l’échantillon entier a été pulvérisé, utiliser la cuillère refroidie à l’azote liquide pour transférer directement le tissu broyé dans le tube prépesé contenant la solution d’arrêt diluée (étape 3.3.1). Assurez-vous d’effectuer cette étape rapidement car lorsque le muscle squelettique écrasé se réchauffe, il devient collant et difficile à transférer.
- Vortex pendant 15 s. Vérifiez qu’aucun tissu n’est collé au sommet du tube en ouvrant le tube. S’il y en a, essayez de le déloger, puis de vortex à nouveau.
- Centrifuger l’échantillon pendant 2-3 s à l’aide d’une petite centrifugeuse de bureau. Pesez à nouveau le tube. Calculer le poids du tissu en déduisant le poids initial du tube (étape 3.3.1) de ce nouveau poids. Placez le tube sur de la glace.
REMARQUE: Les poids exacts aideront à déterminer le poids exact des tissus et la quantité de tissu perdue lors de la pulvérisation. - Une fois que tous les échantillons ont été traités jusqu’à l’étape 3.3.8, ajouter un volume approprié de méthanol (≥ 99,9 %, 10 fois le poids du tissu). Bien vorter pendant 15 s et incuber sur de la glace pendant 30 min.
NOTE: Pour 20 mg de tissu, utilisez 200 μL de méthanol. Le méthanol est utilisé pour précipiter les protéines de l’homogénat tissulaire et n’interfère pas avec la méthode de chimiluminescence. Si une autre méthode de précipitation des protéines est utilisée, tester sa compatibilité avec la chimiluminescence. - Centrifugeuse à 17 000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirer le surnageant et mesurer les niveaux de nitrite/nitrate, ou conserver à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
4. Mesure des nitrites/nitrates avec un analyseur d’oxyde nitrique (NOA)
- Préparer tous les échantillons par l’une des trois méthodes d’homogénéisation décrites ci-dessus et les injecter dans un avis d’approbation pour la mesure des nitrates et des nitrites.
REMARQUE : Des protocoles détaillés pour l’utilisation de l’ANO ont été publiés précédemment19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pour obtenir des résultats représentatifs, des tissus musculaires squelettiques de 8 rats Wistar (mâles et femelles, poids 250 ± 50 g) ont été utilisés. Les homogénats de muscles squelettiques de rat (50 mg de muscle grand fessier pour chaque méthode) ont été préparés par trois outils d’homogénéisation différents (homogénéisateur rotatif, homogénéisateur de billes et pulvérisateur). Les teneurs en nitrates et nitrites de ces homogénats ont ensuite été déterminées à l’aide d’un analyseur d’oxyde nitrique (NOA) (figure 4). Les concentrations de nitrates (figure 4A) dans ces trois échantillons d’homogénat étaient très semblables les unes aux autres, allant de 39,6 à 45,2 nmol/g.
Fait intéressant, les niveaux de nitrites (figure 4B) dans un échantillon homogéné préparé par un pulvérisateur ont montré la valeur la plus élevée (0,99 ± 0,15 nmol/g), et cela était statistiquement différent des deux autres valeurs de l’échantillon. Pour vérifier si la taille des tissus affecterait l’efficacité de l’homogénéisation et les valeurs de nitrate et de nitrite qui en résultent, trois tailles différentes de tissu musculaire squelettique (tissu musculaire fessier de 20, 50 et 200 mg) ont été utilisées pour l’homogénéisation par un homogénéisateur de billes (figure 5). Ni les concentrations de nitrate (figure 5A) ni de nitrite (figure 5B) n’étaient significativement différentes entre les tailles d’échantillons musculaires. Cependant, des concentrations de nitrate légèrement inférieures ont été observées lorsque la taille de l’échantillon a été augmentée, dans de multiples expériences pour des raisons qui ne sont pas claires.
Ensuite, les niveaux de nitrate et de nitrite dans différents types de tissus musculaires squelettiques des jambes de rongeurs ont été mesurés (figure 6). En plus du muscle grand fessier, les muscles tibiaux antérieurs (TA), extensor digitorum longus (EDL) et gastrocnémiens (50 mg chacun) ont été isolés des pattes de rat et homogénéisés à l’aide d’un homogénéisateur de billes. Étonnamment, les niveaux de nitrate du muscle fessier (40,4 nmol / g) étaient environ deux fois plus élevés que ceux des trois autres tissus musculaires, bien que dans cette expérience particulière, ces différences n’aient pas atteint la signification statistique (Figure 6A). La concentration de nitrites dans le muscle fessier était également plus élevée que celle des trois autres tissus musculaires et était significativement plus élevée que celle de l’échantillon gastrocnémien (figure 6B).
Nous avons déterminé le coefficient de variation pour les trois méthodes utilisées et les résultats sont présentés dans le tableau ci-joint. À titre de comparaison, le tableau montre également les coefficients de variation déterminés par Troutman et coll.21.
Figure 1 : Homogénéisateur rotatif. (A) Homogénéisateur; (B) tube contenant du tissu et solution d’arrêt. Les échantillons de tissu musculaire squelettique sont placés dans un tube avec une solution d’arrêt diluée et homogénéisés trois fois. Les échantillons doivent être immédiatement placés sur de la glace après chaque étape d’homogénéisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Homogénéisateur de billes. a) homogénéisateur; (B) perles contenant des tubes. Les échantillons de tissu musculaire squelettique sont placés dans un tube contenant des billes (5 billes de céramique) avec une solution d’arrêt diluée et homogénéisés trois fois au total (45 s à la vitesse la plus élevée pour chaque fois). Les échantillons doivent être immédiatement placés sur de la glace après chaque étape d’homogénéisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Pulvérisateur. (A) pièces du pulvérisateur (B) corps du pulvérisateur - mortier et pilon assemblés. (C) détail de l’assemblage du mortier et du pilon. Les pièces du pulvérisateur sont refroidies sur de la glace sèche pendant 30 minutes. De l’azote liquide est mis dans le mortier, puis du tissu musculaire squelettique pré-pesé est ajouté. Une fois que 90% de l’azote liquide a disparu, la partie supérieure - le pilon - est insérée dans le bassin. Le pilon est pilé avec un maillet 5-6 fois jusqu’à ce que l’échantillon soit poudreux. Le tissu en poudre est ensuite transféré dans un tube avec une solution d’arrêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Teneurs en nitrates et en nitrites (B) dans les homogénats du muscle fessier préparés par trois méthodes d’homogénéisation différentes. Cinquante milligrammes de muscle fessier ont été homogénéisés par trois méthodes d’homogénéisation différentes. Le méthanol (500 μL) a été ajouté aux homogénats pour précipiter les protéines. Une méthode standard de chimiluminescence avec une solution de chlorure de vanadium ou de triiodure a été utilisée pour mesurer les niveaux de nitrate et de nitrite, respectivement, dans le surnageant clair après centrifugation; n = 7 (nitrate); n = 8 (nitrite); les données sont présentées sous forme de moyennes ± écart-type, * p < 0,05 en utilisant l’ANOVA unidirectionnelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Teneurs en nitrate et en nitrite (A) en nitrites dans différentes tailles d’échantillons de muscle fessier. Trois tailles différentes d’homogénats de muscle fessier ont été préparées à l’aide d’un homogénéisateur de billes. Une méthode standard de chimiluminescence avec une solution de chlorure de vanadium ou de triiodure a été utilisée pour mesurer les niveaux de nitrate et de nitrite, respectivement, dans le surnageant clair après centrifugation; n = 7 (nitrate); n = 8 (nitrite); Les données sont présentées sous forme de moyennes ± écart-type, veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Teneurs en nitrates et en nitrites (A) en nitrites dans quatre muscles différents. Chaque muscle (50 mg) a été homogénéisé à l’aide d’un homogénéisateur de billes, et une méthode de chimiluminescence standard avec une solution de chlorure de vanadium ou de triiodure a été utilisée pour mesurer les niveaux de nitrate et de nitrite, respectivement; n = 4-7 (nitrate); n = 3-8 (nitrite); les données sont présentées sous forme de moyennes ± écart-type, * p < 0,05 en utilisant l’ANOVA unidirectionnelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Fichier supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pour surveiller l’évolution des métabolites du NO, nitrate et nitrite, en fonction des interventions physiologiques, il est impératif de mesurer les niveaux de ces ions dans les différents organes critiques dans leur métabolisme. Comme l’hémoglobine dans le sang réagit avec le NO et ses métabolites, il est également important de prélever le sang rapidement des échantillons de tissus autant que possible. Ainsi, les animaux ont été perfusés avec une solution saline avant de recueillir les tissus musculaires squelettiques (fessier, TA, EDL, muscle gastrocnémien), et le tissu conjonctif et la graisse autour du muscle cible ont été immédiatement retirés. Pour la solution d’homogénéisation, une « solution stop » a été spécialement formulée avec du ferricyanure, du NEM et du tensioactif non ionique pour préserver le nitrite dans divers tissus19. La présence de détergent non ionique est essentielle pour la perturbation complète des membranes cellulaires. Dans le cas des deux machines d’homogénéisation utilisées dans cette étude, l’homogénéisateur rotatif et l’homogénéisateur à billes, le volume de solution d’arrêt nécessaire à l’homogénéisation était 5 fois le poids du tissu, de sorte que le tissu entier était complètement immergé dans la solution et traité de manière homogène.
Le processus d’homogénéisation a été effectué trois fois au total (deux fois avant l’ajout de méthanol et une fois de plus après l’ajout de méthanol pour précipiter les protéines), chaque fois en utilisant un réglage programmé déterminé par les fabricants d’instruments. Il est important de placer les échantillons sur de la glace immédiatement après chaque homogénéisation afin d’éviter la détérioration de l’échantillon par le léger échauffement, qui peut être généré pendant l’homogénéisation. Pour la méthode de pulvérisation, les échantillons de tissus ont d’abord été broyés en poudre tout en les gardant congelés à l’aide d’azote liquide, puis les échantillons ont été mélangés avec une solution stop (5x le poids du tissu). Dans les trois méthodes, du méthanol (10x le poids tissulaire) a été ajouté aux échantillons, et le mélange a été incubé sur de la glace pendant 30 minutes pour précipiter les protéines et extraire complètement le nitrate et le nitrite des tissus. La présence de protéines dans l’échantillon peut provoquer une mousse excessive de la solution réactionnelle dans la chambre lors de l’utilisation de la chimiluminescence, il est donc nécessaire de précipiter les protéines des échantillons. N’importe quel agent de précipitation peut être utilisé, mais il est nécessaire de confirmer que ces agents n’interféreront ni avec la méthode de chimiluminescence ni ne provoqueront de modifications des concentrations de nitrites/nitrates en réagissant avec ces ions.
Les niveaux de nitrate dans tous les échantillons fessiers préparés par les trois méthodes étaient très similaires (39,6-45,2 nmol/g, figure 4A), ce qui suggère que ces trois méthodes d’homogénéisation sont également applicables à la préparation d’échantillons musculaires pour l’analyse des nitrates. Bien que les niveaux de nitrites aient été légèrement plus élevés dans les échantillons préparés par pulvérisation par rapport aux deux autres méthodes (figure 4B), toutes les valeurs mesurées étaient dans une plage limitée (0,64-0,99 nmol/g). L’effet de la taille des échantillons de tissus sur les valeurs de nitrate et de nitrite dans les échantillons de muscles squelettiques a été examiné parce que les chercheurs traitent souvent de très petits échantillons, en particulier de petits animaux ou de biopsies musculaires humaines. Ni les niveaux de nitrate ni de nitrite n’étaient significativement différents dans la plage de 20 à 200 mg de tissu musculaire squelettique dans ces expériences (Figure 5).
Cependant, il convient de noter que, bien qu’elles ne soient pas statistiquement significatives, les concentrations de nitrate ont tendance à être légèrement inférieures lorsqu’elles sont mesurées dans des échantillons plus grands (figure 5). Nous avons remarqué ce phénomène au cours de nos études publiées et non publiées, mais nous n’en comprenons pas les raisons. Par conséquent, il est probablement important de tenir compte du poids des échantillons et, idéalement, de les maintenir cohérents tout au long d’une étude lors de la préparation d’homogénats à partir de plusieurs échantillons de tissus. Une autre considération lorsque vous travaillez avec des échantillons plus petits (20 mg) est que le volume total final de l’échantillon traité n’est que de ~ 300 μL, ce qui réduit considérablement la possibilité de mesurer le même échantillon plusieurs fois. Cependant, en particulier pour les études humaines, 20 mg est la taille acceptable habituelle pour les biopsies musculaires.
Pour examiner si différents muscles des pattes de rat auraient des teneurs différentes en nitrates/nitrites, les concentrations de ces ions ont été comparées dans quatre muscles différents des jambes (Figure 6). Les niveaux de nitrate et de nitrite étaient les plus élevés dans le muscle fessier par rapport à trois autres tissus musculaires, bien que les différences n’aient pas atteint la signification statistique dans cette étude, ce qui suggère que le métabolisme des nitrates dans divers types de muscles peut être régi différemment. Ce phénomène fait actuellement l’objet d’une étude plus approfondie.
D’autres groupes de recherche ont également signalé des concentrations de nitrate dans les muscles squelettiques, révélant une variabilité significative de ces valeurs. Le groupe Coggan a montré que les niveaux de nitrate dans le muscle soléaire du rat Sprague Dawley varient de 62 à 124 nmol / g selon les méthodes de préparation musculaire21. Le même groupe a rapporté des valeurs de nitrate chez le rat SD vastus lateralis (environ 60 nmol/g) et le soléaire (environ 215 nmol/g) dans une autre étude23. Ohtake et coll. ont mesuré des concentrations de nitrates dans le muscle gastrocnémien de souris de >300 nmol/g; Cependant, les méthodes précises de préparation des homogénats musculaires n’ont pas été décrites24. Le groupe Verdijk a rapporté des teneurs en nitrates dans les biopsies musculaires humaines (vastus lateralis) allant de 54 à 80 nmol/g selon l’âge de20 ans ; dans une étude similaire, Wylie et al. rapportent 226 nmol / g pour le même groupe musculaire17. Ces résultats suggèrent que les concentrations de nitrate/nitrite dans les échantillons de muscles squelettiques reflètent de nombreux facteurs - physiologiques (p. ex. état d’exercice), environnementaux (p. ex. régime alimentaire) et techniques (détails de l’essai) - qui contribuent vraisemblablement à la variabilité des mesures.
Nous avons déterminé le coefficient de variabilité (CV) pour les trois méthodes présentées ici - voir le fichier supplémentaire ci-joint. Même si les CV sont loin d’être idéales et varient selon les méthodes utilisées, nos valeurs de CV sont comparables à celles publiées par Troutman et al. 21 en utilisant des méthodes similaires avec un traitement différent des échantillons. Malheureusement, il n’y a toujours pas d’explication claire pour expliquer pourquoi une telle variabilité persiste; Cet article est le seul protocole détaillé publié que nous connaissons pour le traitement des échantillons musculaires pour la détermination des nitrates et des nitrites.
Nous avons également mesuré la linéarité et le degré de récupération des nitrates à partir d’échantillons musculaires enrichis de nitrates (voir le fichier supplémentaire ci-joint). Lorsque nous avons ajouté trois concentrations différentes de nitrate dans des échantillons fessiers pour l’homogénéisation, nous avons obtenu une bonne réponse linéaire à l’augmentation des concentrations de nitrate avec ~80% de récupération du nitrate ajouté pour les homogénéisateurs à billes et rotatifs. Ces résultats démontrent que les deux méthodes d’homogénéisation peuvent être utilisées pour déterminer les niveaux de nitrate et de nitrite dans les échantillons biologiques avec une bonne confiance. La perte de 20% de nitrate ajouté se produit probablement pendant la déprotéinisation et la centrifugation de l’homogénat de tissu musculaire lorsque certains ions peuvent co-précipiter avec des protéines chargées ou d’autres parties cellulaires.
En général, nous espérons que la méthode que nous proposons de préparation d’échantillons musculaires pour les mesures de nitrate et de nitrite s’avérera utile non seulement dans le domaine de la recherche sur l’exercice, mais aussi dans les études cliniques. Il existe des troubles neuromusculaires et / ou métaboliques affectant de grandes populations qui pourraient être liés à un dysfonctionnement du cycle de l’oxyde nitrique et pourraient bénéficier de l’approvisionnement en nitrates. Cependant, il faut d’abord établir si AUCUNE carence n’existe effectivement et si elle peut être corrigée par une intervention diététique. Nous espérons que la méthode décrite ici permettra de surveiller le devenir des nitrates et d’autres métabolites du cycle de NO.
Nous sommes conscients qu’à ce stade de son développement, les méthodes de préparation des muscles squelettiques pour les mesures de nitrates et de nitrites par chimiluminescence (la plus quantitative de toutes les déterminations des oxydes d’azote eux-mêmes) ont encore des variables inconnues, dont certaines sont discutées ci-dessus. Cependant, même avec leurs limites, les méthodes décrites permettent une comparaison raisonnablement précise des niveaux de nitrate/nitrite de différents organes, y compris différents muscles squelettiques, et devraient permettre la formulation d’hypothèses qui peuvent ensuite être testées avec une précision raisonnable.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts. Alan N. Schechter est répertorié comme co-inventeur sur plusieurs brevets délivrés aux National Institutes of Health pour l’utilisation de sels de nitrite pour le traitement des maladies cardiovasculaires. Il reçoit des redevances basées sur la licence NIH de ces brevets pour le développement clinique, mais aucune autre compensation. Ces arrangements n’affectent pas son adhésion aux politiques de la revue JoVE.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention intra-muros NIH/NIDDK ZIA DK 0251041-14 à Alan N Schechter, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
References
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A.
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al.
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
