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Biology

नाइट्रेट और नाइट्राइट माप के लिए चूहे कंकाल की मांसपेशी होमोजेनेट्स की तैयारी

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62427
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 1
1Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, 2Sport and Health Sciences, College of Life and Environmental Sciences, St Luke’s Campus, University of Exeter
* These authors contributed equally

Summary

हम नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर को मापने और तुलना करने के लिए चूहे के कंकाल की मांसपेशी ऊतक के चार अलग-अलग मांसपेशी समूहों के समरूपीकरण के लिए तीन अलग-अलग तरीकों के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, हम यह जांचने के लिए विभिन्न नमूना भार की तुलना करते हैं कि ऊतक नमूना आकार समरूपीकरण के परिणामों को प्रभावित करता है या नहीं।

Abstract

नाइट्रेट आयनों (NO3-) को एक बार नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) चयापचय के निष्क्रिय अंत उत्पाद माना जाता था। हालांकि, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि नाइट्रेट आयनों को दो-चरणीय कमी तंत्र के माध्यम से स्तनधारियों में वापस एनओ में परिवर्तित किया जा सकता है: नाइट्रेट को नाइट्राइट (एनओ2-) में ज्यादातर मौखिक कॉमेंसल बैक्टीरिया द्वारा कम किया जाता है, फिर नाइट्राइट को कई तंत्रों द्वारा एनओ में कम किया जाता है, जिसमें हीम- या मोलिब्डेनम युक्त प्रोटीन शामिल हैं। यह रिडक्टिव नाइट्रेट मार्ग एनओ-मध्यस्थता सिग्नलिंग मार्गों को बढ़ाने में योगदान देता है, विशेष रूप से कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम में और मांसपेशियों के व्यायाम के दौरान। इस तरह के उपयोग से पहले शरीर में नाइट्रेट का स्तर दो अलग-अलग स्रोतों द्वारा निर्धारित किया जाता है: अंतर्जात एनओ ऑक्सीकरण और आहार नाइट्रेट का सेवन, मुख्य रूप से पौधों से। शारीरिक परिस्थितियों में जटिल एनओ चक्र को स्पष्ट करने के लिए, हमने इसके मेटाबोलाइट्स, नाइट्रेट और नाइट्राइट आयनों की गतिशीलता की जांच की है, जो एनओ की तुलना में अपेक्षाकृत स्थिर हैं। पिछले अध्ययनों में कंकाल की मांसपेशी को स्तनधारियों में नाइट्रेट आयनों के लिए एक प्रमुख भंडारण अंग के रूप में पहचाना गया था, साथ ही व्यायाम के दौरान एनओ का प्रत्यक्ष स्रोत भी था। इसलिए, कंकाल की मांसपेशियों में नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर को मापने के लिए एक विश्वसनीय पद्धति स्थापित करना महत्वपूर्ण है और अन्य ऊतक नमूनों में इसके आवेदन का विस्तार करने में सहायक होना चाहिए। यह पेपर नाइट्रेट और नाइट्राइट माप के लिए तीन अलग-अलग होमोजेनाइजेशन विधियों का उपयोग करके कंकाल की मांसपेशियों के नमूनों की तैयारी को विस्तार से बताता है और नमूनों के आकार सहित होमोजेनाइजेशन प्रक्रियाओं से संबंधित महत्वपूर्ण मुद्दों पर चर्चा करता है। नाइट्रेट और नाइट्राइट सांद्रता की तुलना चार अलग-अलग मांसपेशी समूहों में भी की गई है।

Introduction

नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ), एक छोटा गैसीय सिग्नलिंग अणु, शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाता है। नाइट्रेट (एनओ3-) और संभवतः, रक्तऔर ऊतकों में नाइट्राइट (एनओ 2-) में तेजी से ऑक्सीकरण से गुजरने से पहले नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (एनओएस) परिवार के अंतर्जातएंजाइमों द्वारा एल-आर्जिनिन से एनओ का उत्पादन किया जा सकता है। हाल ही में, इन आयनों को स्तनधारी प्रणालियों में वापस एनओ में कम दिखाया गयाहै। नाइट्रेट को नाइट्राइट में परिवर्तित किया जाता है, मुख्य रूप से मौखिक गुहा में कोमेंसल बैक्टीरियल नाइट्रेट रिडक्टेस द्वारा लार ग्रंथियों द्वारा स्रावित आयनों पर काम किया जाता है और सीधे 5, और कुछ हद तक, स्तनधारी एंजाइमों जैसे ज़ैंथिन ऑक्सीडोरडक्टेस 6,7 द्वारा निगला जाता है। नाइट्राइट को डीऑक्सीहीमोग्लोबिन8, डीऑक्सीमायोग्लोबिन9, मोलिब्डेनम युक्त एंजाइम 10, और प्रोटॉन11,12 की उपस्थिति में गैर-एंजाइमेटिक कमी सहित कईतंत्रों द्वारा एनओ में कम किया जा सकता है।

यह नाइट्रेट-नाइट्राइट-एनओ मार्ग हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत बढ़ाया जाता है जिसमें एनओएस गतिविधि कम हो जाती है क्योंकि एनओएस को एनओ पीढ़ी4 के लिए ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है। हाल के कई अध्ययनों ने रक्तचाप विनियमन और व्यायाम प्रदर्शन पर आहार नाइट्रेट के लाभकारी प्रभावों की सूचना दी है, यह सुझाव देते हुए कि नाइट्रेट में कमी के रास्ते एनओ सिग्नलिंग 13,14,15 की वृद्धि में योगदान करते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कुछ कंकाल की मांसपेशियां शरीर में प्रमुख नाइट्रेट भंडारण स्थान हैं। रक्त या यकृत जैसे अन्य आंतरिक अंगों की तुलना में, कंकाल की मांसपेशी (ग्लूटस मैक्सिमस) में नाइट्रेट का स्तर काफी अधिक होता है और स्तनधारी शरीर में पर्याप्त द्रव्यमान होता है। ट्रेडमिल व्यायाम को एक चूहे के मॉडल7 में नाइट्राइट में नाइट्रेट की कमी और ग्लूटस में एनओ को बढ़ाने के लिए दिखाया गया था। इन परिणामों का अर्थ है कि कुछ कंकाल की मांसपेशियां शारीरिक स्थितियों में नाइट्रेट में कमी के मार्गों के माध्यम से एनओ के लिए महत्वपूर्ण स्रोत हो सकती हैं। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि व्यायाम के दौरान मांसपेशियों के नाइट्रेट के स्तर में परिवर्तन सहित ये निष्कर्ष मनुष्यों में भी होतेहैं।

वर्तमान लेखकों में से दो ने पहले रक्त और अन्य तरल नमूनों में नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर को मापने के लिए एक विधि स्थापितकी थी। हालांकि, जब ऊतक होमोजेनेट्स में इन आयनों के स्तर का शुरू में विश्लेषण किया गया था, तो विस्तृत प्रोटोकॉल उपलब्ध नहीं थे। कई अलग-अलग अंगों में नाइट्रेट-नाइट्राइट-एनओ गतिशीलता को समझने के लिए, हमारा लक्ष्य कंकाल की मांसपेशियों सहित स्तनधारी ऊतकों में नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर को मापने के लिए एक सटीक और कुशल विधि विकसित करना था। पहले के अध्ययनों में, कृंतक ऊतकों का उपयोग विश्वसनीय समरूपीकरण प्रक्रियाओं को विकसित करने और फिर उन होमोजेनेट्स 7,16,19 में नाइट्रेट और नाइट्राइट सामग्री का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। इस होमोजेनाइजेशन विधि का उपयोग मानव कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी नमूनों तक बढ़ाया गया था, जिससे मूल्यों की पुष्टि की गई थी, और महत्वपूर्ण बात यह है कि रक्त / प्लाज्मा की तुलना में मांसपेशियों के लिए देखे गए मूल्य कृन्तकों में देखे गए समान सीमाओं औरअनुपातों में थे। हाल के वर्षों में, अन्य समूहों ने कंकाल की मांसपेशी होमोजेनेट्स में नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर को मापना शुरू कर दिया, जो हमारे समूह20,21 द्वारा रिपोर्ट किए गए लोगों के लिए तुलनीय मूल्यों की रिपोर्ट करते हैं।

इस प्रोटोकॉल पेपर का उद्देश्य नाइट्रेट और नाइट्राइट स्तरों के बाद के माप के लिए तीन अलग-अलग होमोजेनाइजेशन विधियों का उपयोग करके कंकाल की मांसपेशी होमोजेनेट्स की तैयारी का विस्तार से वर्णन करना है। इसके अतिरिक्त, कंकाल की मांसपेशियों के नमूनों में नाइट्रेट और नाइट्राइट के मूल्यों पर समरूपीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतक वजन के प्रभावों की जांच की गई। हम मानते हैं कि इन विधियों को आसानी से अन्य प्रकार के स्तनधारी ऊतकों पर लागू किया जा सकता है। हाल ही में, विशेष रूप से व्यायाम शरीर विज्ञान के क्षेत्र में, मांसपेशियों के समूहों के अनुसार नाइट्रेट / नाइट्राइट / एनओ फिजियोलॉजी में संभावित अंतर पर ध्यान दिया गया था। हम चार अलग-अलग कृंतक मांसपेशियों में नाइट्रेट और नाइट्राइट की मात्रा की भी रिपोर्ट करते हैं और इन विभिन्न मांसपेशियों के बीच दोनों आयनों का एक असमान वितरण पाते हैं; एक अवलोकन जिसके लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता होती है।

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Protocol

पशु प्रोटोकॉल को एनआईडीडीके पशु देखभाल और उपयोग समिति (एएसपी के049-एमएमबी -20) द्वारा अनुमोदित किया गया था। जानवरों को एएएएलएसी वेबसाइट पर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए वर्तमान गाइड के अनुसार संभाला और इलाज किया गया था।

1. चूहे कंकाल की मांसपेशी संग्रह

  1. जबकि एक चूहा गहरे संज्ञाहरण (5% आइसोफ्लुरेन, पूंछ / पैर की चुटकी की अनुपस्थित प्रतिक्रिया से पुष्टि की जाती है) के तहत होता है, बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष में 19 ग्राम सुई रखकर और दाएं आलिंद पर निक बनाकर हेपरिन युक्त खारा के साथ छिड़काव शुरू करें। हेपरिन के साथ खारा को आंतरिक अंगों के माध्यम से फैलने दें जब तक कि ऊतक के माध्यम से कम से कम 1.5 लीटर / किलोग्राम प्रवाहित न हो जाए। इस बिंदु पर, जानवर उत्सर्जन से मर चुके हैं और शव नमूना संग्रह के लिए संसाधित होने के लिए तैयार हैं।
    नोट: अच्छा छिड़काव प्राप्त करना महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से नाइट्राइट के सटीक माप के लिए, क्योंकि नाइट्राइट को किसी भी शेष हीमोग्लोबिन द्वारा नाइट्रेट में ऑक्सीकरण किया जाता है।
  2. लक्षित मांसपेशियों के ऊतकों की पहचान करें और उन्हें साफ शल्य चिकित्सा उपकरणोंका उपयोग करके पिछले पैरों से निकालें। मांसपेशियों के ऊतकों से जितना संभव हो उतना वसा और संयोजी ऊतकों को हटा दें।
  3. मांसपेशियों की वांछित मात्रा को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें और फिर सूखी बर्फ पर रखें। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ऊतक से भरे ट्यूबों को स्टोर करें।
    नोट: मानव बायोप्सी नमूनों के मामले में, अतिरिक्त रक्त को हटाने के लिए साफ धुंध के साथ संग्रह पर तुरंत उन्हें अच्छी तरह से धब्बा दें।

2. होमोजेनाइजेशन की तैयारी

  1. नाइट्राइट-संरक्षण समाधान की तैयारी (स्टॉप समाधान)
    1. आसुत जल में 890 एमएम पोटेशियम फेरिसाइनाइड (के3एफई (सीएन)6) और 118 एमएम एनईएम (एन-एथिलमेलीमाइड) युक्त एक स्पष्ट पीला घोल तैयार करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई क्रिस्टल न हो। 1: 9 अनुपात (v / v, सामग्री की तालिका) में गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट (डिटर्जेंट) जोड़ें, और फोमिंग से बचने के लिए धीरे से मिलाएं।
    2. आसुत जल के साथ स्टॉप समाधान को 1: 9 अनुपात में पतला करें। होमोजेनाइजेशन ट्यूब में पतला स्टॉप समाधान (मांसपेशियों के ऊतकों का पतला स्टॉप समाधान का 1: 5 अनुपात) रखें।
      नोट: बीस मिलीग्राम ऊतक को 100 μL स्टॉप समाधान की आवश्यकता होगी, और 200 मिलीग्राम ऊतक को ट्यूब में 1000 μL स्टॉप समाधान की आवश्यकता होगी। कोशिका झिल्ली के विघटन के लिए अतिरिक्त समाधान में डिटर्जेंट की उपस्थिति महत्वपूर्ण है। किसी भी गैर-आयनिक डिटर्जेंट का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह सत्यापित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि यह केमिलुमिनेसेंस विधि में हस्तक्षेप नहीं करता है।
  2. ऊतक तैयार करना
    1. ऊतक को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बाहर निकालें और धीरे-धीरे बर्फ में पिघल जाएं। कंकाल की मांसपेशियों से शेष वसा और संयोजी ऊतक को हटा दें। कंकाल की मांसपेशियों के टुकड़ों को काट दें और धुंध पर धब्बा सूखने के लिए।
    2. ऊतक (20, 50 और 200 मिलीग्राम) की मात्रा का वजन करें। होमोजेनाइजेशन ट्यूबों में स्टॉप-सॉल्यूशन में पूर्व-वजन वाली कंकाल की मांसपेशी रखें या बाद में उपयोग के लिए एक साफ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पूर्व-वजन वाले ऊतक को रखें।

3. होमोजेनाइजेशन

  1. रोटरी होमोजेनाइज़र (चित्र 1)
    1. मशीन में पूर्व-वजन वाले कंकाल की मांसपेशी और पूर्व-मापा स्टॉप समाधान युक्त एम-टाइप ट्यूब रखें। प्रत्येक नमूने को दो बार समरूप करें (सबसे विनाशकारी समरूपीकरण चक्र पर सेटिंग) और प्रत्येक समरूपीकरण के तुरंत बाद ट्यूब को बर्फ पर 5 मिनट के लिए ठंडा करें।
    2. सेंट्रीफ्यूज संक्षेप में 2,000 × ग्राम और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। पूर्ण ट्यूब को बर्फ पर वापस रखें और मेथनॉल की उचित मात्रा जोड़ें (≥ 99.9%, ऊतक वजन का 10 गुना)। 15 सेकंड के लिए भंवर अच्छी तरह से।
      नोट: 20 मिलीग्राम ऊतक के लिए, मेथनॉल के 200 μL का उपयोग करें। मेथनॉल का उपयोग ऊतक होमोजेनेट से प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए किया जाता है और केमिल्यूमिनेसेंस विधि में हस्तक्षेप नहीं करता है। यदि अन्य प्रोटीन वर्षा विधि का उपयोग किया जाता है, तो केमिलुमिनेसेंस के साथ इसकी संगतता का परीक्षण करें।
    3. एक बार फिर से समरूप करें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस और 3,500 × ग्राम पर 35 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और नाइट्राइट / नाइट्रेट के स्तर को मापें, या बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. बीड होमोजेनाइज़र (चित्र 2)
    1. कंकाल की मांसपेशी ऊतक को एक मोती युक्त ट्यूब (ऊतक के लिए 1: 5 अनुपात: पतला स्टॉप समाधान) में रखें और उपयोग किए गए उपकरण पर उपलब्ध उच्चतम गति पर 45 सेकंड के लिए दो बार समरूप करें। प्रत्येक होमोजेनाइजेशन के तुरंत बाद ट्यूब को बर्फ पर 5 मिनट के लिए ठंडा करने के लिए रखें।
    2. 5 सेकंड के लिए एक छोटे डेस्कटॉप सेंट्रीफ्यूज (2,000 x g) का उपयोग करके संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज। ट्यूब को बर्फ पर वापस रखें और मेथनॉल की उचित मात्रा जोड़ें (शुद्धता ≥ 99.9%, ऊतक वजन का 10 गुना)। 15 सेकंड के लिए भंवर अच्छी तरह से।
      नोट 1: 20 मिलीग्राम ऊतक के लिए, मेथनॉल के 200 μL का उपयोग करें।
      नोट 2: मेथनॉल का उपयोग ऊतक होमोजेनेट से प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए किया जाता है और केमिलुमिनेसेंस विधि में हस्तक्षेप नहीं करता है। यदि अन्य प्रोटीन वर्षा विधि का उपयोग किया जाता है, तो केमिलुमिनेसेंस के साथ इसकी संगतता का परीक्षण करें।
    3. उपयोग किए गए उपकरण पर उपलब्ध उच्चतम गति पर 45 सेकंड के लिए एक बार फिर समरूप करें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। सेंट्रीफ्यूज 17,000 x g, 4 °C, 30 मिनट पर। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और नाइट्राइट / नाइट्रेट के स्तर को मापें, या बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. पुल्वेराइज़र (चित्र 3)
    1. पतला स्टॉप समाधान (ऊतक वजन का 5 गुना) युक्त ट्यूब तैयार करें और उन्हें तौलें। वजन रिकॉर्ड करें (ट्यूब + स्टॉप समाधान)।
    2. तरल नाइट्रोजन पुल्वेराइज़र उपकरण को सूखी बर्फ पर रखें और वांछित तापमान तक पहुंचने के लिए लगभग 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    3. तरल नाइट्रोजन में ठंडा चिमटी का उपयोग करके, एक नमूना (ऊतक वजन पहले से मापा गया) को पल्वराइज़र में स्थानांतरित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए तरल नाइट्रोजन का एक छोटा चम्मच जोड़ें कि ऊतक तरल नाइट्रोजन तापमान पर है।
    4. तरल नाइट्रोजन का 95% वाष्पीकृत होने के बाद, क्रशिंग टूल को ऊतक के शीर्ष पर रखें, और दृढ़ता से दबाएं। आपको नमूना क्रश महसूस करना चाहिए। मैलेट का उपयोग करके, क्रशिंग टूल को 3-5x पर प्रहार करें।
    5. तरल नाइट्रोजन में ठंडा चम्मच का उपयोग करके किसी भी शेष खंड के लिए नमूने की जांच करें। तरल नाइट्रोजन में ठंडा होने के बाद, ऊतक को छूने से पहले किसी भी जमे हुए पानी को पोंछने के लिए टिशू पेपर के एक टुकड़े का उपयोग करें। यदि एक टुकड़ा मौजूद है, तो इसे केंद्र में ले जाएं, और फिर मैलेट के साथ 5-6 बार और प्रहार करें।
    6. जब पूरे नमूने को पल्वराइज्ड किया गया है, तो तरल नाइट्रोजन-कूल्ड चम्मच का उपयोग करके कुचल ऊतक को सीधे पतला स्टॉप समाधान (चरण 3.3.1) युक्त पूर्व-तौलित ट्यूब में स्थानांतरित किया जा सके। इस चरण को जल्दी से करना सुनिश्चित करें क्योंकि जब कुचल कंकाल की मांसपेशी गर्म हो जाती है, तो यह चिपचिपा हो जाता है और स्थानांतरित करना मुश्किल हो जाता है।
    7. 15 सेकंड के लिए भंवर। ट्यूब को खोलकर जांचें कि कोई ऊतक ट्यूब के शीर्ष पर नहीं फंसा है। यदि ऐसा है, तो इसे हटाने की कोशिश करें और फिर भंवर फिर से।
    8. एक छोटे डेस्कटॉप सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 2-3 सेकंड के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। ट्यूब को फिर से तौलें। इस नए वजन से मूल ट्यूब वजन (चरण 3.3.1) को घटाकर ऊतक के वजन की गणना करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें।
      नोट: सटीक वजन सटीक ऊतक वजन निर्धारित करने में मदद करेगा और पुल्वराइजेशन के दौरान कितना ऊतक खो गया था।
    9. एक बार जब सभी नमूने चरण 3.3.8 तक संसाधित हो जाते हैं, तो मेथनॉल की उचित मात्रा जोड़ें (≥ 99.9%, ऊतक वजन का 10 गुना)। भंवर 15 सेकंड के लिए अच्छी तरह से, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेने।
      नोट: 20 मिलीग्राम ऊतक के लिए, मेथनॉल के 200 μL का उपयोग करें। मेथनॉल का उपयोग ऊतक होमोजेनेट से प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए किया जाता है और केमिल्यूमिनेसेंस विधि में हस्तक्षेप नहीं करता है। यदि अन्य प्रोटीन वर्षा विधि का उपयोग किया जाता है, तो केमिलुमिनेसेंस के साथ इसकी संगतता का परीक्षण करें।
    10. सेंट्रीफ्यूज 17,000 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट। नाइट्रेट के स्तर को मापें, या बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

नाइट्रिक ऑक्साइड विश्लेषक (एनओए) के साथ नाइट्राइट / नाइट्रेट माप

  1. ऊपर वर्णित तीन अलग-अलग होमोजेनाइजेशन विधियों में से किसी एक द्वारा सभी नमूने तैयार करें और उन्हें नाइट्रेट और नाइट्राइट माप के लिए एनओए में इंजेक्ट करें।
    नोट: एनओए उपयोग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल पहलेप्रकाशित किए गए थे।

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Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त करने के लिए, 8 विस्टार चूहों (पुरुषों और महिलाओं, वजन 250 ± 50 ग्राम) से कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों का उपयोग किया गया था। चूहे के कंकाल की मांसपेशी होमोजेनेट्स (प्रत्येक विधि के लिए 50 मिलीग्राम ग्लूटस मैक्सिमस मांसपेशी) तीन अलग-अलग होमोजेनाइज़र उपकरणों (रोटरी होमोजेनाइज़र, बीड होमोजेनाइज़र और पल्वराइज़र) द्वारा तैयार किए गए थे। इन होमोजेनेट्स की नाइट्रेट और नाइट्राइट सामग्री को तब नाइट्रिक ऑक्साइड विश्लेषक (एनओए) (चित्रा 4) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। उन तीन होमोजेनेट नमूनों में नाइट्रेट का स्तर (चित्रा 4 ए) एक दूसरे के समान था, जो 39.6 से 45.2 एनएमओएल / जी तक था।

दिलचस्प बात यह है कि एक पल्वराइज़र द्वारा तैयार किए गए होमोजेनेट नमूने में नाइट्राइट स्तर (चित्रा 4 बी) ने उच्चतम मूल्य (0.99 ± 0.15 एनएमओएल / जी) दिखाया, और यह सांख्यिकीय रूप से दो अन्य नमूना मूल्यों से अलग था। यह जांचने के लिए कि क्या ऊतकों का आकार समरूपीकरण दक्षता और परिणामस्वरूप नाइट्रेट और नाइट्राइट मूल्यों को प्रभावित करेगा, तीन अलग-अलग कंकाल की मांसपेशी ऊतक आकार (20, 50 और 200 मिलीग्राम के ग्लूटस मांसपेशी ऊतक) का उपयोग एक मोती होमोजेनाइज़र द्वारा समरूपीकरण के लिए किया गया था (चित्रा 5)। मांसपेशियों के नमूने के आकार के बीच न तो नाइट्रेट (चित्रा 5 ए) और न ही नाइट्राइट (चित्रा 5 बी) का स्तर काफी भिन्न था। हालांकि, नमूना आकार में वृद्धि होने पर थोड़ा कम नाइट्रेट सांद्रता देखी गई, कई प्रयोगों में स्पष्ट कारणों से।

इसके बाद, विभिन्न प्रकार के कृंतक पैर कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों में नाइट्रेट और नाइट्राइट का स्तर मापा गया (चित्रा 6)। ग्लूटस मैक्सिमस मांसपेशी के अलावा, टिबियलिस एंटीरियर (टीए), एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल), और गैस्ट्रोकेनेमस मांसपेशियों (प्रत्येक 50 मिलीग्राम) को चूहे के पैरों से अलग किया गया और एक मोती होमोजेनाइज़र का उपयोग करके समरूप किया गया। आश्चर्यजनक रूप से, ग्लूटस मांसपेशी (40.4 एनएमओएल / जी) के नाइट्रेट का स्तर अन्य तीन मांसपेशी ऊतकों की तुलना में लगभग दो गुना अधिक था, हालांकि इस विशेष प्रयोग में ये अंतर सांख्यिकीय महत्व तक नहीं पहुंचे (चित्रा 6 ए)। ग्लूटस मांसपेशियों में नाइट्राइट एकाग्रता अन्य तीन मांसपेशी ऊतकों की तुलना में भी अधिक थी और गैस्ट्रोकेनेमस नमूने (चित्रा 6 बी) की तुलना में काफी अधिक थी।

हमने उपयोग की जाने वाली सभी तीन विधियों के लिए भिन्नता का गुणांक निर्धारित किया और परिणाम संलग्न तालिका में हैं। तुलना के लिए, तालिका ट्राउटमैन एट अल21 द्वारा निर्धारित भिन्नता के गुणांक भी दिखाती है।

Figure 1
चित्र 1: रोटरी होमोजेनाइज़र। (ए) होमोजेनाइज़र; (बी) ट्यूब जिसमें ऊतक और स्टॉप समाधान होता है। कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों के नमूने पतला स्टॉप समाधान के साथ एक ट्यूब में रखे जाते हैं और तीन बार समरूप होते हैं। प्रत्येक होमोजेनाइजेशन चरण के बाद नमूने तुरंत बर्फ पर रखे जाने चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: मोती होमोजेनाइज़र। (ए) होमोजेनाइज़र; (बी) ट्यूब युक्त मोती। कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों के नमूने एक मोती युक्त ट्यूब (5 सिरेमिक मोती) में पतला स्टॉप समाधान के साथ रखे जाते हैं और कुल मिलाकर तीन बार समरूप होते हैं (प्रत्येक बार के लिए उच्चतम गति पर 45 एस)। प्रत्येक होमोजेनाइजेशन चरण के बाद नमूने तुरंत बर्फ पर रखे जाने चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: पुल्वराइज़र ( ए) पुल्वराइज़र पार्ट्स (बी) पुल्वराइज़र बॉडी - मोर्टार और मूसल इकट्ठे। (ग) मोर्टार और मूसल संयोजन का विवरण। पुल्वेराइज़र भागों को सूखी बर्फ पर 30 मिनट के लिए ठंडा किया जाता है। तरल नाइट्रोजन को मोर्टार में डाला जाता है और फिर पूर्व-तौला कंकाल की मांसपेशी ऊतक जोड़ा जाता है। तरल नाइट्रोजन का 90 प्रतिशत हिस्सा चले जाने के बाद, शीर्ष भाग - मूसल - बेसिन में डाला जाता है। मूसल को 5-6 बार मैलेट के साथ पाउंड किया जाता है जब तक कि नमूना पाउडर न हो जाए। पाउडर ऊतक को तब स्टॉप समाधान के साथ एक ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: (ए) नाइट्रेट और (बी) ग्लूटस मांसपेशी होमोजेनेट्स में नाइट्राइट सामग्री तीन अलग-अलग होमोजेनाइजेशन विधियों द्वारा तैयार की जाती है। ग्लूटस मांसपेशियों के पचास मिलीग्राम को तीन अलग-अलग होमोजेनाइजेशन विधियों द्वारा समरूप किया गया था। प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए होमोजेनेट्स में मेथनॉल (500 μL) जोड़ा गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद स्पष्ट सुपरनैटेंट में क्रमशः नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर को मापने के लिए वैनेडियम क्लोराइड या ट्राई-आयोडाइड समाधान के साथ एक मानक केमिलुमिनेसेंस विधि का उपयोग किया गया था; एन = 7 (नाइट्रेट); एन = 8 (नाइट्राइट); डेटा को एक तरफा एनोवा ± उपयोग करके एसडी, * पी < 0.05 के औसत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: (ए) नाइट्रेट और (बी) ग्लूटस मांसपेशियों के विभिन्न नमूना आकारों में नाइट्राइट सामग्री। एक मोती होमोजेनाइज़र का उपयोग करके ग्लूटस मांसपेशी होमोजेनेट्स के तीन अलग-अलग आकार तैयार किए गए थे। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद स्पष्ट सुपरनैटेंट में क्रमशः नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर को मापने के लिए वैनेडियम क्लोराइड या ट्राई-आयोडाइड समाधान के साथ एक मानक केमिलुमिनेसेंस विधि का उपयोग किया गया था; एन = 7 (नाइट्रेट); एन = 8 (नाइट्राइट); डेटा एसडी ± औसत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: (ए) नाइट्रेट और (बी) नाइट्राइट सामग्री चार अलग-अलग मांसपेशियों में। प्रत्येक मांसपेशी (50 मिलीग्राम) को एक मोती होमोजेनाइज़र का उपयोग करके समरूप किया गया था, और क्रमशः नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर को मापने के लिए वैनेडियम क्लोराइड या ट्राई-आयोडाइड समाधान के साथ एक मानक केमिलुमिनेसेंस विधि का उपयोग किया गया था; एन = 4-7 (नाइट्रेट); एन = 3-8 (नाइट्राइट); डेटा को एक तरफा एनोवा ± उपयोग करके एसडी, * पी < 0.05 के औसत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

शारीरिक हस्तक्षेप के कार्य के रूप में एनओ मेटाबोलाइट्स, नाइट्रेट और नाइट्राइट में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए, विभिन्न अंगों में इन आयनों के स्तर को मापना अनिवार्य है जो उनके चयापचय में महत्वपूर्ण हैं। चूंकि रक्त में हीमोग्लोबिन एनओ और इसके मेटाबोलाइट्स के साथ प्रतिक्रिया करेगा, इसलिए ऊतक के नमूनों से रक्त को जल्दी से निकालना भी महत्वपूर्ण है। इस प्रकार जानवरों को कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों (ग्लूटस, टीए, ईडीएल, गैस्ट्रोकेनेमस मांसपेशी) को इकट्ठा करने से पहले खारा के साथ संक्रमित किया गया था, और लक्ष्य मांसपेशियों के आसपास संयोजी ऊतक और वसा को तुरंत हटा दिया गया था। होमोजेनाइजेशन समाधान के लिए, विभिन्न ऊतकों में नाइट्राइट को संरक्षित करने के लिए विशेष रूप से फेरिसाइनाइड, एनईएम और गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट के साथ एक 'स्टॉप समाधान' तैयारकिया गया था। गैर-आयनिक डिटर्जेंट की उपस्थिति कोशिका झिल्ली के पूर्ण विघटन के लिए महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली दो होमोजेनाइज़ेशन मशीनों, रोटरी होमोजेनाइज़र और बीड होमोजेनाइज़र के मामले में, होमोजेनाइजेशन के लिए आवश्यक स्टॉप समाधान की मात्रा ऊतक वजन का 5 गुना थी ताकि पूरे ऊतक को घोल में पूरी तरह से डुबोया जा सके और सजातीय रूप से संसाधित किया जा सके।

होमोजेनाइजेशन प्रक्रिया कुल मिलाकर तीन बार की गई थी (मेथनॉल जोड़ने से पहले दो बार और प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए मेथनॉल जोड़ने के बाद एक और बार), हर बार उपकरण निर्माताओं द्वारा निर्धारित प्रोग्राम की गई सेटिंग का उपयोग करके। हल्के हीटिंग द्वारा नमूना गिरावट को रोकने के लिए प्रत्येक समरूपीकरण के तुरंत बाद बर्फ पर नमूने रखना महत्वपूर्ण है, जो होमोजेनाइजेशन के दौरान उत्पन्न हो सकता है। पल्वराइजेशन विधि के लिए, ऊतक के नमूनों को शुरू में तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके जमे हुए रखते हुए पाउडर में कुचल दिया गया था, फिर नमूनों को स्टॉप समाधान (5x ऊतक वजन) के साथ मिलाया गया था। सभी तीन तरीकों में, नमूनों में मेथनॉल (10x ऊतक वजन) जोड़ा गया था, और मिश्रण को प्रोटीन को अवक्षेपित करने और ऊतकों से नाइट्रेट और नाइट्राइट को पूरी तरह से निकालने के लिए 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट किया गया था। नमूने में प्रोटीन की उपस्थिति केमिल्यूमिनेसेंस का उपयोग करते समय कक्ष में प्रतिक्रिया समाधान के अत्यधिक फोमिंग का कारण बन सकती है, इसलिए नमूनों से प्रोटीन को अवक्षेपित करना आवश्यक है। किसी भी वर्षा एजेंट का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह पुष्टि करना आवश्यक है कि ऐसे एजेंट या तो केमिलुमिनेसेंस विधि में हस्तक्षेप नहीं करेंगे या इन आयनों के साथ प्रतिक्रिया करके नाइट्राइट / नाइट्रेट सांद्रता में कोई बदलाव नहीं करेंगे।

तीन विधियों द्वारा तैयार किए गए सभी ग्लूटस नमूनों में नाइट्रेट का स्तर बहुत समान था (39.6-45.2 एनएमओएल / जी, चित्रा 4 ए), यह सुझाव देते हुए कि ये तीन समरूपीकरण विधियां नाइट्रेट विश्लेषण के लिए मांसपेशियों के नमूने तैयार करने के लिए समान रूप से लागू होती हैं। यद्यपि नाइट्राइट का स्तर दो अन्य तरीकों (चित्रा 4 बी) की तुलना में पुल्वराइजेशन द्वारा तैयार किए गए नमूनों में थोड़ा अधिक था, सभी मापा मान एक सीमित सीमा (0.64-0.99 एनएमओएल / जी) में थे। कंकाल की मांसपेशियों के नमूनों में नाइट्रेट और नाइट्राइट मूल्यों पर ऊतक के नमूने के आकार के प्रभाव की जांच की गई क्योंकि शोधकर्ता अक्सर बहुत छोटे नमूनों से निपटते हैं, विशेष रूप से छोटे जानवरों या मानव मांसपेशी बायोप्सी से। इन प्रयोगों में कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों के 20 से 200 मिलीग्राम की सीमा में न तो नाइट्रेट और न ही नाइट्राइट का स्तर काफी भिन्न था (चित्रा 5)।

हालांकि, यह उल्लेखनीय है कि, हालांकि सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं है, बड़े नमूनों में मापा जाने पर नाइट्रेट का स्तर थोड़ा कम होता है (चित्रा 5)। हमने अपने प्रकाशित और अप्रकाशित अध्ययनों के दौरान इस घटना को देखा है, लेकिन हम इसके कारणों को नहीं समझते हैं। इसलिए, नमूना भार पर विचार करना और आदर्श रूप से कई ऊतक नमूनों से होमोजेनेट्स तैयार करते समय उन्हें पूरे अध्ययन में सुसंगत रखना महत्वपूर्ण है। छोटे नमूनों (20 मिलीग्राम) के साथ काम करते समय एक और विचार यह है कि संसाधित नमूने की अंतिम कुल मात्रा केवल ~ 300 μL है, जो एक ही नमूने को कई बार मापने की संभावना को काफी कम कर देती है। हालांकि, विशेष रूप से मानव अध्ययन के लिए, मांसपेशियों की बायोप्सी के लिए 20 मिलीग्राम सामान्य स्वीकार्य आकार है।

यह जांचने के लिए कि क्या चूहे के पैरों में अलग-अलग मांसपेशियों में अलग-अलग नाइट्रेट / नाइट्राइट सामग्री होगी, उन आयनों की सांद्रता की तुलना चार अलग-अलग पैर की मांसपेशियों में की गई थी (चित्रा 6)। नाइट्रेट और नाइट्राइट दोनों का स्तर तीन अन्य मांसपेशियों के ऊतकों की तुलना में ग्लूटस मांसपेशियों में उच्चतम था, हालांकि अंतर इस अध्ययन में सांख्यिकीय महत्व तक नहीं पहुंचे, यह सुझाव देते हुए कि विभिन्न मांसपेशियों के प्रकारों में नाइट्रेट चयापचय को अलग-अलग तरीके से नियंत्रित किया जा सकता है। वर्तमान में इस घटना की अधिक विस्तार से जांच की जा रही है।

अन्य शोध समूहों ने कंकाल की मांसपेशी नाइट्रेट सांद्रता की भी सूचना दी है, जो उन मूल्यों में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता का खुलासा करती है। कॉगन समूह ने दिखाया कि स्प्राग डॉवले चूहे के तलवे की मांसपेशियों में नाइट्रेट का स्तर मांसपेशियों की तैयारी विधियों के आधार पर 62 से124 एनएमओएल / जी तक भिन्न होता है। इसी समूह ने एक अन्य अध्ययन 23 में एसडी चूहे के वास्तुस लेटरलिस (लगभग 60 एनएमओएल / जी) और सोलस (लगभग 215 एनएमओएल / जी) में नाइट्रेटमूल्यों की सूचना दी। >300 nmol / g के माउस गैस्ट्रोकैनेमस मांसपेशियों में नाइट्रेट सांद्रता को मापा; हालांकि, मांसपेशी होमोजेनेट तैयारी के लिए सटीक तरीकोंका वर्णन नहीं किया गया था। वर्दिज्क समूह ने मानव मांसपेशी बायोप्सी (वास्तुस लेटरलिस) में नाइट्रेट सामग्री की सूचना दी, जो प्रतिभागी की उम्र 20 वर्ष के आधार पर 54 से80 एनएमओएल / जी तक थी; इसी तरह के एक अध्ययन में, विली एट अल ने एक ही मांसपेशी समूह17 के लिए 226 एनएमओएल / जी की रिपोर्ट की। इन परिणामों से पता चलता है कि कंकाल की मांसपेशियों के नमूनों में नाइट्रेट / नाइट्राइट की सांद्रता कई कारकों को दर्शाती है- शारीरिक (जैसे, व्यायाम की स्थिति), पर्यावरण (जैसे, आहार), और तकनीकी (परख विवरण) - जिनमें से सभी संभवतः माप परिवर्तनशीलता में योगदान करते हैं।

हमने यहां प्रस्तुत सभी तीन विधियों के लिए परिवर्तनशीलता (सीवी) का गुणांक निर्धारित किया - संलग्न पूरक फ़ाइल देखें। यहां तक कि अगर सीवी आदर्श से बहुत दूर हैं, और उपयोग की जाने वाली विधियों के बीच भिन्न हैं, तो हमारे सीवी मान ट्राउटमैन एट अल 21 द्वारा प्रकाशित लोगों के साथ तुलनीय हैं। दुर्भाग्य से, अभी भी कोई स्पष्ट स्पष्टीकरण नहीं है कि इस तरह की उच्च परिवर्तनशीलता क्यों बनी हुई है; यह पेपर एकमात्र प्रकाशित विस्तृत प्रोटोकॉल है जिसे हम नाइट्रेट और नाइट्राइट निर्धारण के लिए मांसपेशियों के नमूनों को संसाधित करने के लिए जानते हैं।

हमने नाइट्रेट-स्पाइक्ड मांसपेशियों के नमूनों से नाइट्रेट वसूली की रैखिकता और डिग्री को भी मापा (संलग्न पूरक फ़ाइल देखें)। जब हमने होमोजेनाइजेशन के लिए ग्लूटस नमूनों में नाइट्रेट की तीन अलग-अलग सांद्रता को जोड़ा, तो हमने मोती और रोटरी होमोजेनाइज़र दोनों के लिए अतिरिक्त नाइट्रेट की ~ 80% वसूली के साथ नाइट्रेट सांद्रता में वृद्धि में एक अच्छी रैखिक प्रतिक्रिया प्राप्त की। इन परिणामों से पता चलता है कि अच्छे आत्मविश्वास के साथ जैविक नमूनों में नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर के निर्धारण के लिए दोनों समरूपीकरण विधियों का उपयोग किया जा सकता है। अतिरिक्त नाइट्रेट के 20% का नुकसान मांसपेशियों के ऊतकों के होमोजेनेट के डीप्रोटीनाइजेशन और सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान होने की संभावना है जब कुछ आयन चार्ज प्रोटीन या अन्य सेल भागों के साथ सह-अवक्षेपित हो सकते हैं।

सामान्य तौर पर, हम आशा करते हैं कि नाइट्रेट और नाइट्राइट के माप के लिए मांसपेशियों के नमूने की तैयारी की हमारी प्रस्तावित विधि न केवल व्यायाम अनुसंधान क्षेत्र में, बल्कि नैदानिक अध्ययनों में भी उपयोगी साबित होगी। बड़ी आबादी को प्रभावित करने वाले न्यूरोमस्कुलर और / या चयापचय संबंधी विकार हैं जो नाइट्रिक ऑक्साइड चक्र की खराबी से संबंधित हो सकते हैं और नाइट्रेट की आपूर्ति से लाभ उठा सकते हैं। हालांकि, किसी को पहले यह स्थापित करना होगा कि क्या कोई कमी नहीं है, वास्तव में, मौजूद है और यदि इसे आहार हस्तक्षेप द्वारा ठीक किया जा सकता है। हमें उम्मीद है कि यहां वर्णित विधि नाइट्रेट और एनओ चक्र के अन्य मेटाबोलाइट्स के भाग्य को कंकाल की मांसपेशियों और अन्य अंगों में निगरानी करने में सक्षम करेगी

हम जानते हैं कि, इसके विकास के इस बिंदु पर, केमिलुमिनेसेंस (नाइट्रोजन ऑक्साइड के सभी निर्धारणों में से सबसे मात्रात्मक) का उपयोग करके नाइट्रेट और नाइट्राइट माप के लिए कंकाल की मांसपेशियों की तैयारी के तरीकों में अभी भी अज्ञात चर हैं, जिनमें से कुछ ऊपर चर्चा की गई हैं। हालांकि, इसकी सीमाओं के साथ भी, वर्णित विधियां विभिन्न कंकाल की मांसपेशियों सहित विभिन्न अंगों के नाइट्रेट / नाइट्राइट स्तरों की यथोचित सटीक तुलना की अनुमति देती हैं, और परिकल्पनाओं के निर्माण की अनुमति देनी चाहिए जिन्हें तब उचित सटीकता के साथ परीक्षण किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है। शेल्टर को कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों के उपचार के लिए नाइट्राइट लवण के उपयोग के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ को जारी किए गए कई पेटेंटों पर सह-आविष्कारक के रूप में सूचीबद्ध किया गया है। वह नैदानिक विकास के लिए इन पेटेंटों के एनआईएच लाइसेंसिंग के आधार पर रॉयल्टी प्राप्त करता है लेकिन कोई अन्य मुआवजा नहीं। ये व्यवस्थाएं JoVE पत्रिका नीतियों के पालन को प्रभावित नहीं करती हैं।

Acknowledgments

इस काम को एलन एन शेचर, एमडी को इंट्राम्यूरल एनआईएच / एनआईडीडीके अनुदान ज़िया डीके 0251041-14 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
gentle MACS M tube Miltenyi Biotec 130-093-236 Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium Hospira NDC-0409-7620-13
Isoflurane Baxter NDC-10019-360-60
Methanol Sigma 646377
Minilys bead homogenizer Bertin Instruments P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide Sigma 4260
Nitric Oxide analyzer GE Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol Sigma 74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 Sigma 702587
Precellys lysing kit Bertin Instruments P000911-LYSK0-A contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit Cellcrusher Cellcrusher kit

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References

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जीव विज्ञान अंक 173 नाइट्रेट नाइट्राइट नाइट्रिक ऑक्साइड कंकाल की मांसपेशी ऊतक समरूपीकरण
नाइट्रेट और नाइट्राइट माप के लिए चूहे कंकाल की मांसपेशी होमोजेनेट्स की तैयारी
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Park, J. W., Thomas, S. M., Wylie,… More

Park, J. W., Thomas, S. M., Wylie, L. J., Jones, A. M., Vanhatalo, A., Schechter, A. N., Piknova, B. Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements. J. Vis. Exp. (173), e62427, doi:10.3791/62427 (2021).

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