Summary
Nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek ve karşılaştırmak için sıçan iskelet kası dokusunun dört farklı kas grubunun homojenizasyonu için üç farklı yöntem için protokoller sunuyoruz. Ayrıca, doku numune büyüklüğünün homojenizasyon sonuçlarını etkileyip etkilemediğini araştırmak için farklı numune ağırlıklarını karşılaştırıyoruz.
Abstract
Nitrat iyonlarının (NO3-) bir zamanlar nitrik oksit (NO) metabolizmasının inert son ürünleri olduğu düşünülüyordu. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, nitrat iyonlarının memelilerde iki aşamalı bir indirgeme mekanizması ile NO'ya geri dönüştürülebileceğini göstermiştir: nitrat, çoğunlukla oral kommensal bakteriler tarafından nitrite (NO2-) indirgenir, daha sonra nitrit, heme veya molibden içeren proteinler de dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar tarafından NO'ya indirgenir. Bu indirgeyici nitrat yolu, özellikle kardiyovasküler sistemde ve kas egzersizi sırasında NO-aracılı sinyal yolaklarının geliştirilmesine katkıda bulunur. Bu tür bir kullanımdan önce vücuttaki nitrat seviyeleri iki farklı kaynak tarafından belirlenir: endojen NO oksidasyonu ve diyet nitrat alımı, esas olarak bitkilerden. Fizyolojik koşullarda karmaşık NO döngüsünü aydınlatmak için, NO'ya kıyasla nispeten kararlı olan metabolitlerinin, nitrat ve nitrit iyonlarının dinamiklerini daha fazla inceledik. Önceki çalışmalarda iskelet kası, memelilerde nitrat iyonları için önemli bir depolama organı ve egzersiz sırasında doğrudan bir NO kaynağı olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, iskelet kasındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için güvenilir bir metodoloji oluşturmak önemlidir ve uygulamasının diğer doku örneklerine genişletilmesinde yardımcı olmalıdır. Bu yazıda, nitrat ve nitrit ölçümleri için üç farklı homojenizasyon yöntemi kullanılarak iskelet kası numunelerinin hazırlanması ayrıntılı olarak açıklanmakta ve numunelerin büyüklüğü de dahil olmak üzere homojenizasyon prosesleri ile ilgili önemli konular tartışılmaktadır. Nitrat ve nitrit konsantrasyonları da dört farklı kas grubunda karşılaştırılmıştır.
Introduction
Küçük bir gaz halindeki sinyal molekülü olan nitrik oksit (NO), fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerde kritik bir rol oynar1. NO, nitrik oksit sentaz (NOS) ailesinin endojen enzimleri tarafından L-arginin'den, nitrata (NO 3-) ve muhtemelen kandaki ve dokulardaki nitrite (NO 2-) hızlı oksidasyona uğramadan önce üretilebilir 2,3. Son zamanlarda, bu anyonların memeli sistemlerinde NO'ya geri indirgendiği gösterilmiştir4. Nitrat, esas olarak tükürük bezleri tarafından salgılanan ve doğrudan yutulan iyonlara etki eden ağız boşluğundaki kommensal bakteriyel nitrat redüktazları tarafından nitrite dönüştürülür 5 ve bir dereceye kadar ksantin oksidoredüktaz 6,7 gibi memeli enzimleri tarafından. Nitrit, deoksihemoglobin8, deoksimiyoglobin9, molibden içeren enzimler10 ve proton 11,12 varlığında enzimatik olmayan indirgeme dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalarla NO'ya daha da indirgenebilir.
Bu nitrat-nitrit-NO yolu, NOS aktivitesinin azaldığı hipoksik koşullar altında geliştirilir, çünkü NOS NO nesil4 için oksijen gerektirir. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, diyet nitratının kan basıncı regülasyonu ve egzersiz performansı üzerindeki yararlı etkilerini bildirmiştir, bu da nitrat azaltma yollarının NO sinyalinin 13,14,15'in artmasına katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. Önceki çalışmalar, bazı iskelet kaslarının muhtemelen vücuttaki başlıca nitrat depolama yerleri olduğunu göstermiştir16. Kan veya karaciğer gibi diğer iç organlarla karşılaştırıldığında, iskelet kası (gluteus maximus) önemli ölçüde daha yüksek nitrat seviyeleri içerir ve memeli vücudunda önemli bir kütleye sahiptir. Koşu bandı egzersizinin, bir sıçan modeli7'de nitrite ve gluteustaki NO'ya nitrat indirgemesini arttırdığı gösterilmiştir. Bu sonuçlar, bazı iskelet kaslarının fizyolojik durumlarda nitrat indirgeme yolları yoluyla NO için önemli kaynaklar olabileceğini düşündürmektedir. Daha yeni çalışmalar, egzersiz sırasında kas nitrat seviyelerindeki değişiklikler de dahil olmak üzere bu bulguların insanlarda da meydana geldiğini göstermektedir17.
Mevcut yazarlardan ikisi daha önce kan ve diğer sıvı numunelerdeki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için bir yöntem oluşturmuştu18. Bununla birlikte, bu anyonların doku homojenatlarındaki seviyeleri başlangıçta analiz edildiğinde, ayrıntılı protokoller mevcut değildi. Birkaç farklı organdaki nitrat-nitrit-NO dinamiklerini anlamak için amacımız, iskelet kası da dahil olmak üzere memeli dokularındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için doğru ve verimli bir yöntem geliştirmekti. Daha önceki çalışmalarda, güvenilir homojenizasyon prosesleri geliştirmek ve daha sonra bu homojenatlardaki nitrat ve nitrit içeriğini analiz etmek için kemirgen dokuları kullanıldı 7,16,19. Bu homojenizasyon yönteminin kullanımı, değerlerin doğrulandığı insan iskelet kası biyopsi örneklerine genişletildi ve daha da önemlisi, kas için kan / plazmaya kıyasla gözlemlenen değerler, kemirgenlerde gözlenenlere benzer aralıklarda ve oranlarda idi17. Son yıllarda, diğer gruplar da iskelet kası homojenatlarındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmeye başladı ve grubumuz20,21 tarafından bildirilenlerle karşılaştırılabilir değerler bildirdi.
Bu protokol belgesinin amacı, nitrat ve nitrit seviyelerinin daha sonraki ölçümleri için üç farklı homojenizasyon yöntemi kullanılarak iskelet kası homojenatlarının hazırlanmasını ayrıntılı olarak tanımlamaktır. Ayrıca homojenizasyon için kullanılan doku ağırlığının iskelet kası örneklerinde nitrat ve nitrit değerleri üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu yöntemlerin diğer memeli dokularına da rahatlıkla uygulanabileceğine inanıyoruz. Son yıllarda özellikle egzersiz fizyolojisi alanında kas gruplarına göre nitrat/nitrit/NO fizyolojisindeki olası farklılıklara dikkat çekilmiştir. Ayrıca dört farklı kemirgen kasındaki nitrat ve nitrit miktarlarını rapor ediyoruz ve her iki iyonun da bu farklı kaslar arasında eşit olmayan bir dağılımını buluyoruz; daha fazla çalışma gerektiren bir gözlem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan protokolü NIDDK Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ASP K049-MMB-20) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar, AAALAC web sitesinde ücretsiz olarak bulunan mevcut Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna göre ele alınmış ve tedavi edilmiştir.
1. Sıçan iskelet kası toplama
- Bir sıçan derin anestezi altındayken (% 5 izofluran, kuyruk / bacak sıkışmasına reaksiyon olmadan doğrulanır), sol ventrikülün tepesine 19 G'lik bir iğne yerleştirerek ve sağ atriyumda bir çentik yaparak heparin içeren salin ile perfüzyona başlayın. Heparinli salinin, dokudan en az 1,5 litre / kg akıncaya kadar iç organlardan nüfuz etmesine izin verin. Bu noktada, hayvanlar ekssanguinasyondan ölmüştür ve karkaslar numune toplama için işlenmeye hazırdır.
NOT: İyi perfüzyon elde etmek, özellikle nitritin doğru ölçümleri için kritik öneme sahiptir, çünkü nitrit, kalan herhangi bir hemoglobin tarafından nitrata oksitlenir. - Hedef kas dokularını tanımlayın ve temiz cerrahi aletler kullanarak bunları arka bacaklardan22 çıkarın. Kas dokularından mümkün olduğunca fazla yağ ve bağ dokusu çıkarın.
- İstenilen miktarda kası bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve ardından kuru buz üzerine yerleştirin. Doku ile doldurulmuş tüpleri -80 °C dondurucuda saklayın.
NOT: İnsan biyopsi örnekleri durumunda, fazla kanı gidermek için temiz gazlı bezle toplandıktan hemen sonra iyice lekeleyin.
2. Homojenizasyon için hazırlık
- Nitrit koruyucu çözeltinin hazırlanması (durdurma çözeltisi)
- Damıtılmış suda 890 mM potasyum ferrisiyanür (K3Fe (CN)6) ve 118 mM NEM (N-etilmaleimid) içeren berrak sarı bir çözelti hazırlayın ve kristal olmadığından emin olun. İyonik olmayan yüzey aktif maddeyi (deterjan) 1:9 oranında (v/v, Malzeme Tablosu) ekleyin ve köpüklenmeyi önlemek için hafifçe karıştırın.
- Durdurma çözeltisini damıtılmış su ile 1:9 oranında seyreltin. Seyreltilmiş durdurma çözeltisini (kas dokusunun seyreltilmiş durdurma çözeltisine 1:5 oranı) homojenizasyon tüpüne yerleştirin.
NOT: Yirmi miligram doku 100 μL durdurma çözeltisi gerektirecek ve 200 mg doku tüpte 1000 μL durdurma çözeltisi gerektirecektir. Ek çözeltide deterjan varlığı, hücre zarlarının bozulması için kritik öneme sahiptir. İyonik olmayan herhangi bir deterjan kullanılabilir, ancak kemilüminesans yöntemine müdahale etmediğini doğrulamak için dikkatli olunmalıdır.
- Doku hazırlama
- Dokuyu -80 °C dondurucudan çıkarın ve yavaşça buzda çözün. Kalan yağ ve bağ dokusunu iskelet kasından çıkarın. İskelet kası parçalarını kesin ve kuruması için gazlı bez üzerinde lekeleyin.
- Doku miktarını (20, 50 ve 200 mg) tartın. Önceden tartılmış iskelet kasını homojenizasyon tüplerindeki durdurma çözeltisine yerleştirin veya önceden tartılmış dokuyu daha sonra kullanmak üzere temiz bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
3. Homojenizasyon
- Döner homojenizatör (Şekil 1)
- Önceden tartılmış iskelet kasını ve önceden ölçülmüş durdurma çözeltisini içeren M tipi tüpü makineye yerleştirin. Her numuneyi iki kez homojenize edin (en yıkıcı homojenizasyon döngüsüne göre ayarlayın) ve tüpü her homojenizasyondan hemen sonra soğuması için 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
- 5 dakika boyunca 2.000 × g ve 4 °C'de kısaca santrifüj yapın. Tam tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve uygun miktarda metanol ekleyin (≥% 99.9, doku ağırlığının 10x'i). 15 s için iyice vorteks.
NOT: 20 mg doku için 200 μL metanol kullanın. Metanol, proteinleri doku homojenatından çökeltmek için kullanılır ve kemilüminesans yöntemine müdahale etmez. Başka bir protein çökeltme yöntemi kullanılıyorsa, kemilüminesans ile uyumluluğunu test edin. - Bir kez daha homojenize edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Numuneleri 4 °C'de 35 dakika ve 3.500 × g santrifüj yapın. Süper nantantı aspire edin ve nitrit / nitrat seviyelerini ölçün veya daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.
- Boncuk homojenizatörü (Şekil 2)
- İskelet kası dokusunu boncuk içeren bir tüpe yerleştirin (doku için 1:5 oranı: seyreltilmiş durdurma çözeltisi) ve kullanılan cihazda bulunan en yüksek hızda 45 s için iki kez homojenize edin. Her homojenizasyondan hemen sonra tüpü soğuması için 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
- 5 saniye boyunca küçük bir masaüstü santrifüj (2.000 x g) kullanarak kısaca santrifüj. Tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve uygun miktarda metanol ekleyin (saflık ≥% 99.9, doku ağırlığının 10 katı). 15 s için iyice vorteks.
NOT 1: 20 mg doku için 200 μL metanol kullanın.
NOT 2: Metanol, proteinleri doku homojenatından çökeltmek için kullanılır ve kemilüminesans yöntemine müdahale etmez. Başka bir protein çökeltme yöntemi kullanılıyorsa, kemilüminesans ile uyumluluğunu test edin. - Kullanılan cihazda bulunan en yüksek hızda 45 sn boyunca bir kez daha homojenize edin. 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. 17.000 x g, 4 °C, 30 dk'da santrifüj. Süper nantantı aspire edin ve nitrit / nitrat seviyelerini ölçün veya daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.
- Pulverizatör (Şekil 3)
- Seyreltilmiş durdurma çözeltisi (doku ağırlığının 5 katı) içeren tüpler hazırlayın ve tartın. Ağırlığı kaydedin (tüp + durdurma çözümü).
- Sıvı azot öğütücü aletini kuru buz üzerine yerleştirin ve istenen sıcaklığa ulaşması için yaklaşık 30 dakika bekleyin.
- Sıvı azotla soğutulmuş cımbız kullanarak, bir numuneyi (zaten ölçülen doku ağırlığı) pulverizatöre aktarın. Dokunun sıvı azot sıcaklığında olduğundan emin olmak için küçük bir kaşık sıvı azot ekleyin.
- Sıvı azotun% 95'i buharlaştıktan sonra, kırma aletini dokunun üstüne yerleştirin ve sıkıca bastırın. Örnek ezilmesini hissetmelisiniz. Tokmak kullanarak, kırma aletine 3-5x vurun.
- Sıvı azotla soğutulmuş bir kaşık kullanarak kalan parçalar için numuneyi kontrol edin. Sıvı azotta soğuduktan sonra, mendile dokunmadan önce donmuş suyu silmek için bir parça kağıt mendil kullanın. Bir parça varsa, merkeze taşıyın ve ardından tokmakla 5-6 kez daha vurun.
- Tüm numune toz haline getirildiğinde, ezilmiş dokuyu seyreltilmiş durdurma çözeltisini içeren önceden tartılmış tüpe doğrudan aktarmak için sıvı azot soğutmalı kaşığı kullanın (adım 3.3.1). Bu adımı hızlı bir şekilde uyguladığınızdan emin olun, çünkü ezilmiş iskelet kası ısındığında, yapışkan hale gelir ve aktarılması zorlaşır.
- 15 s. için vorteks. Tüpü açarak tüpün üst kısmında hiçbir doku sıkışmadığını kontrol edin. Varsa, yerinden çıkarmayı deneyin ve sonra tekrar vorteks.
- Küçük bir masaüstü santrifüj kullanarak numuneyi 2-3 sn santrifüj ile santrifüj yapın. Tüpü tekrar tartın. Orijinal tüp ağırlığını (adım 3.3.1) bu yeni ağırlıktan düşerek doku ağırlığını hesaplayın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin.
NOT: Tam ağırlıklar, tam doku ağırlığını ve pulverizasyon sırasında ne kadar doku kaybedildiğini belirlemeye yardımcı olacaktır. - Tüm numuneler adım 3.3.8'e kadar işlendikten sonra, uygun miktarda metanol ekleyin (≥% 99.9, doku ağırlığının 10 katı). 15 saniye boyunca iyice vorteks yapın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
NOT: 20 mg doku için 200 μL metanol kullanın. Metanol, proteinleri doku homojenatından çökeltmek için kullanılır ve kemilüminesans yöntemine müdahale etmez. Başka bir protein çökeltme yöntemi kullanılıyorsa, kemilüminesans ile uyumluluğunu test edin. - 17.000 × g, 4 °C, 30 dk. Süpernatantı aspire edin ve nitrit / nitrat seviyelerini ölçün veya daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.
4. Nitrik oksit analizörü (NOA) ile nitrit/nitrat ölçümü
- Tüm numuneleri yukarıda açıklanan üç farklı homojenizasyon yönteminden biriyle hazırlayın ve nitrat ve nitrit ölçümü için bir NOA'ya enjekte edin.
NOT: NOA kullanımı için ayrıntılı protokoller daha önceyayınlanmıştır 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temsili sonuçlar elde etmek için, 8 Wistar sıçanından (erkek ve dişiler, ağırlık 250 ± 50 g) iskelet kası dokuları kullanılmıştır. Sıçan iskelet kası homojenatları (her yöntem için 50 mg gluteus maximus kası) üç farklı homojenizasyon aracı (döner homojenizatör, boncuk homojenizatörü ve pulverizatör) ile hazırlanmıştır. Bu homojenatların nitrat ve nitrit içerikleri daha sonra bir nitrik oksit analizörü (NOA) kullanılarak belirlendi (Şekil 4). Bu üç homojenat numunesindeki nitrat seviyeleri (Şekil 4A), 39.6 ila 45.2 nmol / g arasında değişen birbirine çok benziyordu.
İlginç bir şekilde, bir öğütücü tarafından hazırlanan homojenat numunesindeki nitrit seviyeleri (Şekil 4B) en yüksek değeri (0.99 ± 0.15 nmol / g) gösterdi ve bu diğer iki numune değerinden istatistiksel olarak farklıydı. Dokuların büyüklüğünün homojenizasyon verimliliğini ve ortaya çıkan nitrat ve nitrit değerlerini etkileyip etkilemeyeceğini test etmek için, bir boncuk homojenizatörü tarafından homojenizasyon için üç farklı iskelet kası dokusu boyutu (20, 50 ve 200 mg'lık gluteus kas dokusu) kullanılmıştır (Şekil 5). Ne nitrat (Şekil 5A) ne de nitrit (Şekil 5B) seviyeleri kas örneklem büyüklükleri arasında anlamlı derecede farklı değildi. Bununla birlikte, numune büyüklüğü artırıldığında, belirsiz nedenlerden dolayı birden fazla deneyde biraz daha düşük nitrat konsantrasyonları gözlenmiştir.
Daha sonra, farklı kemirgen bacak iskelet kas dokularında nitrat ve nitrit seviyeleri ölçüldü (Şekil 6). Gluteus maximus kasına ek olarak, tibialis anterior (TA), ekstansör digitorum longus (EDL) ve gastroknemius kasları (her biri 50 mg) sıçan bacaklarından izole edildi ve bir boncuk homojenizatörü kullanılarak homojenize edildi. Şaşırtıcı bir şekilde, gluteus kasının nitrat seviyeleri (40.4 nmol / g), diğer üç kas dokusununkinden yaklaşık iki kat daha yüksekti, ancak bu özel deneyde bu farklılıklar istatistiksel anlamlılığa ulaşmadı (Şekil 6A). Gluteus kasındaki nitrit konsantrasyonu da diğer üç kas dokusundan daha yüksekti ve gastroknemius örneğindekinden anlamlı derecede yüksekti (Şekil 6B).
Kullanılan her üç yöntem için de varyasyon katsayısını belirledik ve sonuçlar ekli tabloda yer alıyor. Karşılaştırma için, tablo ayrıca Troutman ve ark.21 tarafından belirlenen varyasyon katsayılarını da göstermektedir.
Resim 1: Döner homojenizatör. (A) Homojenizatör; (B) doku ve durdurma çözeltisi içeren tüp. İskelet kası dokusu örnekleri, seyreltilmiş durdurma çözeltisi olan bir tüpe yerleştirilir ve üç kez homojenize edilir. Numuneler her homojenizasyon adımından sonra derhal buz üzerine yerleştirilmelidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Boncuk homojenizatörü. (A) Homojenizatör; (B) tüp içeren boncuklar. İskelet kası dokusu örnekleri, seyreltilmiş durdurma çözeltisi ile boncuk içeren bir tüpe (5 seramik boncuk) yerleştirilir ve toplamda üç kez homojenize edilir (her seferinde en yüksek hızda 45 sn). Numuneler her homojenizasyon adımından sonra derhal buz üzerine yerleştirilmelidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Pulverizatör . (A) öğütücü parçalar (B) öğütücü gövde - harç ve havane monte edilmiştir. (C) Harç ve havane tertibatının detayları. Öğütücü parçalar kuru buz üzerinde 30 dakika soğutulur. Sıvı azot harca konur ve daha sonra önceden tartılmış iskelet kası dokusu eklenir. Sıvı azotun yüzde 90'ı gittikten sonra, üst kısım - havane - havzaya yerleştirilir. Havane, numune toz haline gelene kadar 5-6 kez tokmak ile dövülür. Toz haline getirilmiş doku daha sonra durdurma çözeltisi içeren bir tüpe aktarılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: (A) Üç farklı homojenizasyon yöntemi ile hazırlanan gluteus kas homojenatlarındaki nitrat ve (B) nitrit içerikleri. Elli miligram gluteus kası üç farklı homojenizasyon yöntemi ile homojenize edildi. Proteinleri çökeltmek için homojenatlara metanol (500 μL) eklendi. Santrifüjleme sonrası berrak süpernatantta sırasıyla nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için vanadyum klorür veya tri-iyodür çözeltisi içeren standart bir kemilüminesans yöntemi kullanılmıştır; n=7 (nitrat); n=8 (nitrit); veriler tek yönlü ANOVA kullanılarak SD, * p ± 0.05 < ortalamalar olarak sunulmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: (A) Gluteus kasının farklı örnek boyutlarında nitrat ve (B) nitrit içeriği. Boncuk homojenizatörü kullanılarak üç farklı boyutta gluteus kas homojenatı hazırlandı. Santrifüjleme sonrası berrak süpernatantta sırasıyla nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için vanadyum klorür veya tri-iyodür çözeltisi içeren standart bir kemilüminesans yöntemi kullanılmıştır; n=7 (nitrat); n=8 (nitrit); veriler SD ± ortalamalar olarak sunulur, Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: (A) Dört farklı kasta nitrat ve (B) nitrit içeriği. Her kas (50 mg) bir boncuk homojenizatörü kullanılarak homojenize edildi ve sırasıyla nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için vanadyum klorür veya tri-iyodür çözeltisi ile standart bir kemilüminesans yöntemi kullanıldı; n = 4-7 (nitrat); n = 3-8 (nitrit); veriler tek yönlü ANOVA kullanılarak SD, * p ± 0.05 < ortalamalar olarak sunulmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NO metabolitleri, nitrat ve nitritteki değişiklikleri izlemek için, fizyolojik müdahalelerin bir fonksiyonu olarak, bu iyonların metabolizmalarında kritik olan farklı organlardaki seviyelerini ölçmek zorunludur. Kandaki hemoglobin NO ve metabolitleri ile reaksiyona gireceğinden, kanı doku örneklerinden mümkün olduğunca hızlı bir şekilde çıkarmak da önemlidir. Böylece iskelet kas dokuları (gluteus, TA, EDL, gastroknemius kası) toplanmadan önce hayvanlar salin ile perfüze edildi ve hedef kas etrafındaki bağ dokusu ve yağ derhal çıkarıldı. Homojenizasyon çözeltisi için, nitriti çeşitli dokularda korumak için ferrisiyanür, NEM ve iyonik olmayan yüzey aktif madde ile özel olarak bir 'durdurma çözeltisi' formüle edilmiştir19. İyonik olmayan deterjanın varlığı, hücre zarlarının tamamen bozulması için kritik öneme sahiptir. Bu çalışmada kullanılan iki homojenizasyon makinesinde, döner homojenizatör ve boncuk homojenizatöründe, homojenizasyon için gerekli durdurma çözeltisinin hacmi, doku ağırlığının 5 katı idi, böylece tüm doku çözeltiye tamamen batırıldı ve homojen bir şekilde işlendi.
Homojenizasyon işlemi, her seferinde cihaz üreticileri tarafından belirlenen programlanmış bir ayar kullanılarak toplamda üç kez (metanol eklemeden önce iki kez ve proteinleri çökeltmek için metanol eklendikten sonra bir kez daha) gerçekleştirildi. Homojenizasyon sırasında oluşabilecek hafif ısıtma nedeniyle numune bozulmasını önlemek için numunelerin her homojenizasyondan hemen sonra buz üzerine yerleştirilmesi önemlidir. Pulverizasyon yöntemi için, doku örnekleri başlangıçta sıvı azot kullanılarak dondurulmuş halde tutulurken toz haline getirildi, daha sonra numuneler durdurma çözeltisi (5x doku ağırlığı) ile karıştırıldı. Her üç yöntemde de, numunelere metanol (10x doku ağırlığı) eklendi ve karışım, proteinleri çökeltmek ve dokulardan nitrat ve nitriti tamamen çıkarmak için 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edildi. Numunedeki proteinlerin varlığı, kemilüminesans kullanıldığında odadaki reaksiyon çözeltisinin aşırı köpüklenmesine neden olabilir, bu nedenle proteinlerin numunelerden çökelmesi gerekir. Herhangi bir çökeltme maddesi kullanılabilir, ancak bu tür ajanların kemilüminesans yöntemine müdahale etmeyeceğini veya bu iyonlarla reaksiyona girerek nitrit / nitrat konsantrasyonlarında herhangi bir değişikliğe neden olmayacağını doğrulamak gerekir.
Üç yöntemle hazırlanan tüm gluteus numunelerindeki nitrat seviyeleri çok benzerdi (39.6-45.2 nmol/g, Şekil 4A), bu üç homojenizasyon yönteminin nitrat analizi için kas numuneleri hazırlamak için eşit derecede uygulanabilir olduğunu düşündürmektedir. Toz haline getirme ile hazırlanan örneklerde nitrit düzeyleri diğer iki yönteme göre biraz daha yüksek olmasına rağmen (Şekil 4B), ölçülen tüm değerler sınırlı bir aralıktaydı (0.64-0.99 nmol/g). İskelet kası örneklerinde doku örneklem büyüklüğünün nitrat ve nitrit değerleri üzerindeki etkisi incelenmiştir, çünkü araştırmacılar genellikle özellikle küçük hayvanlardan veya insan kas biyopsilerinden çok küçük örneklerle ilgilenmektedir. Bu deneylerde ne nitrat ne de nitrit seviyeleri, 20 ila 200 mg iskelet kası dokusu aralığında anlamlı olarak farklı değildi (Şekil 5).
Bununla birlikte, istatistiksel olarak anlamlı olmasa da, nitrat seviyelerinin daha büyük örneklerde ölçüldüğünde biraz daha düşük olma eğiliminde olduğu dikkat çekicidir (Şekil 5). Bu fenomeni yayınlanmış ve yayınlanmamış çalışmalarımız boyunca fark ettik, ancak bunun nedenlerini anlamıyoruz. Bu nedenle, numune ağırlıklarını dikkate almak ve ideal olarak birden fazla doku örneğinden homojenatlar hazırlarken bunları bir çalışma boyunca tutarlı tutmak muhtemelen önemlidir. Daha küçük numunelerle (20 mg) çalışırken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer husus, işlenmiş numunenin nihai toplam hacminin sadece ~ 300 μL olmasıdır, bu da aynı numuneyi birkaç kez ölçme olasılığını önemli ölçüde azaltır. Bununla birlikte, özellikle insan çalışmaları için, 20 mg, kas biyopsileri için olağan kabul edilebilir boyuttur.
Sıçan bacaklarındaki farklı kasların farklı nitrat / nitrit içeriğine sahip olup olmayacağını incelemek için, bu iyonların konsantrasyonları dört farklı bacak kasında karşılaştırılmıştır (Şekil 6). Hem nitrat hem de nitrit seviyeleri, gluteus kasında diğer üç kas dokusuna kıyasla en yüksekti, ancak farklılıklar bu çalışmada istatistiksel anlamlılığa ulaşmadı, bu da çeşitli kas tiplerinde nitrat metabolizmasının farklı şekilde yönetilebileceğini düşündürdü. Bu fenomen şu anda daha ayrıntılı olarak araştırılmaktadır.
Diğer araştırma grupları da iskelet kası nitrat konsantrasyonlarını bildirmiş ve bu değerlerde önemli değişkenlik olduğunu ortaya koymuştur. Coggan grubu, Sprague Dawley sıçan soleus kasındaki nitrat seviyelerinin, kas hazırlama yöntemlerine bağlı olarak 62 ila 124 nmol / g arasında değiştiğini göstermiştir21. Aynı grup, başka bir çalışmada SD sıçan vastus lateralis (yaklaşık 60 nmol / g) ve soleus (yaklaşık 215 nmol / g) nitrat değerleri bildirmiştir23. Ohtake ve ark. fare gastroknemius kasındaki nitrat konsantrasyonlarını >300 nmol / g olarak ölçtüler; Bununla birlikte, kas homojenatı hazırlığı için kesin yöntemler tanımlanmamıştır24. Verdijk grubu, insan kas biyopsilerinde (vastus lateralis) nitrat içeriğinin, katılımcının20 yaşına bağlı olarak 54 ila 80 nmol / g arasında değiştiğini bildirmiştir; Benzer bir çalışmada, Wylie ve ark. aynı kas grubu17 için 226 nmol / g bildirmiştir. Bu sonuçlar, iskelet kası örneklerindeki nitrat / nitrit konsantrasyonlarının, fizyolojik (örneğin, egzersiz durumu), çevresel (örneğin, diyet) ve teknik (tahlil ayrıntıları) gibi birçok faktörü yansıttığını ve bunların hepsinin muhtemelen ölçüm değişkenliğine katkıda bulunduğunu göstermektedir.
Burada sunulan her üç yöntem için değişkenlik katsayısını (CV) belirledik - ekteki ek dosyaya bakın. CV ideal olmaktan uzak olsa ve kullanılan yöntemler arasında farklılık gösterse bile, CV değerlerimiz Troutman ve ark. 21 tarafından farklı örneklerle benzer yöntemler kullanılarak yayınlananlarla karşılaştırılabilir. Ne yazık ki, bu kadar yüksek değişkenliğin neden devam ettiğine dair hala net bir açıklama yoktur; Bu makale, nitrat ve nitrit tayini için kas örneklerinin işlenmesi için bildiğimiz tek yayınlanmış ayrıntılı protokoldür.
Ayrıca nitrat çivili kas örneklerinden doğrusallığı ve nitrat geri kazanım derecesini ölçtük (ekteki ek dosyaya bakınız). Homojenizasyon için gluteus numunelerine üç farklı nitrat konsantrasyonu eklediğimizde, hem boncuk hem de döner homojenizatörler için ilave nitratın ~% 80 geri kazanımı ile nitrat konsantrasyonlarının arttırılmasında iyi bir doğrusal yanıt elde ettik. Bu sonuçlar, her iki homojenizasyon yönteminin de biyolojik numunelerdeki nitrat ve nitrit seviyelerinin güvenle belirlenmesi için kullanılabileceğini göstermektedir. Eklenen nitratın% 20'sinin kaybı, bazı iyonların yüklü proteinlerle veya diğer hücre parçalarıyla birlikte çökelebileceği kas dokusu homojenatının deproteinizasyonu ve santrifüjlenmesi sırasında meydana gelebilir.
Genel olarak, nitrat ve nitrit ölçümleri için önerilen kas örneği hazırlama yöntemimizin sadece egzersiz araştırma alanına değil, aynı zamanda klinik çalışmalara da yararlı olacağını umuyoruz. Büyük popülasyonları etkileyen, nitrik oksit döngüsünün arızalanmasıyla ilişkili olabilecek ve nitrat arzından fayda sağlayabilecek nöromüsküler ve / veya metabolik bozukluklar vardır. Bununla birlikte, öncelikle NO eksikliğinin gerçekten var olup olmadığını ve diyet müdahalesi ile düzeltilip düzeltilemeyeceğini belirlemek gerekir. Burada açıklanan yöntemin, nitratın ve NO döngüsünün diğer metabolitlerinin kaderinin iskelet kası ve diğer organlarda izlenmesini sağlayacağını umuyoruz.
Gelişiminin bu noktasında, kemilüminesans (azot oksitlerin kendilerinin tüm belirlemelerinin en niceliksel olanı) kullanılarak nitrat ve nitrit ölçümleri için iskelet kası hazırlama yöntemlerinin, bazıları yukarıda tartışılan bilinmeyen değişkenlere sahip olduğunun farkındayız. Bununla birlikte, sınırlamaları olsa bile, açıklanan yöntemler, farklı iskelet kasları da dahil olmak üzere farklı organların nitrat / nitrit seviyelerinin makul derecede doğru bir şekilde karşılaştırılmasına izin verir ve daha sonra makul bir doğrulukla test edilebilecek hipotezlerin formülasyonuna izin vermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Alan N. Schechter, kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde nitrit tuzlarının kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri'ne verilen çeşitli patentlerde ortak mucit olarak listelenmiştir. Klinik gelişim için bu patentlerin NIH lisansına dayanan telif hakları alır, ancak başka bir tazminat almaz. Bu düzenlemeler JoVE dergi politikalarına bağlılığını etkilemez.
Acknowledgments
Bu çalışma, Alan N Schechter, MD'ye intramural NIH / NIDDK hibe ZIA DK 0251041-14 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
References
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A.
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al.
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
