Summary
We presenteren protocollen voor drie verschillende methoden voor de homogenisatie van vier verschillende spiergroepen van rattenskeletspierweefsel om de niveaus van nitraat en nitriet te meten en te vergelijken. Verder vergelijken we verschillende monstergewichten om te onderzoeken of de grootte van het weefselmonster de resultaten van homogenisatie beïnvloedt.
Abstract
Nitraationen (NO3-) werden ooit beschouwd als inerte eindproducten van stikstofmonoxide (NO) metabolisme. Eerdere studies toonden echter aan dat nitraationen bij zoogdieren kunnen worden omgezet in NO via een reductiemechanisme in twee stappen: nitraat wordt gereduceerd tot nitriet (NO2-), meestal door orale commensale bacteriën, waarna nitriet wordt gereduceerd tot NO door verschillende mechanismen, waaronder via heem- of molybdeenbevattende eiwitten. Deze reductieve nitraatroute draagt bij aan het verbeteren van NO-gemedieerde signaalroutes, met name in het cardiovasculaire systeem en tijdens spieroefeningen. De niveaus van nitraat in het lichaam vóór een dergelijk gebruik worden bepaald door twee verschillende bronnen: endogene NO-oxidatie en voedingsnitraatinname, voornamelijk van planten. Om de complexe NO-cyclus in fysiologische omstandigheden op te helderen, hebben we de dynamiek van zijn metabolieten, nitraat- en nitritionen, die relatief stabiel zijn in vergelijking met NO, verder onderzocht. In eerdere studies werd skeletspieren geïdentificeerd als een belangrijk opslagorgaan voor nitraationen bij zoogdieren, evenals een directe bron van NO tijdens inspanning. Daarom is het belangrijk om een betrouwbare methodologie vast te stellen voor het meten van nitraat- en nitrietniveaus in skeletspieren en zou het nuttig moeten zijn om de toepassing ervan uit te breiden naar andere weefselmonsters. Dit artikel legt in detail de voorbereiding van skeletspiermonsters uit, met behulp van drie verschillende homogenisatiemethoden, voor nitraat- en nitrietmetingen en bespreekt belangrijke kwesties met betrekking tot homogenisatieprocessen, waaronder de grootte van de monsters. Nitraat- en nitrietconcentraties zijn ook vergeleken in vier verschillende spiergroepen.
Introduction
Stikstofmonoxide (NO), een klein gasvormig signaalmolecuul, speelt een cruciale rol in fysiologische en pathofysiologische processen1. NO kan worden geproduceerd uit L-arginine door endogene enzymen van de stikstofmonoxidesynthase (NOS) familie alvorens een snelle oxidatie tot nitraat (NO3-) en eventueel nitriet (NO2-) in bloed en weefselste ondergaan 2,3. Onlangs is aangetoond dat deze anionen weer zijn teruggebracht tot NO in zoogdiersystemen4. Nitraat wordt omgezet in nitriet, voornamelijk door commensale bacteriële nitraatreductasen in de mondholte die inwerken op ionen die door de speekselklieren worden uitgescheiden en direct worden ingenomen 5, en tot op zekere hoogte door zoogdierenzymen zoals xanthineoxidoreductase 6,7. Nitriet kan verder worden gereduceerd tot NO door verschillende mechanismen, waaronder deoxyhemoglobine8, deoxymyoglobine9, molybdeenbevattende enzymen10 en niet-enzymatische reductie in de aanwezigheid van protonen11,12.
Deze nitraat-nitriet-NO-route wordt versterkt onder hypoxische omstandigheden waarin de NOS-activiteit wordt verminderd omdat NOS zuurstof nodig heeft voor NO-generatie4. Veel recente studies hebben gunstige effecten van voedingsnitraat op bloeddrukregulatie en trainingsprestaties gemeld, wat suggereert dat nitraatreductieroutes bijdragen aan de toename van NO-signalering 13,14,15. Eerdere studies hebben aangetoond dat sommige skeletspieren waarschijnlijk de belangrijkste nitraatopslagplaatsen in het lichaam zijn16. In vergelijking met bloed of andere inwendige organen zoals lever, bevat de skeletspieren (gluteus maximus) significant hogere niveaus van nitraat en hebben ze een aanzienlijke massa in het lichaam van zoogdieren. Loopbandoefeningen bleken de nitraatreductie tot nitriet en tot NO in gluteus te verbeteren in een ratmodel7. Deze resultaten impliceren dat sommige skeletspieren belangrijke bronnen voor NO kunnen zijn via nitraatreductieroutes in fysiologische situaties. Meer recente studies suggereren dat deze bevindingen, inclusief veranderingen in spiernitraatniveaus tijdens inspanning, ook voorkomen bij mensen17.
Twee van de huidige auteurs hadden eerder een methode vastgesteld om het nitraat- en nitrietgehalte in bloed en andere vloeibare monsters te meten18. Toen de niveaus van deze anionen in weefselhomogenaten echter aanvankelijk werden geanalyseerd, waren er geen gedetailleerde protocollen beschikbaar. Om de nitraat-nitriet-NO-dynamiek in verschillende organen te begrijpen, was ons doel om een nauwkeurige en efficiënte methode te ontwikkelen om nitraat- en nitrietniveaus in zoogdierweefsels, waaronder skeletspieren, te meten. In eerdere studies werden knaagdierweefsels gebruikt om betrouwbare homogenisatieprocessen te ontwikkelen en vervolgens het nitraat- en nitrietgehalte in die homogenatente analyseren 7,16,19. Het gebruik van deze homogenisatiemethode werd uitgebreid tot menselijke skeletspierbiopsiemonsters, waarbij de waarden werden bevestigd, en belangrijker nog, de waargenomen waarden voor spieren in vergelijking met bloed / plasma waren in vergelijkbare bereiken en verhoudingen als die waargenomen bij knaagdieren17. In de afgelopen jaren zijn andere groepen ook begonnen met het meten van nitraat- en nitrietniveaus in skeletspierhomogenaten, waarbij vergelijkbare waarden werden gerapporteerd als die gerapporteerd door onze groep20,21.
Het doel van dit protocolartikel is om in detail de bereiding van skeletspierhomogenaten te beschrijven met behulp van drie verschillende homogenisatiemethoden voor latere metingen van nitraat- en nitrietniveaus. Bovendien werden de effecten van weefselgewicht dat wordt gebruikt voor homogenisatie op waarden van nitraat en nitriet in skeletspiermonsters onderzocht. Wij geloven dat deze methoden gemakkelijk kunnen worden toegepast op andere soorten weefsels van zoogdieren. Recent, vooral op het gebied van inspanningsfysiologie, was aandacht besteed aan de mogelijke verschillen in nitraat/nitriet/NO-fysiologie volgens spiergroepen. We rapporteren ook de hoeveelheden nitraat en nitriet in vier verschillende knaagdierspieren en vinden een niet-uniforme verdeling van beide ionen over deze verschillende spieren; een constatering die nader onderzoek vereist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het dierprotocol is goedgekeurd door NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Dieren werden behandeld en behandeld volgens de huidige gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren die vrij beschikbaar is op de AAALAC-website.
1. Rattenskeletspier collectie
- Terwijl een rat onder diepe anesthesie is (5% isofluraan, bevestigd door afwezige reactie op staart/ beenknijpen), begint u perfusie met zoutoplossing met heparine door een naald van 19 G in een top van de linker ventrikel te plaatsen en een inkeping te maken op het rechter atrium. Laat zoutoplossing met heparine door de inwendige organen trekken totdat er minstens 1,5 liter/kg door het weefsel is gestroomd. Op dit punt zijn dieren dood door exsanguinatie en zijn karkassen klaar om te worden verwerkt voor monsterverzameling.
OPMERKING: Het bereiken van een goede perfusie is van cruciaal belang, vooral voor nauwkeurige metingen van nitriet, omdat nitriet wordt geoxideerd tot nitraat door een achterblijvend hemoglobine. - Identificeer doelspierweefsels en snijd ze uit de achterpoten22 met behulp van schone chirurgische instrumenten. Verwijder zoveel mogelijk vet en bindweefsel uit de spierweefsels.
- Plaats de gewenste hoeveelheid spieren in een microcentrifugebuis en plaats deze vervolgens op droogijs. Bewaar de met tissue gevulde buisjes in de vriezer van -80 °C.
OPMERKING: In het geval van menselijke biopsiemonsters, dep ze onmiddellijk na het verzamelen grondig met schoon gaas om overtollig bloed te verwijderen.
2. Voorbereiding voor homogenisatie
- Bereiding van nitrietconserverende oplossing (stopoplossing)
- Bereid een heldergele oplossing met 890 mM kaliumfercyanide (K3Fe(CN)6) en 118 mM NEM (N-ethylmaleimide) in gedestilleerd water, zodat er geen kristallen zijn. Voeg niet-ionische oppervlakteactieve stof (detergent) toe in een verhouding van 1:9 (v/v, materiaaltafel) en meng voorzichtig om schuimvorming te voorkomen.
- Verdun de stopoplossing in een verhouding van 1:9 met gedestilleerd water. Plaats de verdunde stopoplossing (1:5 verhouding spierweefsel tot verdunde stopoplossing) in de homogenisatiebuis.
OPMERKING: Twintig milligram weefsel vereist 100 μL stopoplossing en 200 mg weefsel vereist 1000 μL stopoplossing in de buis. De aanwezigheid van wasmiddel in de toegevoegde oplossing is van cruciaal belang voor verstoring van celmembranen. Elk niet-ionisch wasmiddel kan worden gebruikt, maar er moet voor worden gezorgd dat het niet interfereert met de chemiluminescentiemethode.
- Weefselvoorbereiding
- Haal het doekje uit de -80 °C vriezer en ontdooi langzaam in ijs. Verwijder het resterende vet en bindweefsel uit de skeletspieren. Snijd stukjes skeletspieren af en dep op gaas om te drogen.
- Weeg de hoeveelheid weefsel af (20, 50 en 200 mg). Plaats de voorgewogen skeletspieren in de stopoplossing in de homogenisatiebuizen of plaats het voorgewogen weefsel in een schone microcentrifugebuis voor later gebruik.
3. Homogenisatie
- Roterende homogenisator (figuur 1)
- Plaats de M-type buis met de voorgewogen skeletspieren en de vooraf afgemeten stopoplossing in de machine. Homogeniseer elk monster tweemaal (zet op de meest destructieve homogenisatiecyclus) en plaats de buis onmiddellijk na elke homogenisatie gedurende 5 minuten op ijs om af te koelen.
- Centrifugeer kort bij 2.000 × g en 4 °C gedurende 5 minuten. Plaats de volle buis terug op ijs en voeg het juiste volume methanol toe (≥ 99,9 %, 10x van het gewicht van het weefsel). Vortex grondig voor 15 s.
OPMERKING: Gebruik voor 20 mg weefsel 200 μL methanol. Methanol wordt gebruikt om eiwitten uit weefselhomogenaat neer te slaan en interfereert niet met de chemiluminescentiemethode. Als een andere eiwitprecipitatiemethode wordt gebruikt, test dan de compatibiliteit met chemiluminescentie. - Homogeniseer nogmaals en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Centrifugeer de monsters gedurende 35 minuten bij 4 °C en 3.500 × g. Aspirateer het supernatant en meet nitriet/nitraat niveaus, of bewaar bij -80 °C voor later gebruik.
- Kraalhomogenisator (figuur 2)
- Plaats het skeletspierweefsel in een kraalbevattende buis (verhouding 1:5 voor weefsel:verdunde stopoplossing) en homogeniseer tweemaal gedurende 45 s met de hoogste snelheid die beschikbaar is op het gebruikte instrument. Plaats de buis onmiddellijk na elke homogenisatie gedurende 5 minuten op ijs om af te koelen.
- Kortcentrifugeren met behulp van een kleine desktopcentrifuge (2.000 x g) gedurende 5 seconden. Plaats de buis terug op ijs en voeg een geschikt volume methanol toe (zuiverheid ≥ 99,9 %, 10x van het gewicht van het weefsel). Vortex grondig voor 15 s.
OPMERKING 1: Gebruik voor 20 mg weefsel 200 μL methanol.
OPMERKING 2: Methanol wordt gebruikt om eiwitten uit weefselhomogenaat neer te slaan en interfereert niet met de chemiluminescentiemethode. Als een andere eiwitprecipitatiemethode wordt gebruikt, test dan de compatibiliteit met chemiluminescentie. - Homogeniseer nogmaals gedurende 45 s met de hoogste snelheid die beschikbaar is op het gebruikte instrument. Broed op ijs gedurende 30 minuten. Centrifugeer bij 17.000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirateer het supernatant en meet nitriet/nitraat niveaus, of bewaar bij -80 °C voor later gebruik.
- Vergruizer (figuur 3)
- Bereid buisjes met verdunde stopoplossing (5x weefselgewicht) en weeg ze. Noteer het gewicht (buis + stopoplossing).
- Plaats het gereedschap voor de verpulverizer met vloeibare stikstof op droogijs en wacht ongeveer 30 minuten totdat het de gewenste temperatuur heeft bereikt.
- Breng met behulp van een pincet gekoeld in vloeibare stikstof één monster (weefselgewicht al gemeten) over naar de vergruizer. Voeg een kleine lepel vloeibare stikstof toe om ervoor te zorgen dat het weefsel op vloeibare stikstoftemperatuur is.
- Nadat 95% van de vloeibare stikstof is verdampt, plaatst u het breekgereedschap op het weefsel en drukt u stevig aan. Je zou het monster moeten voelen verpletteren. Gebruik de hamer en sla het breekgereedschap 3-5x.
- Controleer het monster op eventuele resterende brokken met een lepel gekoeld in vloeibare stikstof. Gebruik na het afkoelen in vloeibare stikstof een stuk tissuepapier om bevroren water weg te vegen voordat u het weefsel aanraakt. Als er een stuk aanwezig is, verplaats het dan naar het midden en sla dan nog 5-6 keer met de hamer.
- Wanneer het hele monster is verpulverd, gebruikt u de vloeibare stikstofgekoelde lepel om het gemalen weefsel rechtstreeks over te brengen in de vooraf gewogen buis met de verdunde stopoplossing (stap 3.3.1). Zorg ervoor dat u deze stap snel uitvoert, want wanneer de geplette skeletspier opwarmt, wordt deze plakkerig en moeilijk over te dragen.
- Vortex voor 15 s. Controleer of er geen weefsel aan de bovenkant van de buis vastzit door de buis te openen. Als dat het geval is, probeer het dan los te maken en vortex opnieuw.
- Centrifugeer het monster gedurende 2-3 s met behulp van een kleine desktopcentrifuge. Weeg de buis opnieuw. Bereken het weefselgewicht door het oorspronkelijke buisgewicht (stap 3.3.1) van dit nieuwe gewicht af te trekken. Plaats de tube op ijs.
OPMERKING: De exacte gewichten helpen bij het bepalen van het exacte weefselgewicht en hoeveel weefsel verloren is gegaan tijdens verpulvering. - Zodra alle monsters tot stap 3.3.8 zijn verwerkt, voegt u een geschikt volume methanol toe (≥ 99,9 %, 10x van het weefselgewicht). Vortex grondig gedurende 15 s en incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Gebruik voor 20 mg weefsel 200 μL methanol. Methanol wordt gebruikt om eiwitten uit weefselhomogenaat neer te slaan en interfereert niet met de chemiluminescentiemethode. Als een andere eiwitprecipitatiemethode wordt gebruikt, test dan de compatibiliteit met chemiluminescentie. - Centrifugeer bij 17.000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirateer het supernatant en meet nitriet/nitraat niveaus, of bewaar bij -80 °C voor later gebruik.
4. Nitriet/nitraatmeting met stikstofmonoxideanalysator (NOA)
- Bereid alle monsters voor met een van de drie verschillende homogenisatiemethoden die hierboven zijn beschreven en injecteer ze in een NOA voor nitraat- en nitrietmeting.
OPMERKING: Gedetailleerde protocollen voor NOA-gebruik werden eerder gepubliceerd19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om representatieve resultaten te verkrijgen, werden skeletspierweefsels van 8 Wistar-ratten (mannetjes en vrouwtjes, gewicht 250 ± 50 g) gebruikt. Rat skeletspieren homogenaten (50 mg gluteus maximus spier voor elke methode) werden bereid door drie verschillende homogenisatie-instrumenten (roterende homogenisator, kraalhomogenisator en vergruizer). Het nitraat- en nitrietgehalte van deze homogenaten werd vervolgens bepaald met behulp van een stikstofmonoxideanalysator (NOA) (figuur 4). De nitraatgehalten (figuur 4A) in die drie homogenaatmonsters leken sterk op elkaar, variërend van 39,6 tot 45,2 nmol/g.
Interessant is dat nitrietniveaus (figuur 4B) in een homogenaatmonster bereid door een vergruizer de hoogste waarde vertoonden (0,99 ± 0,15 nmol / g), en dit was statistisch verschillend van de twee andere monsterwaarden. Om te testen of de grootte van weefsels de homogenisatie-efficiëntie en de resulterende nitraat- en nitrietwaarden zou beïnvloeden, werden drie verschillende skeletspierweefselgroottes (gluteus spierweefsel van 20, 50 en 200 mg) gebruikt voor homogenisatie door een kraalhomogenisator (figuur 5). Noch nitraat (figuur 5A) noch nitriet (figuur 5B) niveaus waren significant verschillend tussen spiermonstergroottes. Er werden echter iets lagere nitraatconcentraties waargenomen wanneer de steekproefomvang werd verhoogd, in meerdere experimenten om onduidelijke redenen.
Vervolgens werden nitraat- en nitrietniveaus in verschillende soorten knaagdierpootskeletspierweefsels gemeten (figuur 6). Naast de gluteus maximus spier werden tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL) en gastrocnemius spieren (elk 50 mg) geïsoleerd uit rattenpoten en gehomogeniseerd met behulp van een kraalhomogenisator. Verrassend genoeg waren de nitraatspiegels van de gluteusspier (40,4 nmol/g) ongeveer twee keer hoger dan die van de andere drie spierweefsels, hoewel deze verschillen in dit specifieke experiment geen statistische significantie bereikten (figuur 6A). De nitrietconcentratie in de gluteusspier was ook hoger dan die van de andere drie spierweefsels en was significant hoger dan die in het gastrocnemiusmonster (figuur 6B).
We hebben de variatiecoëfficiënt voor alle drie de gebruikte methoden bepaald en de resultaten staan in de bijgevoegde tabel. Ter vergelijking toont de tabel ook variatiecoëfficiënten bepaald door Troutman et al21.
Figuur 1: Roterende homogenisator. (A) Homogenisator; B) buis met weefsel en stopoplossing. Monsters van skeletspierweefsel worden in een buis met verdunde stopoplossing geplaatst en drie keer gehomogeniseerd. Monsters moeten onmiddellijk na elke homogenisatiestap op ijs worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kraalhomogenisator. A) homogenisator; B) buizenhoudende kralen. Monsters van skeletspierweefsel worden in een kraalbevattende buis (5 keramische kralen) met verdunde stopoplossing geplaatst en in totaal drie keer gehomogeniseerd (45 s op de hoogste snelheid voor elke keer). Monsters moeten onmiddellijk na elke homogenisatiestap op ijs worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergruizer. (A) Verpulverizer onderdelen (B) Pulverizer lichaam - vijzel en stamper geassembleerd. C) detail van de mortel- en stamperassemblage. Pulverizer onderdelen worden gedurende 30 minuten gekoeld op droogijs. Vloeibare stikstof wordt in de mortel gedaan en vervolgens wordt vooraf gewogen skeletspierweefsel toegevoegd. Nadat 90 procent van de vloeibare stikstof is verdwenen, wordt het bovenste deel - de stamper - in het bassin ingebracht. De stamper wordt 5-6 keer gestampt met een hamer totdat het monster poederachtig is. Het poedervormige weefsel wordt vervolgens overgebracht naar een buis met stopoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: (A) Nitraat- en (B) nitrietgehalten in gluteusspierhomogenaten bereid met drie verschillende homogenisatiemethoden. Vijftig milligram gluteusspier werd gehomogeniseerd door drie verschillende homogenisatiemethoden. Methanol (500 μL) werd toegevoegd aan de homogenaten om eiwitten neer te slaan. Een standaard chemiluminescentiemethode met vanadiumchloride of trijodideoplossing werd gebruikt om respectievelijk het nitraat- en nitrietgehalte in het heldere supernatant na centrifugatie te meten; n=7 (nitraat); n=8 (nitriet); gegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± SD, * p < 0,05 met behulp van eenrichtings-ANOVA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: (A) Nitraat- en (B) nitrietgehalten in verschillende steekproefgroottes van gluteusspieren. Drie verschillende maten gluteus spierhomogenaten werden bereid met behulp van een kraalhomogenisator. Een standaard chemiluminescentiemethode met vanadiumchloride of trijodideoplossing werd gebruikt om respectievelijk het nitraat- en nitrietgehalte in het heldere supernatant na centrifugatie te meten; n=7 (nitraat); n=8 (nitriet); gegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± SD, Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: (A) Nitraat- en (B) nitrietgehalte in vier verschillende spieren. Elke spier (50 mg) werd gehomogeniseerd met behulp van een kraalhomogenisator en een standaard chemiluminescentiemethode met vanadiumchloride of trijodideoplossing werd gebruikt om respectievelijk nitraat- en nitrietgehalten te meten; n=4-7 (nitraat); n=3-8 (nitriet); gegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± SD, * p < 0,05 met behulp van eenrichtings-ANOVA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om veranderingen in de NO-metabolieten, nitraat en nitriet te volgen, als functie van fysiologische interventies, is het noodzakelijk om de niveaus van deze ionen in de verschillende organen te meten die cruciaal zijn in hun metabolisme. Omdat hemoglobine in het bloed zal reageren met NO en zijn metabolieten, is het ook belangrijk om bloed zo snel mogelijk uit weefselmonsters te verwijderen. Zo werden dieren doordrenkt met zoutoplossing voordat ze skeletspierweefsels verzamelden (gluteus, TA, EDL, gastrocnemiusspier) en bindweefsel en vet rond de doelspier werden onmiddellijk verwijderd. Voor de homogenisatieoplossing werd speciaal een 'stopoplossing' geformuleerd met ferricyanide, NEM en niet-ionische oppervlakteactieve stof om nitriet in verschillende weefsels te behouden19. De aanwezigheid van niet-ionisch wasmiddel is van cruciaal belang voor volledige verstoring van celmembranen. In het geval van de twee homogenisatiemachines die in dit onderzoek zijn gebruikt, de roterende homogenisator en de kraalhomogenisator, bedroeg het volume van de stopoplossing dat nodig is voor homogenisatie 5x het gewicht van het weefsel, zodat het hele weefsel volledig in de oplossing werd ondergedompeld en homogeen werd verwerkt.
Het homogenisatieproces werd in totaal drie keer uitgevoerd (twee keer voordat methanol werd toegevoegd en nog een keer na het toevoegen van methanol aan neerslaande eiwitten), telkens met behulp van een geprogrammeerde instelling die werd bepaald door de fabrikanten van het instrument. Het is belangrijk om monsters onmiddellijk na elke homogenisatie op ijs te plaatsen om verslechtering van het monster door de milde verwarming, die tijdens de homogenisatie kan worden gegenereerd, te voorkomen. Voor de verpulveringsmethode werden weefselmonsters aanvankelijk tot poeder geplet terwijl ze bevroren bleven met vloeibare stikstof, waarna monsters werden gemengd met stopoplossing (5x weefselgewicht). In alle drie de methoden werd methanol (10x weefselgewicht) aan de monsters toegevoegd en het mengsel werd gedurende 30 minuten op ijs geïncubeerd om eiwitten neer te slaan en nitraat en nitriet volledig uit de weefsels te extraheren. De aanwezigheid van eiwitten in het monster kan overmatig schuimen van de reactieoplossing in de kamer veroorzaken bij gebruik van chemiluminescentie, dus het is noodzakelijk om eiwitten uit de monsters neer te slaan. Elk precipitatiemiddel kan worden gebruikt, maar het is noodzakelijk om te bevestigen dat dergelijke middelen de chemiluminescentiemethode niet zullen verstoren of veranderingen in nitriet/ nitraatconcentraties zullen veroorzaken door met deze ionen te reageren.
Nitraatniveaus in alle gluteusmonsters die met de drie methoden werden bereid, waren zeer vergelijkbaar (39,6-45,2 nmol / g, figuur 4A), wat suggereert dat deze drie homogenisatiemethoden evenzeer van toepassing zijn op het voorbereiden van spiermonsters voor nitraatanalyse. Hoewel de nitrietspiegels iets hoger waren in monsters bereid door verpulvering in vergelijking met de twee andere methoden (figuur 4B), lagen alle gemeten waarden in een beperkt bereik (0,64-0,99 nmol / g). Het effect van weefselmonstergrootte op nitraat- en nitrietwaarden in skeletspiermonsters werd onderzocht omdat onderzoekers vaak te maken hebben met zeer kleine monsters, met name van kleine dieren of menselijke spierbiopten. Noch nitraat- noch nitrietspiegels verschilden significant in het bereik van 20 tot 200 mg skeletspierweefsel in deze experimenten (figuur 5).
Het is echter opmerkelijk dat, hoewel niet statistisch significant, de nitraatniveaus meestal iets lager zijn wanneer ze in grotere monsters worden gemeten (figuur 5). We hebben dit fenomeen opgemerkt in de loop van onze gepubliceerde en ongepubliceerde studies, maar we begrijpen de redenen ervoor niet. Daarom is het waarschijnlijk belangrijk om rekening te houden met de monstergewichten en deze idealiter consistent te houden tijdens een onderzoek bij het bereiden van homogenaten uit meerdere weefselmonsters. Een andere overweging bij het werken met kleinere monsters (20 mg) is dat het uiteindelijke totale volume van het verwerkte monster slechts ~ 300 μL is, wat de mogelijkheid om hetzelfde monster meerdere keren te meten aanzienlijk vermindert. Echter, vooral voor menselijke studies, 20 mg is de gebruikelijke aanvaardbare grootte voor spierbiopten.
Om te onderzoeken of verschillende spieren in rattenbenen verschillende nitraat/nitrietgehaltes zouden hebben, werden de concentraties van die ionen vergeleken in vier verschillende beenspieren (figuur 6). Zowel nitraat- als nitrietspiegels waren het hoogst in de gluteusspier in vergelijking met drie andere spierweefsels, hoewel de verschillen in deze studie geen statistische significantie bereikten, wat suggereert dat het nitraatmetabolisme in verschillende spiertypen anders kan worden geregeld. Dit fenomeen wordt momenteel in meer detail onderzocht.
Andere onderzoeksgroepen hebben ook nitraatconcentraties van skeletspieren gemeld, wat een significante variabiliteit in die waarden onthult. De Coggan-groep toonde aan dat de nitraatspiegels in Sprague Dawley rat soleus spier variëren van 62 tot 124 nmol / g, afhankelijk van spiervoorbereidingsmethoden21. Dezelfde groep rapporteerde nitraatwaarden in SD rat vastus lateralis (ongeveer 60 nmol/g) en soleus (ongeveer 215 nmol/g) in een andere studie23. Ohtake et al. gemeten nitraatconcentraties in de gastrocnemiusspier van de muis van >300 nmol/g; precieze methoden voor spierhomogenaatpreparaat werden echter niet beschreven24. De Verdijk-groep rapporteerde nitraatgehaltes in menselijke spierbiopten (vastus lateralis) variërend van 54 tot 80 nmol / g, afhankelijk van de leeftijd vande deelnemer 20; in een vergelijkbare studie rapporteren Wylie et al. 226 nmol/g voor dezelfde spiergroep17. Deze resultaten suggereren dat de concentraties van nitraat / nitriet in skeletspiermonsters veel factoren weerspiegelen - fysiologisch (bijv. Trainingsstatus), omgeving (bijv. Dieet) en technische (testdetails) - die allemaal vermoedelijk bijdragen aan de meetvariabiliteit.
We hebben de variabiliteitscoëfficiënt (CV) bepaald voor alle drie de hier gepresenteerde methoden - zie bijgevoegd aanvullend bestand. Zelfs als CV verre van ideaal zijn en variëren tussen de gebruikte methoden, zijn onze CV-waarden vergelijkbaar met die gepubliceerd door Troutman et al. 21 met behulp van vergelijkbare methoden met verschillende behandeling van monsters. Helaas is er nog steeds geen duidelijke verklaring waarom zo'n hoge variabiliteit aanhoudt; dit artikel is het enige gepubliceerde gedetailleerde protocol dat we kennen voor het verwerken van spiermonsters voor nitraat- en nitrietbepaling.
We hebben ook de lineariteit en de mate van nitraatterugwinning uit nitraat-spiked spiermonsters gemeten (zie bijgevoegd aanvullend bestand). Toen we drie verschillende concentraties nitraat toevoegden aan gluteusmonsters voor homogenisatie, verkregen we een goede lineaire respons in toename van nitraatconcentraties met ~ 80% terugwinning van toegevoegd nitraat voor zowel kraal- als roterende homogenisatoren. Deze resultaten tonen aan dat beide homogenisatiemethoden met goede betrouwbaarheid kunnen worden gebruikt voor de bepaling van het nitraat- en nitrietgehalte in biologische monsters. Het verlies van 20% toegevoegd nitraat vindt waarschijnlijk plaats tijdens de deproteinisatie en centrifugatie van spierweefselhomogenaat wanneer sommige ionen samen kunnen neerslaan met geladen eiwitten of andere celdelen.
In het algemeen hopen we dat onze voorgestelde methode van spiermonstervoorbereiding voor metingen van nitraat en nitriet niet alleen nuttig zal zijn op het gebied van inspanningsonderzoek, maar ook in klinische studies. Er zijn neuromusculaire en / of metabole stoornissen die grote populaties treffen die verband kunnen houden met het slecht functioneren van de stikstofmonoxidecyclus en die kunnen profiteren van nitraattoevoer. Men moet echter eerst vaststellen of er in feite GEEN tekort bestaat en of het kan worden gecorrigeerd door dieetinterventie. We hopen dat de hier beschreven methode het mogelijk zal maken om het lot van nitraat en andere metabolieten van de NO-cyclus in skeletspieren en andere organen te volgen
We zijn ons ervan bewust dat, op dit punt van zijn ontwikkeling, methoden voor skeletspiervoorbereiding voor nitraat- en nitrietmetingen met behulp van chemiluminescentie (de meest kwantitatieve van alle bepalingen van de stikstofoxiden zelf) nog steeds onbekende variabelen hebben, waarvan sommige hierboven worden besproken. Maar zelfs met zijn beperkingen maken de beschreven methoden een redelijk nauwkeurige vergelijking mogelijk van nitraat/ nitrietniveaus van verschillende organen, waaronder verschillende skeletspieren, en moeten ze het mogelijk maken hypothesen te formuleren die vervolgens met redelijke nauwkeurigheid kunnen worden getest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben. Alan N. Schechter staat vermeld als mede-uitvinder van verschillende patenten die zijn uitgegeven aan de National Institutes of Health voor het gebruik van nitrietzouten voor de behandeling van hart- en vaatziekten. Hij ontvangt royalty's op basis van NIH-licenties van deze patenten voor klinische ontwikkeling, maar geen andere compensatie. Deze afspraken hebben geen invloed op zijn naleving van het jove-journaalbeleid.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door intramurale NIH/NIDDK subsidie ZIA DK 0251041-14 aan Alan N Schechter, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
References
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A.
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al.
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
