Summary
Vi presenterar protokoll för tre olika metoder för homogenisering av fyra olika muskelgrupper i råttskelettmuskelvävnad för att mäta och jämföra nivåerna av nitrat och nitrit. Vidare jämför vi olika provvikter för att undersöka om vävnadsprovets storlek påverkar resultaten av homogenisering.
Abstract
Nitratjoner (NO3-) ansågs en gång vara inerta slutprodukter av kväveoxidmetabolism (NO). Tidigare studier visade dock att nitratjoner kan omvandlas tillbaka till NO hos däggdjur genom en tvåstegsreduktionsmekanism: nitrat reduceras till nitrit (NO2-) mestadels av orala kommensala bakterier, sedan reduceras nitrit till NO genom flera mekanismer inklusive via hem- eller molybdeninnehållande proteiner. Denna reduktiva nitratväg bidrar till att förbättra NO-medierade signalvägar, särskilt i hjärt-kärlsystemet och under muskelträning. Nitrathalterna i kroppen före sådan användning bestäms av två olika källor: endogen NO-oxidation och nitratintag via kosten, huvudsakligen från växter. För att belysa den komplexa NO-cykeln under fysiologiska omständigheter har vi undersökt vidare dynamiken i dess metaboliter, nitrat- och nitritjoner, som är relativt stabila jämfört med NO. I tidigare studier identifierades skelettmuskulaturen som ett viktigt lagringsorgan för nitratjoner hos däggdjur, samt en direkt källa till NO under träning. Därför är det viktigt att fastställa en tillförlitlig metod för att mäta nitrat- och nitritnivåer i skelettmuskulaturen och bör vara till hjälp för att utvidga dess tillämpning till andra vävnadsprover. Detta dokument förklarar i detalj beredningen av skelettmuskelprover, med hjälp av tre olika homogeniseringsmetoder, för nitrat- och nitritmätningar och diskuterar viktiga frågor relaterade till homogeniseringsprocesser, inklusive provernas storlek. Nitrat- och nitritkoncentrationer har också jämförts mellan fyra olika muskelgrupper.
Introduction
Kväveoxid (NO), en liten gasformig signalmolekyl, spelar en avgörande roll i fysiologiska och patofysiologiska processer1. NO kan framställas från L-arginin av endogena enzymer i familjen kväveoxidsyntas (NOS) innan de genomgår snabb oxidation till nitrat (NO3-) och eventuellt nitrit (NO2-) i blod och vävnader 2,3. Nyligen har dessa anjoner visat sig reduceras tillbaka till NO i däggdjurssystem4. Nitrat omvandlas till nitrit, huvudsakligen genom kommensala bakteriella nitratreduktaser i munhålan som verkar på joner som utsöndras av spottkörtlarna och direkt intas 5, och till viss del av däggdjursenzymer såsom xantinoxidoreduktas 6,7. Nitrit kan ytterligare reduceras till NO genom flera mekanismer inklusive deoxihemoglobin8, deoxymyoglobin9, molybdeninnehållande enzymer 10 och icke-enzymatisk reduktion i närvaro av protoner11,12.
Denna nitrat-nitrit-NO-väg förbättras under hypoxiska förhållanden där NOS-aktiviteten minskar eftersom NOS kräver syre för NO-generation4. Många nyligen genomförda studier har rapporterat positiva effekter av dietnitrat på blodtrycksreglering och träningsprestanda, vilket tyder på att nitratreduktionsvägar bidrar till ökningen av NO-signalering13,14,15. Tidigare studier har visat att vissa skelettmuskler sannolikt är de stora nitratlagringsplatserna i kroppen16. Jämfört med blod eller andra inre organ som lever innehåller skelettmuskulaturen (gluteus maximus) signifikant högre nitratnivåer och har en betydande massa i däggdjurskroppen. Löpbandsträning visade sig öka nitratreduktionen till nitrit och till NO i gluteus i en råtta modell7. Dessa resultat antyder att vissa skelettmuskler kan vara viktiga källor för NO genom nitratreduktionsvägar i fysiologiska situationer. Nyare studier tyder på att dessa fynd, inklusive förändringar i muskelnitratnivåer under träning, också förekommer hos människor17.
Två av de nuvarande författarna hade tidigare etablerat en metod för att mäta nitrat- och nitritnivåer i blod och andra vätskeprover18. Men när nivåerna av dessa anjoner i vävnadshomogenater initialt analyserades var detaljerade protokoll inte tillgängliga. För att förstå nitrat-nitrit-NO-dynamiken i flera olika organ var vårt mål att utveckla en exakt och effektiv metod för att mäta nitrat- och nitritnivåer i däggdjursvävnader inklusive skelettmuskulatur. I tidigare studier användes gnagarvävnader för att utveckla tillförlitliga homogeniseringsprocesser och sedan analysera nitrat- och nitritinnehåll i dessa homogenater 7,16,19. Användningen av denna homogeniseringsmetod utvidgades till humana skelettmuskelbiopsiprover, varigenom värdena bekräftades, och viktigare, de värden som observerades för muskler jämfört med blod / plasma var i liknande intervall och förhållanden som de som observerades hos gnagare17. Under de senaste åren har andra grupper också börjat mäta nitrat- och nitritnivåer i skelettmuskelhomogenater och rapporterat jämförbara värden med de som rapporterats av vår grupp20,21.
Syftet med detta protokollpapper är att i detalj beskriva beredningen av skelettmuskelhomogenater med hjälp av tre olika homogeniseringsmetoder för efterföljande mätning av nitrat- och nitritnivåer. Dessutom undersöktes effekterna av vävnadsvikt som används för homogenisering på värden av nitrat och nitrit i skelettmuskelprover. Vi tror att dessa metoder lätt kan tillämpas på andra typer av däggdjursvävnader. På senare tid, särskilt inom träningsfysiologi, hade man uppmärksammat de möjliga skillnaderna i nitrat/nitrit/NO-fysiologi beroende på muskelgrupper. Vi rapporterar också mängderna nitrat och nitrit i fyra olika gnagarmuskler och hittar en icke-enhetlig fördelning av båda jonerna mellan dessa olika muskler; en observation som kräver ytterligare studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurprotokollet godkändes av NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Djur hanterades och behandlades enligt den aktuella guiden för vård och användning av försöksdjur som finns fritt tillgänglig på AAALAC:s webbplats.
1. Råtta skelettmuskeluppsamling
- Medan en råtta är under djupbedövning (5% isofluran, bekräftad av frånvarande reaktion på svans / bennypa), starta perfusion med saltlösning innehållande heparin genom att placera en 19 G nål i en topp i vänster kammare och göra en nick på höger atrium. Låt saltlösning med heparin tränga igenom de inre organen tills minst 1,5 liter/kg har flödat genom vävnaden. Vid denna tidpunkt är djuren döda från exsanguination och slaktkroppar är redo att bearbetas för provtagning.
OBS: Att uppnå god perfusion är avgörande, särskilt för noggranna mätningar av nitrit, eftersom nitrit oxideras till nitrat av eventuellt kvarvarande hemoglobin. - Identifiera målmuskelvävnader och skär ut dem från bakbenen22 med rena kirurgiska instrument. Ta bort så mycket fett och bindväv från muskelvävnaderna som möjligt.
- Placera önskad mängd muskler i ett mikrocentrifugrör och lägg sedan på torris. Förvara rören fyllda med vävnad i frysen -80 °C.
OBS: Vid humana biopsiprover, torka dem noggrant omedelbart efter insamling med ren gasbindning för att avlägsna överskott av blod.
2. Förberedelse för homogenisering
- Beredning av nitritkonserverande lösning (stopplösning)
- Bered en klar gul lösning innehållande 890 mM kaliumferricyanid (K3Fe(CN)6) och 118 mM NEM (N-etylmaleimid) i destillerat vatten, så att inga kristaller säkerställs. Tillsätt non-joniskt ytaktivt medel (tvättmedel) i förhållandet 1:9 (v/v, materialtabell) och blanda försiktigt för att undvika skumning.
- Späd stopplösningen i förhållandet 1:9 med destillerat vatten. Placera den utspädda stopplösningen (1:5-förhållande mellan muskelvävnad och utspädd stopplösning) i homogeniseringsröret.
OBS: Tjugo milligram vävnad kräver 100 μL stopplösning, och 200 mg vävnad kräver 1000 μL stopplösning i röret. Förekomst av tvättmedel i tillsatt lösning är avgörande för störningar i cellmembranen. Alla icke-joniska tvättmedel kan användas, men man måste vara försiktig för att verifiera att det inte stör kemiluminescensmetoden.
- Vävnad beredning
- Ta ut vävnaden ur frysen på -80 °C och tina långsamt i is. Ta bort återstående fett och bindväv från skelettmuskeln. Skär av bitar av skelettmuskulaturen och fläck på gasväv för att torka.
- Väg ut mängden vävnad (20, 50 och 200 mg). Placera den förvägda skelettmuskeln i stopplösningen i homogeniseringsrören eller placera den förvägda vävnaden i ett rent mikrocentrifugrör för senare användning.
3. Homogenisering
- Roterande homogenisator (figur 1)
- Placera röret av M-typ som innehåller den förvägda skelettmuskeln och den förmätta stopplösningen i maskinen. Homogenisera varje prov två gånger (ställ in på den mest destruktiva homogeniseringscykeln) och placera röret på is omedelbart efter varje homogenisering i 5 minuter för att svalna.
- Centrifugera kort vid 2 000 × g och 4 °C i 5 minuter. Lägg tillbaka hela röret på is och tillsätt lämplig volym metanol (≥ 99,9 %, 10x vävnadsvikt). Vortex noggrant i 15 s.
OBS: För 20 mg vävnad, använd 200 μl metanol. Metanol används för att fälla ut proteiner från vävnadshomogenat och stör inte kemiluminescensmetoden. Om annan proteinutfällningsmetod används, testa dess kompatibilitet med kemiluminescens. - Homogenisera en gång till och inkubera på is i 30 minuter. Centrifugera proverna i 35 minuter vid 4 °C och 3 500 × g. Aspirera supernatanten och mät nitrit-/nitratnivåerna, eller förvara vid -80 °C för senare användning.
- Pärlhomogenisator (figur 2)
- Placera skelettmuskelvävnaden i ett pärlinnehållande rör (förhållandet 1:5 för vävnad: utspädd stopplösning) och homogenisera två gånger i 45 s med den högsta hastighet som finns på det instrument som används. Lägg röret på is omedelbart efter varje homogenisering i 5 minuter för att svalna.
- Centrifugera kort med en liten skrivbordscentrifug (2 000 x g) i 5 sekunder. Lägg tillbaka röret på is och tillsätt en lämplig volym metanol (renhetsgraden ≥ 99,9 %, 10x vävnadsvikt). Vortex noggrant i 15 s.
ANMÄRKNING 1: Använd 200 μl metanol för 20 mg vävnad.
ANMÄRKNING 2: Metanol används för att fälla ut proteiner från vävnadshomogenat och stör inte kemiluminescensmetoden. Om annan proteinutfällningsmetod används, testa dess kompatibilitet med kemiluminescens. - Homogenisera en gång till i 45 s med den högsta hastighet som finns på det instrument som används. Inkubera på is i 30 min. Centrifugera vid 17 000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirera supernatanten och mät nitrit-/nitratnivåerna, eller förvara vid -80 °C för senare användning.
- Pulveriserare (figur 3)
- Förbered rör som innehåller utspädd stopplösning (5x vävnadsvikt) och väg dem. Registrera vikten (rör + stopplösning).
- Placera pulveriseringsverktyget för flytande kväve på torris och vänta i cirka 30 minuter tills det når önskad temperatur.
- Använd pincett kyld i flytande kväve och överför ett prov (vävnadsvikt mätt redan) till pulveriseraren. Tillsätt en liten sked flytande kväve för att säkerställa att vävnaden har flytande kvävetemperatur.
- När 95% av det flytande kvävet har förångats, placera krossverktyget ovanpå vävnaden och tryck ordentligt. Du bör känna provförälskelsen. Använd klubban, slå krossverktyget 3-5x.
- Kontrollera provet för eventuella återstående bitar med en sked kyld i flytande kväve. Efter kylning i flytande kväve, använd en bit silkespapper för att torka bort fryst vatten innan du rör vid vävnaden. Om en bit är närvarande, flytta den in i mitten och slå sedan 5-6 gånger till med klubban.
- När hela provet har pulvriserats, använd den flytande kvävekylda skeden för att direkt överföra den krossade vävnaden till det förvägda röret som innehåller den utspädda stopplösningen (steg 3.3.1). Var noga med att utföra detta steg snabbt eftersom när den krossade skelettmuskeln värms upp blir den klibbig och svår att överföra.
- Vortex i 15 s. Kontrollera att ingen vävnad sitter fast på toppen av röret genom att öppna röret. Om det finns, försök att lossa det och sedan virvla igen.
- Centrifugera provet i 2-3 s med en liten skrivbordscentrifug. Väg röret igen. Beräkna vävnadsvikten genom att dra av den ursprungliga rörvikten (steg 3.3.1) från denna nya vikt. Placera röret på is.
OBS: De exakta vikterna hjälper till att bestämma den exakta vävnadsvikten och hur mycket vävnad som förlorades under pulverisering. - När alla prover har bearbetats fram till steg 3.3.8, tillsätt en lämplig volym metanol (≥ 99,9 %, 10x vävnadsvikt). Vortex noggrant i 15 s och inkubera på is i 30 min.
OBS: För 20 mg vävnad, använd 200 μl metanol. Metanol används för att fälla ut proteiner från vävnadshomogenat och stör inte kemiluminescensmetoden. Om annan proteinutfällningsmetod används, testa dess kompatibilitet med kemiluminescens. - Centrifugera vid 17 000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirera supernatanten och mät nitrit-/nitrathalterna, eller förvara vid -80 °C för senare användning.
4. Nitrit-/nitratmätning med kväveoxidanalysator (NOA)
- Bered alla prover med någon av de tre olika homogeniseringsmetoder som beskrivs ovan och injicera dem i en NOA för nitrat- och nitritmätning.
OBS: Detaljerade protokoll för NOA-användning publicerades tidigare19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att få representativa resultat användes skelettmuskelvävnader från 8 Wistar-råttor (män och kvinnor, vikt 250 ± 50 g). Råttors skelettmuskelhomogenater (50 mg gluteus maximus-muskel för varje metod) framställdes av tre olika homogeniseringsverktyg (roterande homogenisator, pärlhomogenisator och pulveriserare). Nitrat- och nitrithalten i dessa homogenater bestämdes sedan med användning av en kväveoxidanalysator (NOA) (figur 4). Nitrathalterna (figur 4A) i dessa tre homogenatprover var mycket lika varandra, från 39,6 till 45,2 nmol/g.
Intressant nog visade nitritnivåerna (figur 4B) i ett homogenatprov framställt av en pulveriserare det högsta värdet (0,99 ± 0,15 nmol / g), och detta skilde sig statistiskt från de två andra provvärdena. För att testa om vävnadernas storlek skulle påverka homogeniseringseffektiviteten och de resulterande nitrat- och nitritvärdena användes tre olika skelettmuskelvävnadsstorlekar (gluteusmuskelvävnad på 20, 50 och 200 mg) för homogenisering med en pärlhomogenisator (figur 5). Varken nitratnivåerna (figur 5A) eller nitritnivåerna (figur 5B) skilde sig signifikant mellan muskelprovstorlekarna. Något lägre nitratkoncentrationer observerades dock när provstorleken ökades, i flera experiment av oklara skäl.
Därefter mättes nitrat- och nitritnivåer i olika typer av gnagarbensskelettmuskelvävnader (figur 6). Förutom gluteus maximus-muskeln isolerades tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL) och gastrocnemius-musklerna (50 mg vardera) från råttben och homogeniserades med användning av en pärlhomogenisator. Överraskande nog var nitratnivåerna i gluteusmuskeln (40,4 nmol/g) ungefär två gånger högre än för de andra tre muskelvävnaderna, även om dessa skillnader i just detta experiment inte nådde statistisk signifikans (figur 6A). Nitritkoncentrationen i gluteusmuskeln var också högre än för de andra tre muskelvävnaderna och var signifikant högre än i gastrocnemiusprovet (figur 6B).
Vi bestämde variationskoefficienten för alla tre metoder som används och resultaten finns i bifogad tabell. Som jämförelse visar tabellen också variationskoefficienter bestämda av Troutman etal 21.
Figur 1: Roterande homogenisator. a) Homogenisator. B) Rör som innehåller vävnad och stopplösning. Skelettmuskelvävnadsprover placeras i ett rör med utspädd stopplösning och homogeniseras tre gånger. Proverna bör omedelbart läggas på is efter varje homogeniseringssteg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Pärlhomogenisator. a) Homogenisator. B) Pärlor som innehåller rör. Skelettmuskelvävnadsprover placeras i ett pärlinnehållande rör (5 keramiska pärlor) med utspädd stopplösning och homogeniseras totalt tre gånger (45 s vid högsta hastighet för varje gång). Proverna bör omedelbart läggas på is efter varje homogeniseringssteg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Pulveriserare . (A) pulveriseringsdelar (B) pulveriseringskropp - murbruk och stöt monterade. C) Uppgifter om mortel- och stötaggregat. Pulveriseringsdelar kyls på torris i 30 minuter. Flytande kväve läggs i morteln och sedan tillsätts förvägd skelettmuskelvävnad. Efter att 90 procent av det flytande kvävet är borta sätts den övre delen - stöten - in i bassängen. Stöten dunkas med en klubba 5-6 gånger tills provet är pulverformigt. Den pulveriserade vävnaden överförs sedan till ett rör med stopplösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: (A) Nitrat- och (B) nitritinnehåll i gluteusmuskelhomogenater framställda med tre olika homogeniseringsmetoder. Femtio milligram gluteusmuskel homogeniserades med tre olika homogeniseringsmetoder. Metanol (500 μL) tillsattes till homogenaterna för att fälla ut proteiner. En standardkemiluminescensmetod med vanadinklorid eller trijodidlösning användes för att mäta nitrat- respektive nitritnivåerna i den klara supernatanten efter centrifugering. n=7 (nitrat), n=8 (nitrit); data presenteras som medelvärden ± SD, * p < 0,05 med hjälp av envägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: (A) Nitrat- och (B) nitritinnehåll i olika provstorlekar av gluteusmuskel. Tre olika storlekar av gluteusmuskelhomogenater framställdes med användning av en pärlhomogenisator. En standardkemiluminescensmetod med vanadinklorid eller trijodidlösning användes för att mäta nitrat- respektive nitritnivåerna i den klara supernatanten efter centrifugering. n=7 (nitrat), n=8 (nitrit); data presenteras som medelvärden ± SD, Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: (A) Nitrat- och (B) nitritinnehåll i fyra olika muskler. Varje muskel (50 mg) homogeniserades med användning av en pärlhomogenisator, och en standardkemiluminescensmetod med vanadinklorid eller trijodidlösning användes för att mäta nitrat- respektive nitritnivåer; n=4-7 (nitrat); n=3-8 (nitrit); data presenteras som medelvärden ± SD, * p < 0,05 med hjälp av envägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att övervaka förändringar i NO-metaboliterna, nitrat och nitrit, som en funktion av fysiologiska ingrepp, är det absolut nödvändigt att mäta nivåerna av dessa joner i de olika organen som är kritiska i deras ämnesomsättning. Eftersom hemoglobin i blod kommer att reagera med NO och dess metaboliter är det också viktigt att snabbt ta bort blod från vävnadsprover så mycket som möjligt. Således perfuserades djur med saltlösning innan de samlade skelettmuskelvävnader (gluteus, TA, EDL, gastrocnemiusmuskel) och bindväv och fett runt målmuskeln avlägsnades omedelbart. För homogeniseringslösningen formulerades en "stopplösning" speciellt med ferricyanid, NEM och icke-joniskt ytaktivt medel för att bevara nitrit i olika vävnader19. Närvaron av icke-joniskt tvättmedel är avgörande för fullständig störning av cellmembran. När det gäller de två homogeniseringsmaskinerna som användes i denna studie, den roterande homogenisatorn och pärlhomogenisatorn, var volymen stopplösning som krävdes för homogenisering 5x vävnadsvikten så att hela vävnaden var helt nedsänkt i lösningen och bearbetades homogent.
Homogeniseringsprocessen utfördes totalt tre gånger (två gånger före tillsats av metanol och ytterligare en gång efter tillsats av metanol för att fälla ut proteiner), varje gång med användning av en programmerad inställning bestämd av instrumenttillverkarna. Det är viktigt att placera prover på is omedelbart efter varje homogenisering för att förhindra att provet försämras genom den milda uppvärmningen, som kan genereras under homogenisering. För pulveriseringsmetoden krossades vävnadsprover initialt till pulver medan de hölls frysta med flytande kväve, sedan blandades prover med stopplösning (5x vävnadsvikt). I alla tre metoderna tillsattes metanol (10x vävnadsvikt) till proverna och blandningen inkuberades på is i 30 minuter för att fälla ut proteiner och fullständigt extrahera nitrat och nitrit från vävnaderna. Närvaron av proteiner i prov kan orsaka överdriven skumning av reaktionslösningen i kammaren vid användning av kemiluminescens, så det är nödvändigt att fälla ut proteiner från proverna. Vilket utfällningsmedel som helst kan användas, men det är nödvändigt att bekräfta att sådana medel inte kommer att störa vare sig kemiluminescensmetoden eller orsaka förändringar i nitrit-/nitratkoncentrationerna genom att reagera med dessa joner.
Nitrathalterna i alla gluteusprover framställda med de tre metoderna var mycket lika (39,6-45,2 nmol/g, figur 4A), vilket tyder på att dessa tre homogeniseringsmetoder är lika tillämpliga för att förbereda muskelprover för nitratanalys. Även om nitritnivåerna var något högre i prover som framställts genom pulverisering jämfört med de två andra metoderna (figur 4B), var alla uppmätta värden i ett begränsat intervall (0,64-0,99 nmol/g). Effekten av vävnadsprovstorlek på nitrat- och nitritvärden i skelettmuskelprover undersöktes eftersom forskare ofta hanterar mycket små prover, särskilt från små djur eller humana muskelbiopsier. Varken nitrat- eller nitritnivåerna skilde sig signifikant i intervallet från 20 till 200 mg skelettmuskelvävnad i dessa experiment (figur 5).
Det är dock anmärkningsvärt att nitrathalterna, även om de inte är statistiskt signifikanta, tenderar att vara något lägre när de mäts i större prover (figur 5). Vi har märkt detta fenomen under våra publicerade och opublicerade studier, men vi förstår inte orsakerna till det. Därför är det förmodligen viktigt att överväga provvikterna och helst hålla dem konsekventa under en studie när man förbereder homogenater från flera vävnadsprover. Ett annat övervägande när man arbetar med mindre prover (20 mg) är att den slutliga totala volymen bearbetat prov endast är ~ 300 μL, vilket avsevärt minskar möjligheten att mäta samma prov flera gånger. Emellertid, särskilt för studier på människa, 20 mg är den vanliga acceptabla storleken för muskelbiopsier.
För att undersöka om olika muskler i råttben skulle ha olika nitrat/nitritinnehåll jämfördes koncentrationerna av dessa joner i fyra olika benmuskler (figur 6). Både nitrat- och nitritnivåerna var högst i gluteusmuskeln jämfört med tre andra muskelvävnader, även om skillnaderna inte nådde statistisk signifikans i denna studie, vilket tyder på att nitratmetabolismen i olika muskeltyper kan styras annorlunda. Detta fenomen undersöks mer detaljerat för närvarande.
Andra forskargrupper har också rapporterat koncentrationer av skelettmuskelnitrat, vilket avslöjar betydande variationer i dessa värden. Coggan-gruppen visade att nitratnivåerna i Sprague Dawley råtta soleusmuskel varierar från 62 till 124 nmol/g beroende på muskelberedningsmetoder21. Samma grupp rapporterade nitratvärden i SD råtta vastus lateralis (cirka 60 nmol/g) och soleus (cirka 215 nmol/g) i en annan studie23. mätte nitratkoncentrationer i mus gastrocnemius muskel på >300 nmol/g; Exakta metoder för muskelhomogenatberedning beskrevs emellertid inte24. Verdijk-gruppen rapporterade nitrathalter i humana muskelbiopsier (vastus lateralis) från 54 till 80 nmol/g beroende på deltagarens ålder20; rapporterar 226 nmol/g för samma muskelgrupp17. Dessa resultat tyder på att koncentrationerna av nitrat / nitrit i skelettmuskelprover återspeglar många faktorer - fysiologiska (t.ex. träningsstatus), miljö (t.ex. kost) och tekniska (analysdetaljer) - som alla förmodligen bidrar till mätvariation.
Vi bestämde variabilitetskoefficienten (CV) för alla tre metoder som presenteras här - se bifogad kompletterande fil. Även om CV är långt ifrån idealiskt, och varierar mellan de metoder som används, är våra CV-värden jämförbara med de som publicerats av Troutman et al. 21 med liknande metoder med olika behandling av prover. Tyvärr finns det fortfarande ingen tydlig förklaring till varför så stora variationer kvarstår; Detta dokument är det enda publicerade detaljerade protokollet vi känner till för bearbetning av muskelprover för nitrat- och nitritbestämning.
Vi mätte också linjäritet och grad av nitratåtervinning från nitratspetsade muskelprover (se bifogad kompletterande fil). När vi tillsatte tre olika koncentrationer av nitrat i gluteusprover för homogenisering fick vi ett bra linjärt svar i ökningen av nitratkoncentrationer med ~ 80% återvinning av tillsatt nitrat för både pärl- och roterande homogenisatorer. Dessa resultat visar att båda homogeniseringsmetoderna kan användas för bestämning av nitrat- och nitritnivåer i biologiska prover med god säkerhet. Förlusten av 20% tillsatt nitrat sker sannolikt under deproteinisering och centrifugering av muskelvävnadshomogenat när vissa joner kan fällas ut med laddade proteiner eller andra celldelar.
I allmänhet hoppas vi att vår föreslagna metod för muskelprovberedning för mätningar av nitrat och nitrit kommer att visa sig vara användbar inte bara inom träningsforskningsområdet utan också i kliniska studier. Det finns neuromuskulära och/eller metaboliska störningar som drabbar stora populationer som kan relatera till kväveoxidcykelfel och kan dra nytta av nitrattillförsel. Man måste dock först fastställa om INGEN brist faktiskt existerar och om den kan korrigeras genom kostintervention. Vi hoppas att metoden som beskrivs här kommer att göra det möjligt att övervaka ödet för nitrat och andra metaboliter i NO-cykeln i skelettmuskulaturen och andra organ
Vi är medvetna om att vid denna tidpunkt av dess utveckling har metoder för skelettmuskelberedning för nitrat- och nitritmätningar med kemiluminescens (den mest kvantitativa av alla bestämningar av kväveoxiderna själva) fortfarande okända variabler, av vilka några diskuteras ovan. Men även med sina begränsningar möjliggör de beskrivna metoderna rimligt exakta jämförelser av nitrat/ nitritnivåer i olika organ, inklusive olika skelettmuskler, och bör möjliggöra formulering av hypoteser som sedan kan testas med rimlig noggrannhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter. Alan N. Schechter är listad som meduppfinnare på flera patent som utfärdats till National Institutes of Health för användning av nitritsalter för behandling av hjärt-kärlsjukdomar. Han erhåller royalties baserat på NIH-licensiering av dessa patent för klinisk utveckling men ingen annan ersättning. Dessa arrangemang påverkar inte hans efterlevnad av JoVE-journalpolicyer.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av intramural NIH/NIDDK-bidrag ZIA DK 0251041-14 till Alan N Schechter, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
References
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A.
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al.
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
