Summary
Vi presenterer protokoller for tre ulike metoder for homogenisering av fire ulike muskelgrupper av rotte skjelettmuskelvev for å måle og sammenligne nivåene av nitrat og nitritt. Videre sammenligner vi ulike utvalgsvekter for å undersøke om vevsprøvestørrelse påvirker resultatene av homogenisering.
Abstract
Nitrationer (NO3-) ble en gang antatt å være inerte sluttprodukter av nitrogenoksid (NO) metabolisme. Tidligere studier har imidlertid vist at nitrationer kan omdannes tilbake til NO hos pattedyr gjennom en to-trinns reduksjonsmekanisme: nitrat reduseres til nitritt (NO2-) hovedsakelig av orale kommensale bakterier, deretter blir nitritt redusert til NO ved flere mekanismer, inkludert via heme- eller molybdenholdige proteiner. Denne reduktive nitratveien bidrar til å forbedre NO-medierte signalveier, spesielt i kardiovaskulærsystemet og under muskeløvelse. Nivåene av nitrat i kroppen før slik utnyttelse bestemmes av to forskjellige kilder: endogen NO-oksidasjon og diettnitratinntak, hovedsakelig fra planter. For å belyse den komplekse NO-syklusen under fysiologiske omstendigheter har vi undersøkt dynamikken i metabolitter, nitrat- og nitrittioner, som er relativt stabile sammenlignet med NO. I tidligere studier ble skjelettmuskulatur identifisert som et viktig lagringsorgan for nitrationer hos pattedyr, samt en direkte kilde til NO under trening. Derfor er det viktig å etablere en pålitelig metode for å måle nitrat- og nitrittnivåer i skjelettmuskulatur og bør være nyttig for å utvide applikasjonen til andre vevsprøver. Dette papiret forklarer i detalj fremstillingen av skjelettmuskelprøver, ved hjelp av tre forskjellige homogeniseringsmetoder, for nitrat- og nitrittmålinger og diskuterer viktige problemstillinger knyttet til homogeniseringsprosesser, inkludert størrelsen på prøvene. Nitrat- og nitrittkonsentrasjoner har også blitt sammenlignet på tvers av fire forskjellige muskelgrupper.
Introduction
Nitrogenoksid (NO), et lite gassformig signalmolekyl, spiller en kritisk rolle i fysiologiske og patofysiologiske prosesser1. NO kan produseres fra L-arginin av endogene enzymer i nitrogenoksidsyntasefamilien (NOS) før den gjennomgår rask oksidasjon til nitrat (NO 3-) og muligens nitritt (NO 2-) i blod og vev 2,3. Nylig har disse anionene vist seg å være redusert tilbake til NO i pattedyrsystemer4. Nitrat omdannes til nitritt, hovedsakelig ved kommensale bakterielle nitratreduktaser i munnhulen som virker på ioner utskilt av spyttkjertlene og direkte inntatt 5, og til en viss grad av pattedyrenzymer som xantinoksidoreduktase 6,7. Nitritt kan reduseres ytterligere til NO ved flere mekanismer, inkludert deoksyhemoglobin8, deoksymyoglobin9, molybdenholdige enzymer 10 og ikke-enzymatisk reduksjon i nærvær av protoner11,12.
Denne nitrat-nitritt-NO-banen forbedres under hypoksiske forhold der NOS-aktiviteten reduseres fordi NOS krever oksygen for NO-generasjon4. Mange nyere studier har rapportert gunstige effekter av diettnitrat på blodtrykksregulering og treningsytelse, noe som tyder på at nitratreduksjonsveier bidrar til økt NO-signalering13,14,15. Tidligere studier har vist at noen skjelettmuskler sannsynligvis er de viktigste nitratlagringsstedene i kroppen16. Sammenlignet med blod eller andre indre organer som lever, inneholder skjelettmuskulatur (gluteus maximus) betydelig høyere nivåer av nitrat og har en betydelig masse i pattedyrkroppen. Tredemølleøvelse ble vist å øke nitratreduksjonen til nitritt og til NO i gluteus i en rottemodell7. Disse resultatene antyder at noen skjelettmuskler kan være viktige kilder til NO gjennom nitratreduksjonsveier i fysiologiske situasjoner. Nyere studier tyder på at disse funnene, inkludert endringer i muskelnitratnivåer under trening, også forekommer hos mennesker17.
To av de nåværende forfatterne hadde tidligere etablert en metode for å måle nitrat- og nitrittnivåer i blod og andre væskeprøver18. Men da nivåene av disse anionene i vevshomogenater først ble analysert, var detaljerte protokoller ikke tilgjengelige. For å forstå nitrat-nitritt-NO-dynamikken i flere forskjellige organer, var målet vårt å utvikle en nøyaktig og effektiv metode for å måle nitrat- og nitrittnivåer i pattedyrvev, inkludert skjelettmuskulatur. I tidligere studier ble gnagervev brukt til å utvikle pålitelige homogeniseringsprosesser og deretter analysere nitrat- og nitrittinnhold i disse homogenatene 7,16,19. Bruken av denne homogeniseringsmetoden ble utvidet til humane skjelettmuskelbiopsiprøver, hvorved verdiene ble bekreftet, og viktigere, verdiene observert for muskel sammenlignet med blod / plasma var i lignende områder og forhold til de som ble observert hos gnagere17. I de senere år har andre grupper også begynt å måle nitrat- og nitrittnivåer i skjelettmuskelhomogenater, og rapporterte sammenlignbare verdier til de som ble rapportert av vår gruppe20,21.
Målet med dette protokollnotatet er å beskrive i detalj fremstillingen av skjelettmuskelhomogenater ved bruk av tre forskjellige homogeniseringsmetoder for etterfølgende måling av nitrat- og nitrittnivåer. I tillegg ble effekten av vevsvekt brukt til homogenisering på verdier av nitrat og nitritt i skjelettmuskelprøver undersøkt. Vi tror at disse metodene lett kan brukes på andre typer pattedyrvev. Nylig, spesielt innen treningsfysiologi, hadde oppmerksomheten blitt rettet mot mulige forskjeller i nitrat / nitritt / NO fysiologi i henhold til muskelgrupper. Vi rapporterer også mengdene nitrat og nitritt i fire forskjellige gnagermuskler og finner en ujevn fordeling av begge ioner mellom disse forskjellige musklene; en observasjon som krever videre studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprotokollen ble godkjent av NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Dyr ble håndtert og behandlet i henhold til gjeldende Veiledning for pleie og bruk av forsøksdyr fritt tilgjengelig på AAALAC nettside.
1. Samling av skjelettmuskler fra rotter
- Mens en rotte er under dyp anestesi (5 % isofluran, bekreftet ved manglende reaksjon på hale/benklemme), start perfusjon med saltvann som inneholder heparin ved å plassere en 19 G nål i en apex av venstre ventrikkel og lage et hakk på høyre atrium. La saltvann med heparin perfuderes gjennom de indre organene til minst 1,5 liter/kg har strømmet gjennom vevet. På dette tidspunktet er dyr døde av exsanguination og er klare til å bli behandlet for prøveinnsamling.
MERK: Å oppnå god perfusjon er kritisk, spesielt for nøyaktige målinger av nitritt, fordi nitritt oksyderes til nitrat av gjenværende hemoglobin. - Identifiser mål muskelvev og excise dem fra bakbenene22 ved hjelp av rene kirurgiske instrumenter. Fjern så mye fett og bindevev fra muskelvevet som mulig.
- Plasser ønsket mengde muskler i et mikrosentrifugerør og legg deretter på tørris. Oppbevar slangene fylt med vev i -80 °C fryseren.
MERK: I tilfelle av humane biopsiprøver, fjern dem grundig umiddelbart etter innsamling med rent gasbind for å fjerne overflødig blod.
2. Forberedelse for homogenisering
- Fremstilling av nitrittbevarende løsning (stoppløsning)
- Klargjør en klar gul oppløsning inneholdende 890 mM kaliumferricyanid (K3Fe(CN)6) og 118 mM NEM (N-etylmaleimide) i destillert vann, slik at det ikke sikres krystaller. Tilsett ikke-ionisk overflateaktivt middel (vaskemiddel) i forholdet 1:9 (v/v, materialtabell), og bland forsiktig for å unngå skumdannelse.
- Fortynn stoppoppløsningen i forholdet 1:9 med destillert vann. Plasser den fortynnede stoppoppløsningen (1:5-forholdet mellom muskelvev og fortynnet stoppløsning) i homogeniseringsrøret.
MERK: Tjue milligram vev vil kreve 100 μL stoppoppløsning, og 200 mg vev vil kreve 1000 μL stoppoppløsning i røret. Tilstedeværelse av vaskemiddel i tilsatt løsning er kritisk for forstyrrelse av cellemembraner. Ethvert ikke-ionisk vaskemiddel kan brukes, men det må tas hensyn til at det ikke forstyrrer kjemiluminescensmetoden.
- Vevspreparasjon
- Ta vevet ut av -80 °C fryseren og tine sakte i is. Fjern gjenværende fett og bindevev fra skjelettmuskulaturen. Klipp av biter av skjelettmuskulatur og flekk på gasbind for å tørke.
- Vei ut mengden vev (20, 50 og 200 mg). Plasser den forhåndsveide skjelettmuskelen i stoppløsningen i homogeniseringsrørene eller plasser det forhåndsveide vevet i et rent mikrosentrifugerør for senere bruk.
3. Homogenisering
- Roterende homogenisator (figur 1)
- Plasser M-type rør som inneholder den forhåndsveide skjelettmuskulaturen og den forhåndsmålte stoppløsningen inn i maskinen. Homogeniser hver prøve to ganger (sett på den mest destruktive homogeniseringssyklusen) og legg røret på is umiddelbart etter hver homogenisering i 5 minutter for å kjøle seg ned.
- Sentrifuge kort ved 2000 × g og 4 °C i 5 min. Legg hele slangen tilbake på is og tilsett riktig volum metanol (≥ 99,9 %, 10x vevsvekt). Vortex grundig i 15 s.
MERK: For 20 mg vev, bruk 200 μL metanol. Metanol brukes til å utfelle proteiner fra vevshomogenat og forstyrrer ikke kjemiluminescensmetoden. Hvis annen proteinutfellingsmetode brukes, test dens kompatibilitet med kjemiluminescens. - Homogeniser en gang til og inkuber på is i 30 minutter. Sentrifuger prøvene i 35 minutter ved 4 °C og 3 500 × g. Aspirer supernatanten, og mål nitritt/nitratnivåer, eller oppbevar ved -80 °C for senere bruk.
- Perlehomogenisator (figur 2)
- Plasser skjelettmuskelvevet i et perleholdig rør (1:5-forhold for vev: fortynnet stoppløsning) og homogeniser to ganger i 45 s med høyeste hastighet som er tilgjengelig på instrumentet som brukes. Legg røret på is umiddelbart etter hver homogenisering i 5 minutter for å kjøle seg ned.
- Sentrifuge kort ved hjelp av en liten stasjonær sentrifuge (2000 x g) i 5 sek. Legg røret tilbake på is og tilsett et passende volum metanol (renhet ≥ 99,9 %, 10x vevsvekt). Vortex grundig i 15 s.
MERKNAD 1: For 20 mg vev, bruk 200 μL metanol.
MERKNAD 2: Metanol brukes til å utfelle proteiner fra vevshomogenat og forstyrrer ikke kjemiluminescensmetoden. Hvis annen proteinutfellingsmetode brukes, test dens kompatibilitet med kjemiluminescens. - Homogeniser en gang til i 45 s med den høyeste hastigheten som er tilgjengelig på instrumentet som brukes. Rug på is i 30 min. Sentrifuge ved 17 000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirer supernatanten, og mål nitritt/nitratnivåer, eller oppbevar ved -80 °C for senere bruk.
- Pulverisator (figur 3)
- Forbered rør som inneholder fortynnet stoppoppløsning (5x vevsvekt) og vei dem. Registrer vekten (rør + stoppløsning).
- Plasser pulveriseringsverktøyet for flytende nitrogen på tørris og vent i ca. 30 minutter til det når ønsket temperatur.
- Bruk pinsett kjølt i flytende nitrogen, overfør en prøve (vevsvekt målt allerede) til pulverisatoren. Tilsett en liten skje med flytende nitrogen for å sikre at vevet har flytende nitrogentemperatur.
- Etter at 95% av det flytende nitrogenet har fordampet, plasser knuseverktøyet på toppen av vevet og trykk godt. Du bør føle prøven knuse. Bruk hammeren, slå knuseverktøyet 3-5x.
- Kontroller prøven for eventuelle gjenværende biter ved hjelp av en skje avkjølt i flytende nitrogen. Etter avkjøling i flytende nitrogen, bruk et stykke silkepapir for å tørke bort frosset vann før du berører vevet. Hvis en del er til stede, flytt den inn i midten, og slå deretter 5-6 ganger til med hammeren.
- Når hele prøven er pulverisert, bruk den flytende nitrogenkjølte skjeen til å overføre det knuste vevet direkte til det forveiede røret som inneholder den fortynnede stoppløsningen (trinn 3.3.1). Sørg for å utføre dette trinnet raskt, da når den knuste skjelettmuskelen varmes opp, blir den klebrig og vanskelig å overføre.
- Vortex for 15 s. Kontroller at ingen vev sitter fast på toppen av røret ved å åpne røret. Hvis det er det, prøv å løsne det og deretter virvel igjen.
- Sentrifuger prøven i 2-3 s ved hjelp av en liten stasjonær sentrifuge. Vei røret igjen. Beregn vevsvekten ved å trekke den opprinnelige rørvekten (trinn 3.3.1) fra denne nye vekten. Plasser røret på is.
MERK: De nøyaktige vektene vil bidra til å bestemme den nøyaktige vevsvekten og hvor mye vev som gikk tapt under pulverisering. - Når alle prøvene er behandlet opp til trinn 3.3.8, tilsett et passende volum metanol (≥ 99,9 %, 10x vevsvekt). Vortex grundig i 15 s, og rug på is i 30 min.
MERK: For 20 mg vev, bruk 200 μL metanol. Metanol brukes til å utfelle proteiner fra vevshomogenat og forstyrrer ikke kjemiluminescensmetoden. Hvis annen proteinutfellingsmetode brukes, test dens kompatibilitet med kjemiluminescens. - Sentrifuge ved 17 000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirer supernatanten og mål nitritt-/nitratnivåer, eller oppbevar ved -80 °C for senere bruk.
4. Nitritt-/nitratmåling med nitrogenoksidanalysator (NOA)
- Forbered alle prøvene ved hjelp av en av tre forskjellige homogeniseringsmetoder beskrevet ovenfor, og injiser dem i en NOA for nitrat- og nitrittmåling.
MERK: Detaljerte protokoller for NOA-bruk ble publisert tidligere19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å oppnå representative resultater ble skjelettmuskelvev fra 8 Wistar-rotter (menn og kvinner, vekt 250 ± 50 g) brukt. Rotte skjelettmuskelhomogenater (50 mg gluteus maximus muskel for hver metode) ble fremstilt av tre forskjellige homogeniseringsverktøy (roterende homogenisator, perlehomogenisator og pulverisator). Nitrat- og nitrittinnholdet i disse homogenatene ble deretter bestemt ved hjelp av en nitrogenoksidanalysator (NOA) (figur 4). Nitratnivåene (figur 4A) i disse tre homogenatprøvene var svært like hverandre, fra 39,6 til 45,2 nmol/g.
Interessant nok viste nitrittnivåene (figur 4B) i en homogenatprøve fremstilt av en pulverisator den høyeste verdien (0,99 ± 0,15 nmol/g), og dette var statistisk forskjellig fra de to andre prøveverdiene. For å teste om størrelsen på vev ville påvirke homogeniseringseffektiviteten og de resulterende nitrat- og nitrittverdiene, ble tre forskjellige skjelettmuskelvevstørrelser (gluteus muskelvev på 20, 50 og 200 mg) brukt til homogenisering av en perlehomogenisator (figur 5). Verken nitrat- (figur 5A) eller nitrittnivåer (figur 5B) var signifikant forskjellige mellom muskelprøvestørrelsene. Imidlertid ble det observert litt lavere nitratkonsentrasjoner når prøvestørrelsen ble økt, i flere eksperimenter av grunner som er uklare.
Deretter ble nitrat- og nitrittnivåer i ulike typer skjelettmuskelvev i gnagerben målt (figur 6). I tillegg til gluteus maximus-muskelen ble tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL) og gastrocnemius-muskler (50 mg hver) isolert fra rotteben og homogenisert ved hjelp av en perlehomogenisator. Overraskende nok var nitratnivåene av gluteusmuskel (40,4 nmol / g) omtrent to ganger høyere enn for de tre andre muskelvevene, selv om disse forskjellene i dette eksperimentet ikke nådde statistisk signifikans (figur 6A). Nitrittkonsentrasjonen i gluteusmuskelen var også høyere enn i de tre andre muskelvevene og signifikant høyere enn i gastrocnemius-prøven (figur 6B).
Vi bestemte variasjonskoeffisienten for alle tre metodene som ble brukt, og resultatene er i vedlagte tabell. Til sammenligning viser tabellen også variasjonskoeffisienter bestemt av Troutman et al21.
Figur 1: Roterende homogenisator. (A) Homogenisator; (B) rør som inneholder vev og stopp oppløsning. Skjelettmuskelvevsprøver plasseres i et rør med fortynnet stoppløsning og homogeniseres tre ganger. Prøver skal umiddelbart legges på is etter hvert homogeniseringstrinn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Perlehomogenisator. (A) Homogenisator; (B) perler som inneholder rør. Skjelettmuskelvevsprøver plasseres i et perleholdig rør (5 keramiske perler) med fortynnet stoppløsning og homogeniseres tre ganger totalt (45 s med høyeste hastighet for hver gang). Prøver skal umiddelbart legges på is etter hvert homogeniseringstrinn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Pulverizer . (A) pulverisator deler (B) pulverisator kropp - mørtel og pestle montert. (C) detalj av mørtel og pestle montering. Pulverisatordeler avkjøles på tørris i 30 minutter. Flytende nitrogen settes inn i mørtelen og deretter tilsettes forhåndsveid skjelettmuskelvev. Etter at 90 prosent av det flytende nitrogenet er borte, settes den øverste delen - pestelen - inn i bassenget. Pestelen er pounded med en klubbe 5-6 ganger til prøven er pulverformig. Pulverisert vev overføres deretter til et rør med stoppoppløsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: (A) Nitrat- og (B) nitrittinnhold i gluteusmuskelhomogenater fremstilt ved tre forskjellige homogeniseringsmetoder. Femti milligram gluteusmuskel ble homogenisert ved tre forskjellige homogeniseringsmetoder. Metanol (500 μL) ble tilsatt homogenatene for å utfelle proteiner. En standard kjemiluminescensmetode med vanadiumklorid eller trijodidoppløsning ble brukt til å måle henholdsvis nitrat- og nitrittnivåer i den klare supernatanten etter sentrifugering; n = 7 (nitrat); n = 8 (nitritt); data er presentert som gjennomsnitt ± SD, * p < 0,05 ved bruk av enveis ANOVA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: (A) Nitrat- og (B) nitrittinnhold i forskjellige prøvestørrelser av gluteusmuskel. Tre forskjellige størrelser av gluteusmuskelhomogenater ble fremstilt ved bruk av en perlehomogenisator. En standard kjemiluminescensmetode med vanadiumklorid eller trijodidoppløsning ble brukt til å måle henholdsvis nitrat- og nitrittnivåer i den klare supernatanten etter sentrifugering; n = 7 (nitrat); n = 8 (nitritt); data presenteres som gjennomsnitt ± SD, Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: (A) Nitrat- og (B) nitrittinnhold i fire forskjellige muskler. Hver muskel (50 mg) ble homogenisert ved hjelp av en perlehomogenisator, og en standard kjemiluminescensmetode med vanadiumklorid eller trijodidløsning ble brukt til å måle henholdsvis nitrat- og nitrittnivåer; n = 4-7 (nitrat); n = 3-8 (nitritt); data er presentert som gjennomsnitt ± SD, * p < 0,05 ved bruk av enveis ANOVA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å overvåke endringer i NO-metabolitter, nitrat og nitritt, som en funksjon av fysiologiske inngrep, er det viktig å måle nivåene av disse ionene i de forskjellige organene som er kritiske i deres metabolisme. Siden hemoglobin i blod vil reagere med NO og dets metabolitter, er det også viktig å fjerne blod raskt fra vevsprøver så mye som mulig. Dermed ble dyrene perfundert med saltvann før de samlet skjelettmuskelvev (gluteus, TA, EDL, gastrocnemius muskel), og bindevev og fett rundt målmuskelen ble umiddelbart fjernet. For homogeniseringsløsningen ble en "stoppløsning" spesielt formulert med ferricyanid, NEM og ikke-ionisk overflateaktivt middel for å bevare nitritt i forskjellige vev19. Tilstedeværelsen av ikke-ionisk vaskemiddel er kritisk for full forstyrrelse av cellemembraner. Når det gjelder de to homogeniseringsmaskinene som ble brukt i denne studien, den roterende homogenisatoren og perlehomogenisatoren, var volumet av stoppoppløsning som var nødvendig for homogenisering 5 ganger vevsvekten slik at hele vevet ble fullstendig nedsenket i løsningen og behandlet homogent.
Homogeniseringsprosessen ble utført tre ganger totalt (to ganger før tilsetning av metanol og en gang til etter tilsetning av metanol for å utfelle proteiner), hver gang ved hjelp av en programmert innstilling bestemt av instrumentprodusentene. Det er viktig å plassere prøver på is umiddelbart etter hver homogenisering for å forhindre prøveforringelse av den milde oppvarmingen, som kan genereres under homogenisering. For pulveriseringsmetoden ble vevsprøver først knust til pulver mens de ble frosset ved hjelp av flytende nitrogen, deretter ble prøvene blandet med stoppoppløsning (5x vevsvekt). I alle tre metodene ble metanol (10x vevsvekt) tilsatt prøvene, og blandingen ble inkubert på is i 30 minutter for å utfelle proteiner og fullt ut ekstrahere nitrat og nitritt fra vevet. Tilstedeværelsen av proteiner i prøven kan forårsake overdreven skumdannelse av reaksjonsoppløsningen i kammeret ved bruk av kjemiluminescens, så det er nødvendig å utfelle proteiner fra prøvene. Ethvert utfellingsmiddel kan brukes, men det er nødvendig å bekrefte at slike midler ikke vil forstyrre verken kjemiluminescensmetoden eller forårsake endringer i nitritt/nitratkonsentrasjoner ved å reagere med disse ionene.
Nitratnivåene i alle gluteusprøver fremstilt ved de tre metodene var svært like (39,6-45,2 nmol / g, figur 4A), noe som tyder på at disse tre homogeniseringsmetodene er like anvendelige for å forberede muskelprøver for nitratanalyse. Selv om nitrittnivåene var litt høyere i prøver fremstilt ved pulverisering sammenlignet med de to andre metodene (figur 4B), var alle målte verdier i et begrenset område (0,64-0,99 nmol/g). Effekten av vevsprøvestørrelse på nitrat- og nitrittverdier i skjelettmuskelprøver ble undersøkt fordi forskere ofte håndterer svært små prøver, spesielt fra små dyr eller humane muskelbiopsier. Verken nitrat- eller nitrittnivåene var signifikant forskjellige i området fra 20 til 200 mg skjelettmuskelvev i disse forsøkene (figur 5).
Det er imidlertid bemerkelsesverdig at nitratnivåene, selv om de ikke er statistisk signifikante, har en tendens til å være litt lavere når de måles i større utvalg (figur 5). Vi har lagt merke til dette fenomenet i løpet av våre publiserte og upubliserte studier, men vi forstår ikke årsakene til det. Derfor er det sannsynligvis viktig å vurdere prøvevektene og ideelt sett holde dem konsistente gjennom en studie når man forbereder homogenater fra flere vevsprøver. En annen vurdering ved arbeid med mindre prøver (20 mg) er at det endelige totale volumet av bearbeidet prøve bare er ~ 300 μL, noe som reduserer muligheten til å måle den samme prøven flere ganger. Men spesielt for menneskelige studier er 20 mg den vanlige akseptable størrelsen for muskelbiopsier.
For å undersøke om ulike muskler i rottebein ville ha ulikt nitrat-/nitrittinnhold, ble konsentrasjonene av disse ionene sammenlignet i fire ulike benmuskler (figur 6). Både nitrat- og nitrittnivåene var høyest i gluteusmuskelen sammenlignet med tre andre muskelvev, selv om forskjellene ikke nådde statistisk signifikans i denne studien, noe som tyder på at nitratmetabolismen i ulike muskeltyper kan styres forskjellig. Dette fenomenet undersøkes mer detaljert for tiden.
Andre forskningsgrupper har også rapportert skjelettmuskelnitratkonsentrasjoner, noe som viser betydelig variasjon i disse verdiene. Coggan-gruppen viste at nitratnivåene i Sprague Dawley rotte soleus muskel varierer fra 62 til 124 nmol / g avhengig av muskelpreparasjonsmetoder21. Den samme gruppen rapporterte nitratverdier i SD rotte vastus lateralis (ca. 60 nmol/g) og soleus (ca. 215 nmol/g) i en annen studie23. Ohtake og medarbeidere målte nitratkonsentrasjoner i mus gastrocnemius muskel på >300 nmol/g; Presise metoder for muskelhomogenatpreparering ble imidlertid ikke beskrevet24. Verdijk-gruppen rapporterte nitratinnhold i humane muskelbiopsier (vastus lateralis) fra 54 til 80 nmol/g avhengig av deltakeralder20 år; i en lignende studie rapporterer Wylie og medarbeidere 226 nmol/g for samme muskelgruppe17. Disse resultatene antyder at konsentrasjonene av nitrat / nitritt i skjelettmuskelprøver gjenspeiler mange faktorer - fysiologisk (f.eks. Treningsstatus), miljø (f.eks. Diett) og tekniske (analysedetaljer) - som alle antagelig bidrar til målevariabilitet.
Vi bestemte variabilitetskoeffisienten (CV) for alle tre metodene som presenteres her - se vedlagt tilleggsfil. Selv om CV er langt fra ideelt, og varierer mellom metodene som brukes, er våre CV-verdier sammenlignbare med de som er publisert av Troutman et al. 21 ved bruk av lignende metoder med ulik behandling av prøver. Dessverre er det fortsatt ingen klar forklaring på hvorfor så høy variabilitet vedvarer; Dette papiret er den eneste publiserte detaljerte protokollen vi kjenner til for behandling av muskelprøver for nitrat- og nitrittbestemmelse.
Vi målte også linearitet og grad av nitratutvinning fra nitratpiggede muskelprøver (se vedlagt tilleggsfil). Når vi tilsatte tre forskjellige konsentrasjoner av nitrat i gluteusprøver for homogenisering, oppnådde vi en god lineær respons i økning av nitratkonsentrasjoner med ~ 80% gjenvinning av tilsatt nitrat for både perle og roterende homogenisatorer. Disse resultatene viser at begge homogeniseringsmetodene med god sikkerhet kan brukes til bestemmelse av nitrat- og nitrittnivåer i biologiske prøver. Tapet av 20% av tilsatt nitrat skjer sannsynligvis under deproteinisering og sentrifugering av muskelvevshomogenat når noen ioner kan falle sammen med ladede proteiner eller andre celledeler.
Generelt håper vi at vår foreslåtte metode for muskelprøvepreparering for målinger av nitrat og nitritt vil vise seg nyttig ikke bare i treningsforskningsfeltet, men også i kliniske studier. Det er nevromuskulære og/eller metabolske forstyrrelser som påvirker store populasjoner som kan relatere seg til nitrogenoksidsyklusen som ikke fungerer og kan ha nytte av nitratforsyning. Imidlertid må man først fastslå om INGEN mangel faktisk eksisterer, og om den kan korrigeres ved kostholdsintervensjon. Vi håper at metoden beskrevet her vil gjøre det mulig å overvåke skjebnen til nitrat og andre metabolitter i NO-syklusen i skjelettmuskulatur og andre organer.
Vi er klar over at på dette tidspunktet av utviklingen har metoder for skjelettmuskulaturpreparasjon for nitrat- og nitrittmålinger ved bruk av kjemiluminescens (den mest kvantitative av alle bestemmelser av nitrogenoksidene selv) fortsatt ukjente variabler, hvorav noen er diskutert ovenfor. Men selv med sine begrensninger, tillater de beskrevne metodene rimelig nøyaktig sammenligning av nitrat / nitrittnivåer av forskjellige organer, inkludert forskjellige skjelettmuskler, og bør tillate formulering av hypoteser som deretter kan testes med rimelig nøyaktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter. Alan N. Schechter er oppført som medoppfinner på flere patenter utstedt til National Institutes of Health for bruk av nitrittsalter til behandling av kardiovaskulære sykdommer. Han mottar royalties basert på NIH-lisensiering av disse patentene for klinisk utvikling, men ingen annen kompensasjon. Disse ordningene påvirker ikke hans overholdelse av JoVE journalpolitikk.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av intramural NIH / NIDDK stipend ZIA DK 0251041-14 til Alan N Schechter, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
References
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A.
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al.
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
