Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62427
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 1
1Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, 2Sport and Health Sciences, College of Life and Environmental Sciences, St Luke’s Campus, University of Exeter
* These authors contributed equally

Summary

אנו מציגים פרוטוקולים לשלוש שיטות שונות להומוגניזציה של ארבע קבוצות שרירים שונות של רקמת שריר שלד חולדה כדי למדוד ולהשוות את רמות החנקות והניטריט. יתר על כן, אנו משווים משקלים שונים של דגימות כדי לחקור אם גודל דגימת הרקמה משפיע על תוצאות ההומוגניזציה.

Abstract

יונים חנקתיים (NO3-) נחשבו בעבר לתוצרים סופיים אינרטיים של חילוף החומרים של תחמוצת החנקן (NO). עם זאת, מחקרים קודמים הראו כי יונים חנקתיים יכולים להיות מומרים בחזרה ל-NO ביונקים באמצעות מנגנון הפחתה דו-שלבי: ניטרט מופחת לניטריט (NO2-) בעיקר על ידי חיידקי קומנסל דרך הפה, ואז ניטריט מופחת ל-NO על ידי מספר מנגנונים, כולל באמצעות חלבונים המכילים הם או מוליבדן. מסלול חנקתי רדוקטיבי זה תורם לשיפור מסלולי איתות ללא תיווך, במיוחד במערכת הלב וכלי הדם ובמהלך פעילות גופנית. רמות החנקות בגוף לפני ניצול כזה נקבעות על ידי שני מקורות שונים: חמצון NO אנדוגני וצריכת חנקות תזונתית, בעיקר מצמחים. כדי להבהיר את מחזור ה-NO המורכב בנסיבות פיזיולוגיות, בחנו עוד יותר את הדינמיקה של המטבוליטים, יוני החנקות והניטריטים שלו, שהם יציבים יחסית בהשוואה ל-NO. במחקרים קודמים זוהה שריר השלד כאיבר אחסון מרכזי ליוני חנקות ביונקים, וכן כמקור ישיר של NO במהלך פעילות גופנית. לכן, קביעת מתודולוגיה אמינה למדידת רמות החנקות והניטריטים בשרירי השלד חשובה ואמורה לסייע בהרחבת יישומה לדגימות רקמות אחרות. מאמר זה מסביר בפירוט את הכנת דגימות שרירי השלד, תוך שימוש בשלוש שיטות הומוגניות שונות, למדידות ניטראט וניטריט ודן בנושאים חשובים הקשורים לתהליכי הומוגניזציה, כולל גודל הדגימות. ריכוזי ניטראט וניטריט הושוו גם בארבע קבוצות שרירים שונות.

Introduction

תחמוצת החנקן (NO), מולקולת איתות גזית קטנה, ממלאת תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים1. לא ניתן לייצר NO מ-L-ארגינין על-ידי אנזימים אנדוגניים ממשפחת הסינתאז של תחמוצת החנקן (NOS) לפני שהוא עובר חמצון מהיר לחנקות (NO 3-) וייתכן שגם ניטריט (NO 2-) בדם וברקמות 2,3. לאחרונה הוכח כי אניונים אלה מופחתים בחזרה ל-NO במערכות יונקים4. חנקה מומרת לניטריט, בעיקר על ידי רדוקטזות של חיידקים חנקתיים בחלל הפה הפועלות על יונים המופרשים על ידי בלוטות הרוק ונבלעים ישירות 5, ובמידה מסוימת, על ידי אנזימים של יונקים כגון קסנטין אוקסידורדוקטאז 6,7. ניטריט יכול להיות מופחת עוד יותר ל-NO על ידי מספר מנגנונים, כולל דאוקסיהמוגלובין8, דאוקסימיוגלובין9, אנזימים המכילים מוליבדן 10, והפחתה לא אנזימטית בנוכחות פרוטונים11,12.

מסלול ניטריט-ניטריט-NO זה משופר בתנאים היפוקסיים שבהם פעילות ה-NOS פוחתת מכיוון ש-NOS דורש חמצן עבור NO דור4. מחקרים רבים שנערכו לאחרונה דיווחו על השפעות מועילות של חנקות תזונתיות על ויסות לחץ הדם ועל הביצועים הגופניים, מה שמצביע על כך שמסלולי הפחתת חנקות תורמים להגברת האיתות NO13,14,15. מחקרים קודמים הראו כי חלק משרירי השלד הם ככל הנראה מקומות אחסון החנקות העיקריים בגוף16. בהשוואה לדם או לאיברים פנימיים אחרים כגון כבד, שרירי השלד (gluteus maximus) מכילים רמות גבוהות משמעותית של חנקות ויש להם מסה משמעותית בגוף היונקים. הודגם כי תרגיל הליכון משפר את הפחתת החנקות לניטריט ול-NO בגלוטאוס בחולדה מדגם7. תוצאות אלה מרמזות על כך ששרירי שלד מסוימים עשויים להיות מקורות חשובים ל-NO באמצעות מסלולי הפחתת חנקות במצבים פיזיולוגיים. מחקרים עדכניים יותר מצביעים על כך שממצאים אלה, כולל שינויים ברמות החנקות בשרירים במהלך פעילות גופנית, מתרחשים גם בבני אדם17.

שניים מהמחברים הנוכחיים ביססו בעבר שיטה למדידת רמות חנקות וניטריט בדם ובדגימות נוזליות אחרות18. עם זאת, כאשר הרמות של אניונים אלה בהומוגנטים רקמה נותחו בתחילה, פרוטוקולים מפורטים לא היו זמינים. כדי להבין את הדינמיקה של ניטרט-ניטריט-NO בכמה איברים שונים, המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה מדויקת ויעילה למדידת רמות החנקות והניטריטים ברקמות יונקים, כולל שרירי השלד. במחקרים קודמים, רקמות מכרסמים שימשו לפיתוח תהליכי הומוגניזציה אמינים ולאחר מכן לניתוח תכולת חנקות וניטריטים באותם הומוגנטים 7,16,19. השימוש בשיטת הומוגניזציה זו הורחב לדגימות ביופסיה של שרירי שלד אנושיים, לפיהן אושרו הערכים, וחשוב מכך, הערכים שנצפו עבור שריר בהשוואה לדם/פלזמה היו בטווחים ויחסים דומים לאלה שנצפו במכרסמים17. בשנים האחרונות, גם קבוצות אחרות החלו למדוד את רמות החנקות והניטריטים אצל הומוגנאטים בשרירי השלד, ודיווחו על ערכים דומים לאלה שדווחו על ידי הקבוצה שלנו20,21.

מטרת מאמר פרוטוקול זה היא לתאר בפירוט את הכנת הומוגנאטים בשרירי השלד באמצעות שלוש שיטות הומוגניזציה שונות למדידה עוקבת של רמות חנקות וניטריטים. בנוסף, נבדקו ההשפעות של משקל הרקמה המשמש להומוגניזציה על ערכים של חנקות וניטריט בדגימות שרירי השלד. אנו מאמינים כי ניתן ליישם שיטות אלה בקלות על סוגים אחרים של רקמות יונקים. לאחרונה, במיוחד בתחום הפיזיולוגיה של האימון, הוקדשה תשומת לב להבדלים האפשריים בפיזיולוגיה של ניטריט/ניטריט/NO בהתאם לקבוצות שרירים. אנו מדווחים גם על כמויות הניטראט והניטריט בארבעה שרירי מכרסמים שונים ומוצאים התפלגות לא אחידה של שני היונים בין השרירים השונים האלה; תצפית הדורשת מחקר נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול בעלי חיים אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של NIDDK (ASP K049-MMB-20). בעלי חיים טופלו וטופלו על פי המדריך הנוכחי לטיפול ושימוש בחיות מעבדה הזמין באופן חופשי באתר AAALAC.

1. אוסף שרירי שלד עכברושים

  1. בזמן שחולדה נמצאת תחת הרדמה עמוקה (5% איזופלורן, שאושר על ידי תגובה נעדרת לצביטת זנב/רגל), התחילו זלוף עם מי מלח המכילים הפרין על ידי הכנסת מחט של 19 גרם לתוך קצה של החדר השמאלי ויצירת ניק באטריום הימני. אפשרו למלח עם הפרין לחלחל דרך האיברים הפנימיים עד שלפחות 1.5 ליטר/ק"ג זרמו דרך הרקמה. בשלב זה, בעלי חיים מתים מאקסנגווינציה ופגרים מוכנים לעיבוד לאיסוף דגימות.
    הערה: השגת זלוף טוב היא קריטית, במיוחד עבור מדידות מדויקות של ניטריט, מכיוון שניטריט מחומצן לחנקות על ידי כל המוגלובין שנותר.
  2. זהה רקמות שריר מטרה וכרית אותן מהרגליים האחוריות22 באמצעות מכשירי ניתוח נקיים. הסר כמה שיותר שומן ורקמות חיבור מרקמות השריר.
  3. הכניסו את כמות השרירים הרצויה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה ולאחר מכן הניחו על קרח יבש. אחסנו את הצינורות המלאים ברקמה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: במקרה של דגימות ביופסיה אנושיות, יש להכתים אותן ביסודיות מיד עם האיסוף עם גזה נקייה כדי להסיר עודפי דם.

2. הכנה להומוגניזציה

  1. הכנת תמיסה משמרת ניטריט (תמיסת עצירה)
    1. הכינו תמיסה צהובה שקופה המכילה 890 mM אשלגן פריציאניד (K3Fe(CN)6) ו-118 mM NEM (N-ethylmaleimide) במים מזוקקים, כדי להבטיח שלא יהיו גבישים. הוסיפו חומרים פעילי שטח לא יוניים (חומרי ניקוי) ביחס של 1:9 (v/v, Table of Materials), וערבבו בעדינות כדי למנוע הקצפה.
    2. יש לדלל את תמיסת העצירה ביחס של 1:9 עם מים מזוקקים. מניחים את תמיסת העצירה המדוללת (יחס של 1:5 בין רקמת השריר לתמיסת עצירה מדוללת) בצינור ההומוגניזציה.
      הערה: עשרים מיליגרם של רקמה ידרשו 100 μL של תמיסת עצירה, ו 200 מ"ג של רקמה ידרוש 1000 μL של תמיסת עצירה בצינור. נוכחות של חומר ניקוי בתמיסה נוספת היא קריטית לשיבוש של קרומי התא. ניתן להשתמש בכל חומר ניקוי שאינו יוני, אך יש להקפיד על כך שהוא אינו מפריע לשיטת הכימילומינסנציה.
  2. הכנת רקמות
    1. מוציאים את הרקמה מהמקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ומפשירים לאט בקרח. הסר את השומן הנותר ורקמת החיבור משרירי השלד. חותכים חתיכות של שרירי השלד וכתם על גזה לייבוש.
    2. שוקלים את כמות הרקמה (20, 50 ו -200 מ"ג). הניחו את שרירי השלד שנשקלו מראש בתמיסת העצירה בצינורות ההומוגניזציה או הניחו את הרקמה הנשקלת מראש בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי לשימוש מאוחר יותר.

3. הומוגניזציה

  1. הומוגנייזר סיבובי (איור 1)
    1. הכניסו למכונה את הצינור מסוג M המכיל את שרירי השלד שנשקלו מראש ותמיסת עצירה שנמדדה מראש. הומוגניזציה של כל דגימה פעמיים (הגדרת מחזור ההומוגניזציה ההרסני ביותר) והנחת הצינור על קרח מיד לאחר כל הומוגניזציה למשך 5 דקות כדי להתקרר.
    2. צנטריפוגה לזמן קצר ב-2,000 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מניחים את הצינור המלא בחזרה על קרח ומוסיפים את הנפח המתאים של מתנול (≥ 99.9%, פי 10 ממשקל הרקמה). מערבולת ביסודיות במשך 15 שניות.
      הערה: עבור 20 מ"ג רקמה, יש להשתמש ב-200 μL של מתנול. מתנול משמש לזירוז חלבונים מהומוגנט רקמות ואינו מפריע לשיטת הכימילומינסנציה. אם נעשה שימוש בשיטת משקעי חלבון אחרים, בדוק את תאימותו לכימילומינסנציה.
    3. הומוגני פעם נוספת דגירה על קרח במשך 30 דקות. צנטריפוגה את הדגימות במשך 35 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ו 3,500 × גרם. שאפו את הסופר-נטנט ומדדו את רמות הניטריט/ניטראט, או אחסנו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.
  2. הומוגנייזר חרוזים (איור 2)
    1. מניחים את רקמת שריר השלד בצינור המכיל חרוזים (יחס של 1:5 לרקמה: תמיסת עצירה מדוללת) והומוגניים פעמיים במשך 45 שניות במהירות הגבוהה ביותר הקיימת במכשיר בו נעשה שימוש. מניחים את הצינור על קרח מיד לאחר כל הומוגניזציה למשך 5 דקות כדי להתקרר.
    2. צנטריפוגה לזמן קצר באמצעות צנטריפוגה שולחנית קטנה (2,000 x גרם) למשך 5 שניות. מניחים את הצינור בחזרה על קרח ומוסיפים נפח מתאים של מתנול (טוהר ≥ 99.9%, פי 10 ממשקל הרקמה). מערבולת ביסודיות במשך 15 שניות.
      הערה 1: עבור 20 מ"ג רקמה, יש להשתמש ב-200 μL של מתנול.
      הערה 2: מתנול משמש לזירוז חלבונים מהומוגנט רקמתי ואינו מפריע לשיטת הכימילומינסנציה. אם נעשה שימוש בשיטת משקעי חלבון אחרים, בדוק את תאימותו לכימילומינסנציה.
    3. הומוגניזציה פעם נוספת במשך 45 שניות במהירות הגבוהה ביותר הקיימת במכשיר שבו נעשה שימוש. דגירה על קרח במשך 30 דקות. צנטריפוגה ב 17,000 x גרם, 4 °C, 30 דקות. שאפו את הסופר-נטנט ומדדו את רמות הניטריט/ניטראט, או אחסנו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.
  3. פולברייזר (איור 3)
    1. הכינו צינורות המכילים תמיסת עצירה מדוללת (פי 5 ממשקל הרקמה) ושקלו אותם. רשום את המשקל (צינור + תמיסת עצירה).
    2. הניחו את כלי פולברייזר החנקן הנוזלי על קרח יבש והמתינו כ-30 דקות עד שהוא יגיע לטמפרטורה הרצויה.
    3. באמצעות פינצטה מקוררת בחנקן נוזלי, מעבירים דגימה אחת (משקל הרקמה כבר נמדד) לפולברייזר. הוסיפו כפית קטנה של חנקן נוזלי כדי לוודא שהרקמה נמצאת בטמפרטורת חנקן נוזלי.
    4. לאחר ש-95% מהחנקן הנוזלי התאדה, הניחו את כלי הריסוק על גבי הרקמה ולחצו בחוזקה. אתה צריך להרגיש את המדגם לרסק. באמצעות mallet, להכות את כלי ריסוק 3-5x.
    5. בדוק את הדגימה עבור כל הגושים הנותרים באמצעות כף מקורר בחנקן נוזלי. לאחר קירור בחנקן נוזלי, השתמשו בפיסת נייר טישו כדי לנגב מים קפואים לפני שאתם נוגעים ברקמה. אם נתח קיים, להזיז אותו למרכז, ולאחר מכן להכות 5-6 פעמים נוספות עם mallet.
    6. לאחר שהדגימה כולה נגנזה, השתמש בכף המקוררת בחנקן נוזלי כדי להעביר ישירות את הרקמה המרוסקת לתוך הצינור השקול מראש המכיל את תמיסת העצירה המדוללת (שלב 3.3.1). הקפד לבצע שלב זה במהירות כמו כאשר שריר השלד מרוסק מתחמם, זה נהיה דביק וקשה להעביר.
    7. וורטקס במשך 15 שניות. בדוק שאף רקמה לא תקועה בחלק העליון של הצינור על ידי פתיחת הצינור. אם יש, נסה להיפטר ממנו ואז מערבולת שוב.
    8. צנטריפוגה את הדגימה עבור 2-3 שניות באמצעות צנטריפוגה שולחנית קטנה. שוקלים שוב את הצינור. חשב את משקל הרקמה על ידי ניכוי משקל הצינור המקורי (שלב 3.3.1) ממשקל חדש זה. מניחים את הצינור על קרח.
      הערה: המשקלים המדויקים יעזרו לקבוע את משקל הרקמה המדויק וכמה רקמה אבדה במהלך הפולבריזציה.
    9. לאחר עיבוד כל הדגימות עד שלב 3.3.8, הוסף נפח מתאים של מתנול (≥ 99.9%, פי 10 ממשקל הרקמה). מערבולות ביסודיות במשך 15 שניות, ודוגרות על קרח במשך 30 דקות.
      הערה: עבור 20 מ"ג רקמה, יש להשתמש ב-200 μL של מתנול. מתנול משמש לזירוז חלבונים מהומוגנט רקמות ואינו מפריע לשיטת הכימילומינסנציה. אם נעשה שימוש בשיטת משקעי חלבון אחרים, בדוק את תאימותו לכימילומינסנציה.
    10. צנטריפוגה ב 17,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 30 דקות. שאפו את הסופר-נטנט ומדדו את רמות הניטריט/ניטראט, או אחסנו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.

4. מדידת ניטריט/ניטראט עם אנלייזר תחמוצת החנקן (NOA)

  1. הכינו את כל הדגימות באחת משלוש שיטות הומוגניזציה שונות שתוארו לעיל והזריקו אותן ל-NOA למדידת חנקות וניטריטים.
    הערה: פרוטוקולים מפורטים לשימוש NOA פורסמו בעבר19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להשיג תוצאות מייצגות, רקמות שריר השלד מ 8 חולדות Wistar (זכרים ונקבות, משקל 250 ± 50 גרם) שימשו. הומוגנאטים של שרירי שלד חולדה (50 מ"ג של שריר גלוטאוס מקסימוס לכל שיטה) הוכנו על ידי שלושה כלי הומוגניזציה שונים (הומוגנייזר סיבובי, הומוגנייזר חרוזים ופולברייזר). לאחר מכן, תכולת החנקות והניטריטים של ההומוגנטים האלה נקבעה באמצעות מנתח תחמוצת החנקן (NOA) (איור 4). רמות החנקות (איור 4A) בשלוש הדגימות ההומוגניות האלה היו דומות מאוד זו לזו, ונעו בין 39.6 ל-45.2 ננומול/גרם.

באופן מעניין, רמות ניטריט (איור 4B) בדגימה הומוגנית שהוכנה על-ידי פולברייזר הראו את הערך הגבוה ביותר (0.99 ± 0.15 ננומול/גרם), וזה היה שונה סטטיסטית משני ערכי המדגם האחרים. כדי לבחון אם גודל הרקמות ישפיע על יעילות ההומוגניזציה ועל ערכי החנקות והניטריטים הנובעים מכך, שלושה גדלים שונים של רקמת שריר השלד (רקמת שריר גלוטאוס של 20, 50 ו-200 מ"ג) שימשו להומוגניזציה על-ידי הומוגנייזר חרוזים (איור 5). לא רמות הניטראט (איור 5A) ולא הניטריט (איור 5B) היו שונות באופן משמעותי בין גודל דגימת השרירים. עם זאת, ריכוזי חנקות מעט נמוכים יותר נצפו כאשר גודל המדגם הוגדל, בניסויים מרובים מסיבות שאינן ברורות.

לאחר מכן, נמדדו רמות ניטרט וניטריט בסוגים שונים של רקמות שריר שלד ברגליים של מכרסמים (איור 6). בנוסף לשריר הגלוטאוס מקסימוס, שרירי טיביאליס קדמי (TA), extensor digitorum longus (EDL) ושרירי גסטרוקנמיוס (50 מ"ג כל אחד) בודדו מרגלי חולדות והומוגניות באמצעות הומוגנייזר חרוזים. באופן מפתיע, הרמות החנקתיות של שריר הגלוטאוס (40.4 ננומול/גרם) היו גבוהות בערך פי שניים מאלה של שלוש רקמות השריר האחרות, אם כי בניסוי הספציפי הזה ההבדלים האלה לא הגיעו למובהקות סטטיסטית (איור 6A). ריכוז הניטריט בשריר הגלוטאוס היה גם גבוה יותר מזה של שלוש רקמות השריר האחרות והיה גבוה משמעותית מזה שבדגימת גסטרוקנמיוס (איור 6B).

קבענו את מקדם השונות עבור כל שלוש השיטות בהן נעשה שימוש והתוצאות נמצאות בטבלה המצורפת. לשם השוואה, הטבלה מציגה גם מקדמי שונות שנקבעו על ידי Troutman et al21.

Figure 1
איור 1: הומוגנייזר סיבובי. (A) הומוגנייזר; (B) צינור המכיל רקמה ותמיסת עצירה. דגימות רקמת שריר השלד ממוקמות בצינור עם תמיסת עצירה מדוללת והומוגנית שלוש פעמים. דגימות יש להניח מיד על הקרח לאחר כל שלב הומוגניזציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הומוגנייזר חרוזים. (א) הומוגנייזר; (B) חרוזים המכילים צינור. דגימות רקמת שריר השלד ממוקמות בצינור המכיל חרוזים (5 חרוזים קרמיים) עם תמיסת עצירה מדוללת והומוגניות שלוש פעמים בסך הכל (45 שניות במהירות הגבוהה ביותר לכל פעם). דגימות יש להניח מיד על הקרח לאחר כל שלב הומוגניזציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: פולברייזר . (A) חלקי פולברייזר (B) גוף פולברייזר - טיט ומזיק מורכבים. (ג) פירוט מכלול המרגמות והמזיקים. חלקי פולברייזר מקוררים על קרח יבש במשך 30 דקות. חנקן נוזלי הוא הכניס לתוך טיט ולאחר מכן מראש שוקל רקמת שריר השלד הוא הוסיף. לאחר ש-90% מהחנקן הנוזלי נעלם, החלק העליון - המזיק - מוכנס לאגן. את המזיק הוא הלם עם mallet 5-6 פעמים עד הדגימה היא אבקתית. רקמת האבקה מועברת לאחר מכן לצינור עם תמיסת עצירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: (A) תוכן ניטראט ו-(B) ניטריט בהומוגנטים בשרירי גלוטאוס שהוכנו על-ידי שלוש שיטות הומוגניות שונות. חמישים מיליגרם של שריר גלוטאוס היו הומוגניים על ידי שלוש שיטות הומוגניזציה שונות. מתנול (500 μL) נוסף להומוגנטים כדי לזרז חלבונים. שיטת כימילומינסנציה סטנדרטית עם תמיסת ונדיום כלוריד או תלת-יודיד שימשה למדידת רמות חנקות וניטריטים, בהתאמה, בסופרנטנט השקוף לאחר צנטריפוגה; n=7 (חנקה); n=8 (ניטריט); הנתונים מוצגים כממוצעים ± SD, * p < 0.05 באמצעות ANOVA חד כיווני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: (A) תכולת ניטראט ו-(B) ניטריט בגדלים שונים של שריר גלוטאוס. שלושה גדלים שונים של הומוגניות שריר גלוטאוס הוכנו באמצעות הומוגנייזר חרוזים. שיטת כימילומינסנציה סטנדרטית עם תמיסת ונדיום כלוריד או תלת-יודיד שימשה למדידת רמות חנקות וניטריטים, בהתאמה, בסופרנטנט השקוף לאחר צנטריפוגה; n=7 (חנקה); n=8 (ניטריט); הנתונים מוצגים כממוצעים ± SD, אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: (A) תוכן ניטראט ו-(B) ניטריט בארבעה שרירים שונים. כל שריר (50 מ"ג) עבר הומוגניזציה באמצעות הומוגנייזר חרוזים, ושיטת כימילומינסנציה סטנדרטית עם תמיסת ונדיום כלוריד או טרי-יודיד שימשה למדידת רמות החנקות והניטריטים, בהתאמה; n=4-7 (חנקה); n=3-8 (ניטריט); הנתונים מוצגים כממוצעים ± SD, * p < 0.05 באמצעות ANOVA חד כיווני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי לעקוב אחר שינויים במטבוליטים NO, חנקות וניטריט, כפונקציה של התערבויות פיזיולוגיות, זה הכרחי כדי למדוד את רמות יונים אלה באיברים השונים כי הם קריטיים בחילוף החומרים שלהם. כמו המוגלובין בדם יגיב עם NO ואת המטבוליטים שלה, חשוב גם להסיר את הדם במהירות מדגימות רקמות ככל האפשר. לפיכך, בעלי חיים הוזלו במי מלח לפני שאספו רקמות שריר שלד (גלוטאוס, TA, EDL, שריר גסטרוקנמיוס), ורקמות חיבור ושומן סביב שריר המטרה הוסרו מיד. עבור תמיסת ההומוגניזציה, 'תמיסת עצירה' פותחה במיוחד עם פריקיאניד, NEM וחומרים פעילי שטח לא יוניים כדי לשמר ניטריט ברקמות שונות19. נוכחות של חומר ניקוי לא יוני היא קריטית לשיבוש מלא של קרומי התאים. במקרה של שתי מכונות ההומוגניזציה ששימשו במחקר זה, הומוגנייזר סיבובי והומוגנייזר חרוזים, נפח תמיסת העצירה הנדרשת להומוגניזציה היה פי 5 ממשקל הרקמה כך שהרקמה כולה הייתה שקועה במלואה בתמיסה ועובדה בצורה הומוגנית.

תהליך ההומוגניזציה בוצע שלוש פעמים בסך הכל (פעמיים לפני הוספת מתנול ופעם נוספת לאחר הוספת מתנול לזירוז חלבונים), בכל פעם באמצעות הגדרה מתוכנתת שנקבעה על ידי יצרני המכשירים. חשוב להניח דגימות על קרח מיד לאחר כל הומוגניזציה כדי למנוע הידרדרות דגימה על ידי חימום מתון, אשר עשוי להיווצר במהלך הומוגניזציה. עבור שיטת pulverization, דגימות רקמה נמחצו בתחילה לאבקה תוך שמירה על הקפאתן באמצעות חנקן נוזלי, ולאחר מכן דגימות היו מעורבבות עם תמיסת עצירה (5x משקל רקמה). בכל שלוש השיטות נוסף לדגימות מתנול (משקל רקמה של פי 10), והתערובת דוגרה על קרח במשך 30 דקות כדי לזרז חלבונים ולחלץ באופן מלא חנקות וניטריט מהרקמות. נוכחות של חלבונים במדגם יכול לגרום קצף מוגזם של פתרון התגובה בחדר בעת שימוש chemiluminescence, ולכן יש צורך לזרז חלבונים מן הדגימות. ניתן להשתמש בכל חומר משקעים, אך יש צורך לאשר כי חומרים כאלה לא יפריעו לשיטת chemiluminescence או לגרום לשינויים בריכוזי ניטריט / חנקות על ידי תגובה עם יונים אלה.

רמות החנקות בכל דגימות הגלוטאוס שהוכנו על ידי שלוש השיטות היו דומות מאוד (39.6-45.2 ננומול/גרם, איור 4A), מה שמרמז על כך ששלוש שיטות ההומוגניזציה האלה ישימות באותה מידה להכנת דגימות שרירים לניתוח חנקות. אף על פי שרמות הניטריט היו מעט גבוהות יותר בדגימות שהוכנו על ידי פולבריזציה בהשוואה לשתי השיטות האחרות (איור 4B), כל הערכים שנמדדו היו בטווח מוגבל (0.64-0.99 nmol/g). ההשפעה של גודל דגימת הרקמה על ערכי ניטראט וניטריט בדגימות שרירי השלד נבדקה מכיוון שחוקרים מתמודדים לעתים קרובות עם דגימות קטנות מאוד, במיוחד מחיות קטנות או ביופסיות שריר אנושיות. לא רמות החנקות ולא הניטריט היו שונות באופן משמעותי בטווח שבין 20 ל-200 מ"ג של רקמת שריר השלד בניסויים האלה (איור 5).

עם זאת, ראוי לציין שלמרות שאינן מובהקות סטטיסטית, רמות החנקות נוטות להיות מעט נמוכות יותר כאשר הן נמדדות בדגימות גדולות יותר (איור 5). שמנו לב לתופעה זו במהלך המחקרים שפורסמו ולא פורסמו, אך איננו מבינים את הסיבות לכך. לכן, כנראה שחשוב לקחת בחשבון את משקלי הדגימה ובאופן אידיאלי לשמור על עקביותם לאורך כל המחקר בעת הכנת הומוגנטים מדגימות רקמות מרובות. שיקול נוסף בעבודה עם דגימות קטנות יותר (20 מ"ג) הוא שהנפח הכולל הסופי של הדגימה המעובדת הוא רק ~ 300 μL, מה שמקטין באופן משמעותי את האפשרות למדוד את אותה דגימה מספר פעמים. עם זאת, במיוחד עבור מחקרים בבני אדם, 20 מ"ג הוא הגודל המקובל הרגיל עבור ביופסיות שריר.

כדי לבחון אם לשרירים שונים ברגלי חולדות תהיה תכולה שונה של ניטרט/ניטריט, הושווה הריכוזים של היונים האלה בארבעה שרירי רגליים שונים (איור 6). הן רמות הניטראט והן רמות הניטריט היו הגבוהות ביותר בשריר הגלוטאוס בהשוואה לשלוש רקמות שריר אחרות, אם כי ההבדלים לא הגיעו למובהקות סטטיסטית במחקר זה, מה שמרמז על כך שמטבוליזם של חנקות בסוגי שרירים שונים עשוי להיות נשלט באופן שונה. תופעה זו נחקרת ביתר פירוט כיום.

קבוצות מחקר אחרות דיווחו גם הן על ריכוזי חנקות בשרירי השלד, מה שחשף שונות משמעותית בערכים אלה. קבוצת קוגן הראתה כי רמות החנקות בשריר סולאוס החולדה של ספראג דאולי נעות בין 62 ל-124 ננומול/גרם, תלוי בשיטות הכנת השרירים21. אותה קבוצה דיווחה על ערכי חנקות ב-SD rat vastus lateralis (כ-60 ננומול/גרם) ובסולאוס (כ-215 ננומול/גרם) במחקר אחר23. Ohtake et al. מדדו ריכוזי חנקות בשריר גסטרוקנמיוס בעכבר של >300 ננומול/גרם; עם זאת, שיטות מדויקות להכנת שריר הומוגנט לא תוארו24. קבוצת Verdijk דיווחה על תכולת חנקות בביופסיות שריר אנושיות (vastus lateralis) שנעו בין 54 ל-80 ננומול/גרם, תלוי בגילהמשתתף 20; במחקר דומה, Wylie et al. מדווחים על 226 ננומול/גרם עבור אותה קבוצת שרירים17. תוצאות אלה מצביעות על כך שריכוזי החנקות/ניטריט בדגימות שרירי השלד משקפים גורמים רבים - פיזיולוגיים (למשל, מצב פעילות גופנית), סביבתיים (למשל, דיאטה) וטכניים (פרטי בדיקה) - כולם ככל הנראה תורמים לשונות המדידה.

קבענו את מקדם השונות (CV) עבור כל שלוש השיטות שהוצגו כאן - ראו קובץ משלים מצורף. גם אם קורות החיים רחוקים מלהיות אידיאליים, ומשתנים בין השיטות בהן נעשה שימוש, ערכי קורות החיים שלנו דומים לאלה שפורסמו על ידי Troutman et al. 21 תוך שימוש בשיטות דומות עם טיפול שונה בדגימות. למרבה הצער, עדיין אין הסבר ברור מדוע שונות כה גבוהה נמשכת; מאמר זה הוא הפרוטוקול המפורט היחיד שאנו מכירים לעיבוד דגימות שרירים לקביעת ניטראט וניטריט.

מדדנו גם ליניאריות ומידת ההתאוששות של חנקות מדגימות שרירים עם חרטום חנקתי (ראו קובץ משלים מצורף). כאשר הוספנו שלושה ריכוזים שונים של חנקות לדגימות גלוטאוס לצורך הומוגניזציה, השגנו תגובה ליניארית טובה בעלייה בריכוזי החנקות עם התאוששות של ~80% של חנקה נוספת הן עבור הומוגנייזרים חרוזים והן עבור הומוגנייזרים סיבוביים. תוצאות אלה מראות כי ניתן להשתמש בשתי שיטות ההומוגניזציה לקביעת רמות החנקות והניטריטים בדגימות ביולוגיות בביטחון טוב. אובדן של 20% מהחנקות הנוספות מתרחש ככל הנראה במהלך דה-פרוטאינטריזציה וצנטריפוגה של הומוגנט רקמת שריר, כאשר יונים מסוימים עשויים להיות מזרזים יחד עם חלבונים טעונים או חלקי תאים אחרים.

באופן כללי, אנו מקווים שהשיטה המוצעת שלנו להכנת דגימות שרירים למדידות של חנקות וניטריט תוכיח את עצמה כיעילה לא רק בתחום המחקר של פעילות גופנית, אלא גם למחקרים קליניים. ישנן הפרעות עצביות-שריריות ו/או מטבוליות המשפיעות על אוכלוסיות גדולות שעשויות להיות קשורות לתפקוד לקוי של מחזור תחמוצת החנקן ועשויות להפיק תועלת מאספקת חנקות. עם זאת, יש קודם כל לקבוע אם אין מחסור, למעשה, קיים ואם זה יכול להיות מתוקן על ידי התערבות תזונתיים. אנו מקווים שהשיטה המתוארת כאן תאפשר לעקוב אחר גורלם של חנקות ומטבוליטים אחרים של מחזור NO בשרירי השלד ובאיברים אחרים

אנו מודעים לכך שבשלב זה של התפתחותה, לשיטות של הכנת שרירי השלד למדידות ניטראט וניטריט באמצעות chemiluminescence (הכמותית ביותר מכל הקביעות של תחמוצות החנקן עצמן) יש עדיין משתנים לא ידועים, שחלקם נדונו לעיל. עם זאת, גם עם מגבלותיו, השיטות המתוארות מאפשרות השוואה מדויקת למדי של רמות חנקה/ניטריט של איברים שונים, כולל שרירי שלד שונים, ואמורות לאפשר ניסוח של השערות שניתן לבחון לאחר מכן בדיוק סביר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים. אלן נ 'שכטר רשום כממציא שותף על מספר פטנטים שהונפקו למכונים הלאומיים לבריאות לשימוש במלחי ניטריט לטיפול במחלות לב וכלי דם. הוא מקבל תמלוגים המבוססים על רישוי NIH של פטנטים אלה לפיתוח קליני אך ללא פיצוי אחר. הסדרים אלה אינם משפיעים על דבקותו במדיניות כתב העת JoVE.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH / NIDDK פנימי ZIA DK 0251041-14 לאלן נ שכטר, MD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
gentle MACS M tube Miltenyi Biotec 130-093-236 Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium Hospira NDC-0409-7620-13
Isoflurane Baxter NDC-10019-360-60
Methanol Sigma 646377
Minilys bead homogenizer Bertin Instruments P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide Sigma 4260
Nitric Oxide analyzer GE Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol Sigma 74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 Sigma 702587
Precellys lysing kit Bertin Instruments P000911-LYSK0-A contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit Cellcrusher Cellcrusher kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
  2. Moncada, S., Higgs, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).
  3. Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
  4. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  5. Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
  6. Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
  7. Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
  8. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
  9. Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
  10. Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
  11. Benjamin, N., et al. Stomach NO synthesis. Nature. 368 (6471), 502 (1994).
  12. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
  13. Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
  14. Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
  15. Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).
  16. Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
  17. Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
  18. Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
  19. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
  20. Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
  21. Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
  22. Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
  23. Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
  24. Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).

Tags

ביולוגיה גיליון 173 ניטרט ניטריט תחמוצת החנקן שרירי השלד הומוגניזציה של רקמות
הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, J. W., Thomas, S. M., Wylie,… More

Park, J. W., Thomas, S. M., Wylie, L. J., Jones, A. M., Vanhatalo, A., Schechter, A. N., Piknova, B. Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements. J. Vis. Exp. (173), e62427, doi:10.3791/62427 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter