Summary
Presentamos protocolos para tres métodos diferentes para la homogeneización de cuatro grupos musculares diferentes de tejido muscular esquelético de rata para medir y comparar los niveles de nitrato y nitrito. Además, comparamos diferentes pesos de muestra para investigar si el tamaño de la muestra de tejido afecta los resultados de la homogeneización.
Abstract
Alguna vez se pensó que los iones de nitrato (NO3-) eran productos finales inertes del metabolismo del óxido nítrico (NO). Sin embargo, estudios previos demostraron que los iones de nitrato pueden convertirse de nuevo en NO en mamíferos a través de un mecanismo de reducción de dos pasos: el nitrato se reduce a nitrito (NO2-) principalmente por bacterias comensales orales, luego el nitrito se reduce a NO por varios mecanismos, incluso a través de proteínas que contienen hemo o molibdeno. Esta vía reductora del nitrato contribuye a mejorar las vías de señalización mediadas por NO, particularmente en el sistema cardiovascular y durante el ejercicio muscular. Los niveles de nitrato en el cuerpo antes de tal utilización están determinados por dos fuentes diferentes: oxidación endógena de NO y la ingesta de nitrato en la dieta, principalmente de plantas. Para dilucidar el ciclo complejo de NO en circunstancias fisiológicas, hemos examinado más a fondo la dinámica de sus metabolitos, iones de nitrato y nitrito, que son relativamente estables en comparación con NO. En estudios previos se identificó el músculo esquelético como un importante órgano de almacenamiento de iones de nitrato en mamíferos, así como una fuente directa de NO durante el ejercicio. Por lo tanto, establecer una metodología confiable para medir los niveles de nitrato y nitrito en el músculo esquelético es importante y debería ser útil para extender su aplicación a otras muestras de tejido. Este artículo explica en detalle la preparación de muestras de músculo esquelético, utilizando tres métodos de homogeneización diferentes, para mediciones de nitratos y nitritos y discute cuestiones importantes relacionadas con los procesos de homogeneización, incluido el tamaño de las muestras. Las concentraciones de nitrato y nitrito también se han comparado en cuatro grupos musculares diferentes.
Introduction
El óxido nítrico (NO), una pequeña molécula de señalización gaseosa, desempeña un papel crítico en los procesos fisiológicos y fisiopatológicos1. El NO puede ser producido a partir de L-arginina por enzimas endógenas de la familia de la óxido nítrico sintasa (NOS) antes de someterse a una rápida oxidación a nitrato (NO 3-) y, posiblemente, nitrito (NO2-) en sangre y tejidos 2,3. Recientemente, se ha demostrado que estos aniones se reducen de nuevo a NO en los sistemas de mamíferos4. El nitrato se convierte en nitrito, principalmente por nitrato reductasas bacterianas comensales en la cavidad oral que actúan sobre iones secretados por las glándulas salivales e ingeridos directamente 5, y en cierta medida, por enzimas de mamíferos como la xantina oxidorreductasa 6,7. El nitrito puede reducirse aún más a NO por varios mecanismos, incluyendo la desoxihemoglobina8, la desoximioglobina9, las enzimas que contienen molibdeno 10 y la reducción no enzimática en presencia de protones11,12.
Esta vía nitrato-nitrito-NO se mejora en condiciones hipóxicas en las que la actividad de NOS disminuye porque NOS requiere oxígeno para la generaciónde NO 4. Muchos estudios recientes han reportado efectos beneficiosos del nitrato dietético sobre la regulación de la presión arterial y el rendimiento del ejercicio, sugiriendo que las vías de reducción de nitrato contribuyen al aumento de la señalización de NO13,14,15. Estudios previos han demostrado que algunos músculos esqueléticos son probablemente los principales lugares de almacenamiento de nitrato en el cuerpo16. En comparación con la sangre u otros órganos internos como el hígado, el músculo esquelético (glúteo mayor) contiene niveles significativamente más altos de nitrato y tiene una masa sustancial en el cuerpo de los mamíferos. Se demostró que el ejercicio en cinta rodante mejora la reducción de nitratos a nitrito y NO en glúteos en un modelo de rata7. Estos resultados implican que algunos músculos esqueléticos podrían ser fuentes importantes de NO a través de vías de reducción de nitratos en situaciones fisiológicas. Estudios más recientes sugieren que estos hallazgos, incluyendo cambios en los niveles de nitrato muscular durante el ejercicio, también ocurren en humanos17.
Dos de los autores actuales habían establecido previamente un método para medir los niveles de nitrato y nitrito en muestras de sangre y otros líquidos18. Sin embargo, cuando se analizaron inicialmente los niveles de estos aniones en homogeneizados tisulares, no se disponía de protocolos detallados. Para comprender la dinámica nitrato-nitrito-NO en varios órganos diferentes, nuestro objetivo era desarrollar un método preciso y eficiente para medir los niveles de nitrato y nitrito en tejidos de mamíferos, incluido el músculo esquelético. En estudios anteriores, los tejidos de roedores fueron utilizados para desarrollar procesos de homogeneización confiables y luego analizar el contenido de nitrato y nitrito en esos homogeneizados 7,16,19. El uso de este método de homogeneización se extendió a muestras de biopsia de músculo esquelético humano, por lo que los valores fueron confirmados, y es importante destacar que los valores observados para el músculo en comparación con la sangre / plasma estaban en rangos y proporciones similares a los observados en roedores17. En los últimos años, otros grupos también comenzaron a medir los niveles de nitrato y nitrito en homogeneizados del músculo esquelético, reportando valores comparables a los reportados por nuestro grupo20,21.
El objetivo de este documento de protocolo es describir en detalle la preparación de homogeneizados del músculo esquelético utilizando tres métodos de homogeneización diferentes para la medición posterior de los niveles de nitrato y nitrito. Además, se examinaron los efectos del peso del tejido utilizado para la homogeneización sobre los valores de nitrato y nitrito en muestras de músculo esquelético. Creemos que estos métodos se pueden aplicar fácilmente a otros tipos de tejidos de mamíferos. Recientemente, especialmente en el campo de la fisiología del ejercicio, se había prestado atención a las posibles diferencias en la fisiología de nitrato/nitrito/NO según los grupos musculares. También informamos las cantidades de nitrato y nitrito en cuatro músculos roedores diferentes y encontramos una distribución no uniforme de ambos iones entre estos músculos diferentes; una observación que requiere más estudio.
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Protocol
El protocolo animal fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del NIDDK (ASP K049-MMB-20). Los animales fueron manejados y tratados de acuerdo con la Guía actual para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio disponible gratuitamente en el sitio web de AAALAC.
1. Colección de músculo esquelético de rata
- Mientras una rata está bajo anestesia profunda (isoflurano al 5%, confirmado por la ausencia de reacción al pellizco de la cola / pierna), comience la perfusión con solución salina que contenga heparina colocando una aguja de 19 G en un ápice del ventrículo izquierdo y haciendo un corte en la aurícula derecha. Permita que la solución salina con heparina perfunda a través de los órganos internos hasta que al menos 1,5 litros/kg hayan fluido a través del tejido. En este punto, los animales están muertos por exsanguinación y los cadáveres están listos para ser procesados para la recolección de muestras.
NOTA: Lograr una buena perfusión es crítico, especialmente para mediciones precisas de nitrito, porque el nitrito se oxida en nitrato por cualquier hemoglobina restante. - Identificar los tejidos musculares objetivo y extirparlos de las patas traseras22 utilizando instrumentos quirúrgicos limpios. Retire tanta grasa y tejidos conectivos de los tejidos musculares como sea posible.
- Coloque la cantidad deseada de músculo en un tubo de microcentrífuga y luego colóquela en hielo seco. Guarde los tubos llenos de pañuelos de papel en el congelador a -80 °C.
NOTA: En el caso de muestras de biopsia humana, séquelas completamente inmediatamente después de la recolección con una gasa limpia para eliminar el exceso de sangre.
2. Preparación para la homogeneización
- Preparación de solución conservadora de nitrito (solución de parada)
- Preparar una solución amarilla transparente que contenga 890 mM de ferricianuro de potasio (K3Fe(CN)6) y 118 mM de NEM (N-etilmaleimida) en agua destilada, asegurándose de que no haya cristales. Agregue surfactante no iónico (detergente) en una proporción de 1: 9 (v / v, Tabla de materiales) y mezcle suavemente para evitar la formación de espuma.
- Diluir la solución de parada en una proporción de 1:9 con agua destilada. Coloque la solución de parada diluida (proporción 1:5 de tejido muscular a solución de parada diluida) en el tubo de homogeneización.
NOTA: Veinte miligramos de tejido requerirán 100 μL de solución de parada, y 200 mg de tejido requerirán 1000 μL de solución de parada en el tubo. La presencia de detergente en la solución añadida es crítica para la interrupción de las membranas celulares. Se puede usar cualquier detergente no iónico, pero se debe tener cuidado para verificar que no interfiera con el método de quimioluminiscencia.
- Preparación de tejidos
- Saque el tejido del congelador a -80 °C y descongele lentamente en hielo. Retire la grasa restante y el tejido conectivo del músculo esquelético. Corte los trozos de músculo esquelético y seque la gasa para que se seque.
- Pese la cantidad de tejido (20, 50 y 200 mg). Coloque el músculo esquelético previamente pesado en la solución de parada en los tubos de homogeneización o coloque el tejido prepesado en un tubo de microcentrífuga limpio para su uso posterior.
3. Homogeneización
- Homogeneizador rotativo (Figura 1)
- Coloque el tubo tipo M que contiene el músculo esquelético previamente pesado y la solución de parada premedida en la máquina. Homogeneice cada muestra dos veces (fijando en el ciclo de homogeneización más destructivo) y coloque el tubo en hielo inmediatamente después de cada homogeneización durante 5 minutos para que se enfríe.
- Centrifugar brevemente a 2.000 × g y 4 °C durante 5 min. Vuelva a colocar el tubo lleno sobre hielo y añada el volumen adecuado de metanol (≥ 99,9 %, 10 veces el peso del tejido). Vórtice a fondo durante 15 s.
NOTA: Para 20 mg de tejido, utilice 200 μL de metanol. El metanol se utiliza para precipitar proteínas del homogeneizado tisular y no interfiere con el método de quimioluminiscencia. Si se utiliza otro método de precipitación de proteínas, pruebe su compatibilidad con la quimioluminiscencia. - Homogeneizar una vez más e incubar en hielo durante 30 min. Centrifugar las muestras durante 35 min a 4 °C y 3.500 × g. Aspirar el sobrenadante y medir los niveles de nitrito/nitrato, o almacenar a -80 °C para su uso posterior.
- Homogeneizador de cuentas (Figura 2)
- Coloque el tejido muscular esquelético en un tubo que contenga perlas (proporción 1:5 para tejido: solución de parada diluida) y homogeneice dos veces durante 45 s a la velocidad más alta disponible en el instrumento utilizado. Coloque el tubo en hielo inmediatamente después de cada homogeneización durante 5 minutos para que se enfríe.
- Centrifugar brevemente con una centrífuga de escritorio pequeña (2.000 x g) durante 5 segundos. Vuelva a colocar el tubo sobre hielo y añadir un volumen adecuado de metanol (pureza ≥ 99,9 %, 10 veces el peso del tejido). Vórtice a fondo durante 15 s.
NOTA 1: Para 20 mg de tejido, utilizar 200 μL de metanol.
NOTA 2: El metanol se utiliza para precipitar proteínas del homogeneizado tisular y no interfiere con el método de quimioluminiscencia. Si se utiliza otro método de precipitación de proteínas, pruebe su compatibilidad con la quimioluminiscencia. - Homogeneizar una vez más durante 45 s a la velocidad más alta disponible en el instrumento utilizado. Incubar en hielo durante 30 min. Centrífuga a 17.000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirar el sobrenadante y medir los niveles de nitrito/nitrato, o almacenar a -80 °C para su uso posterior.
- Pulverizador (Figura 3)
- Prepare tubos que contengan solución de parada diluida (5 veces el peso del tejido) y péselos. Registre el peso (tubo + solución de parada).
- Coloque la herramienta pulverizadora de nitrógeno líquido en hielo seco y espere aproximadamente 30 minutos para que alcance la temperatura deseada.
- Usando pinzas enfriadas en nitrógeno líquido, transfiera una muestra (el peso del tejido ya se ha medido) al pulverizador. Agregue una cucharada pequeña de nitrógeno líquido para asegurarse de que el tejido esté a temperatura de nitrógeno líquido.
- Después de que el 95% del nitrógeno líquido se haya vaporizado, coloque la herramienta de trituración sobre el tejido y presione firmemente. Deberías sentir el aplastamiento de la muestra. Usando el mazo, golpee la herramienta de trituración 3-5x.
- Revise la muestra en busca de trozos restantes con una cuchara enfriada en nitrógeno líquido. Después de enfriar en nitrógeno líquido, use un pedazo de papel de seda para limpiar el agua congelada antes de tocar el pañuelo. Si hay un trozo presente, muévalo hacia el centro y luego golpea 5-6 veces más con el mazo.
- Cuando se haya pulverizado toda la muestra, utilizar la cuchara líquida refrigerada por nitrógeno para transferir directamente el tejido triturado al tubo previamente pesado que contiene la solución de parada diluida (paso 3.3.1). Asegúrese de realizar este paso rápidamente, ya que cuando el músculo esquelético aplastado se calienta, se vuelve pegajoso y difícil de transferir.
- Vórtice durante 15 s. Verifique que no haya tejido atascado en la parte superior del tubo abriendo el tubo. Si lo hay, trate de desalojarlo y luego vuelva a vomarcar.
- Centrifugar la muestra durante 2-3 s utilizando una pequeña centrífuga de escritorio. Vuelva a pesar el tubo. Calcule el peso del tejido deduciendo el peso original del tubo (paso 3.3.1) de este nuevo peso. Coloque el tubo sobre hielo.
NOTA: Los pesos exactos ayudarán a determinar el peso exacto del tejido y la cantidad de tejido que se perdió durante la pulverización. - Una vez que todas las muestras hayan sido procesadas hasta el paso 3.3.8, añadir un volumen adecuado de metanol (≥ 99,9 %, 10 veces el peso del tejido). Vortex a fondo durante 15 s, e incubar en hielo durante 30 min.
NOTA: Para 20 mg de tejido, utilice 200 μL de metanol. El metanol se utiliza para precipitar proteínas del homogeneizado tisular y no interfiere con el método de quimioluminiscencia. Si se utiliza otro método de precipitación de proteínas, pruebe su compatibilidad con la quimioluminiscencia. - Centrífuga a 17.000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirar el sobrenadante y medir los niveles de nitrito/nitrato, o almacenar a -80 °C para su uso posterior.
4. Medición de nitrito/nitrato con analizador de óxido nítrico (NOA)
- Prepare todas las muestras mediante cualquiera de los tres métodos de homogeneización descritos anteriormente e inyéctelas en un NOA para la medición de nitratos y nitritos.
NOTA: Los protocolos detallados para el uso de NOA se publicaron anteriormente19.
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Representative Results
Para obtener resultados representativos, se utilizaron tejidos del músculo esquelético de 8 ratas Wistar (machos y hembras, peso 250 ± 50 g). Los homogeneizados del músculo esquelético de rata (50 mg de músculo glúteo mayor para cada método) se prepararon mediante tres herramientas de homogeneización diferentes (homogeneizador rotativo, homogeneizador de perlas y pulverizador). Los contenidos de nitrato y nitrito de estos homogeneizados se determinaron utilizando un analizador de óxido nítrico (NOA) (Figura 4). Los niveles de nitrato (Figura 4A) en esas tres muestras homogeneizadas fueron muy similares entre sí, variando de 39,6 a 45,2 nmol/g.
Curiosamente, los niveles de nitrito (Figura 4B) en una muestra homogeneizada preparada por un pulverizador mostraron el valor más alto (0,99 ± 0,15 nmol/g), y esto fue estadísticamente diferente de los otros dos valores de la muestra. Para probar si el tamaño de los tejidos afectaría la eficiencia de homogeneización y los valores resultantes de nitrato y nitrito, se utilizaron tres tamaños diferentes de tejido muscular esquelético (tejido muscular glúteo de 20, 50 y 200 mg) para la homogeneización mediante un homogeneizador de perlas (Figura 5). Ni los niveles de nitrato (Figura 5A) ni de nitrito (Figura 5B) fueron significativamente diferentes entre los tamaños de muestra muscular. Sin embargo, se observaron concentraciones de nitrato ligeramente más bajas cuando se aumentó el tamaño de la muestra, en múltiples experimentos por razones que no están claras.
A continuación, se midieron los niveles de nitrato y nitrito en diferentes tipos de tejidos del músculo esquelético de las patas de roedor (Figura 6). Además del músculo glúteo mayor, el tibial anterior (TA), el extensor largo de los dedos (EDL) y los músculos gastrocnemios (50 mg cada uno) se aislaron de patas de rata y se homogeneizaron utilizando un homogeneizador de cuentas. Sorprendentemente, los niveles de nitrato del músculo glúteo (40,4 nmol/g) fueron aproximadamente dos veces más altos que los de los otros tres tejidos musculares, aunque en este experimento en particular estas diferencias no alcanzaron significación estadística (Figura 6A). La concentración de nitrito en el músculo glúteo también fue mayor que la de los otros tres tejidos musculares y fue significativamente mayor que la de la muestra de gastrocnemio (Figura 6B).
Se determinó el coeficiente de variación para los tres métodos utilizados y los resultados se encuentran en la tabla adjunta. A modo de comparación, la tabla también muestra los coeficientes de variación determinados por Troutman et al21.
Figura 1: Homogeneizador rotatorio. a) homogeneizador; (B) tubo que contiene tejido y solución de parada. Las muestras de tejido muscular esquelético se colocan en un tubo con solución de parada diluida y se homogeneizan tres veces. Las muestras deben colocarse inmediatamente en hielo después de cada paso de homogeneización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Homogeneizador de cuentas. a) homogeneizador; (B) cuentas que contienen tubo. Las muestras de tejido muscular esquelético se colocan en un tubo que contiene perlas (5 perlas de cerámica) con solución de parada diluida y se homogeneizan tres veces en total (45 s a la velocidad máxima por cada vez). Las muestras deben colocarse inmediatamente en hielo después de cada paso de homogeneización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pulverizador . (A) partes del pulverizador (B) cuerpo del pulverizador - mortero y mortero ensamblados. (C) detalle del conjunto de mortero y mortero. Las piezas pulverizadoras se enfrían en hielo seco durante 30 minutos. El nitrógeno líquido se coloca en el mortero y luego se agrega tejido muscular esquelético previamente pesado. Después de que el 90 por ciento del nitrógeno líquido se ha ido, la parte superior, el mortero, se inserta en la cuenca. El mortero se golpea con un mazo 5-6 veces hasta que la muestra esté en polvo. El tejido en polvo se transfiere a un tubo con solución de parada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: (A) contenido de nitrato y (B) nitrito en homogeneizados musculares glúteos preparados por tres métodos de homogeneización diferentes. Cincuenta miligramos de músculo glúteo fueron homogeneizados por tres métodos de homogeneización diferentes. Se añadió metanol (500 μL) a los homogeneizados para precipitar proteínas. Se utilizó un método estándar de quimioluminiscencia con solución de cloruro de vanadio o triyoduro para medir los niveles de nitrato y nitrito, respectivamente, en el sobrenadante transparente después de la centrifugación; n=7 (nitrato); n=8 (nitrito); los datos se presentan como promedios ± DE, * p < 0,05 utilizando ANOVA unidireccional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: (A) contenido de nitrato y (B) nitrito en diferentes tamaños de muestra de músculo glúteo. Se prepararon tres tamaños diferentes de homogeneizados musculares de glúteos utilizando un homogeneizador de perlas. Se utilizó un método estándar de quimioluminiscencia con solución de cloruro de vanadio o triyoduro para medir los niveles de nitrato y nitrito, respectivamente, en el sobrenadante transparente después de la centrifugación; n=7 (nitrato); n=8 (nitrito); los datos se presentan como promedios ± DE, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: (A) contenido de nitrato y (B) nitrito en cuatro músculos diferentes. Cada músculo (50 mg) se homogeneizó mediante el uso de un homogeneizador de perlas, y se utilizó un método estándar de quimioluminiscencia con solución de cloruro de vanadio o triyoduro para medir los niveles de nitrato y nitrito, respectivamente; n=4-7 (nitrato); n=3-8 (nitrito); los datos se presentan como promedios ± DE, * p < 0,05 utilizando ANOVA unidireccional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para monitorear los cambios en los metabolitos de NO, nitrato y nitrito, en función de las intervenciones fisiológicas, es imperativo medir los niveles de estos iones en los diferentes órganos que son críticos en su metabolismo. Como la hemoglobina en la sangre reaccionará con el NO y sus metabolitos, también es importante eliminar la sangre rápidamente de las muestras de tejido tanto como sea posible. Por lo tanto, los animales fueron perfundidos con solución salina antes de recolectar tejidos del músculo esquelético (glúteo, TA, EDL, músculo gastrocnemio), y el tejido conectivo y la grasa alrededor del músculo objetivo se eliminaron inmediatamente. Para la solución de homogeneización, se formuló una "solución de parada" especialmente con ferricianuro, NEM y surfactante no iónico para preservar el nitrito en diversos tejidos19. La presencia de detergente no iónico es crítica para la interrupción completa de las membranas celulares. En el caso de las dos máquinas de homogeneización utilizadas en este estudio, el homogeneizador rotativo y el homogeneizador de perlas, el volumen de solución de parada requerido para la homogeneización fue 5 veces el peso del tejido, de modo que todo el tejido se sumergió completamente en la solución y se procesó homogéneamente.
El proceso de homogeneización se realizó tres veces en total (dos veces antes de agregar metanol y una vez más después de agregar metanol para precipitar proteínas), cada vez utilizando un ajuste programado determinado por los fabricantes del instrumento. Es importante colocar las muestras en hielo inmediatamente después de cada homogeneización para evitar el deterioro de la muestra por el calentamiento suave, que puede generarse durante la homogeneización. Para el método de pulverización, las muestras de tejido se trituraron inicialmente en polvo mientras se mantenían congeladas con nitrógeno líquido, luego las muestras se mezclaron con solución de parada (5 veces el peso del tejido). En los tres métodos, se agregó metanol (10 veces el peso del tejido) a las muestras, y la mezcla se incubó en hielo durante 30 minutos para precipitar proteínas y extraer completamente nitrato y nitrito de los tejidos. La presencia de proteínas en la muestra puede causar una formación excesiva de espuma de la solución de reacción en la cámara cuando se usa quimioluminiscencia, por lo que es necesario precipitar proteínas de las muestras. Se puede usar cualquier agente de precipitación, pero es necesario confirmar que dichos agentes no interferirán con el método de quimioluminiscencia ni causarán cambios en las concentraciones de nitrito / nitrato al reaccionar con estos iones.
Los niveles de nitrato en todas las muestras de glúteos preparadas por los tres métodos fueron muy similares (39.6-45.2 nmol / g, Figura 4A), lo que sugiere que estos tres métodos de homogeneización son igualmente aplicables a la preparación de muestras musculares para el análisis de nitratos. Aunque los niveles de nitrito fueron ligeramente más altos en las muestras preparadas por pulverización en comparación con los otros dos métodos (Figura 4B), todos los valores medidos estaban en un rango limitado (0.64-0.99 nmol / g). Se examinó el efecto del tamaño de la muestra de tejido sobre los valores de nitrato y nitrito en muestras de músculo esquelético porque los investigadores a menudo tratan con muestras muy pequeñas, particularmente de animales pequeños o biopsias musculares humanas. Ni los niveles de nitrato ni de nitrito fueron significativamente diferentes en el rango de 20 a 200 mg de tejido muscular esquelético en estos experimentos (Figura 5).
Sin embargo, cabe destacar que, aunque no son estadísticamente significativos, los niveles de nitrato tienden a ser ligeramente más bajos cuando se miden en muestras más grandes (Figura 5). Hemos notado este fenómeno en el transcurso de nuestros estudios publicados e inéditos, pero no entendemos las razones de ello. Por lo tanto, probablemente sea importante considerar los pesos de las muestras e idealmente mantenerlos consistentes a lo largo de un estudio al preparar homogeneizados a partir de múltiples muestras de tejido. Otra consideración cuando se trabaja con muestras más pequeñas (20 mg) es que el volumen total final de la muestra procesada es de solo ~ 300 μL, lo que reduce significativamente la posibilidad de medir la misma muestra varias veces. Sin embargo, especialmente para estudios en humanos, 20 mg es el tamaño aceptable habitual para biopsias musculares.
Para examinar si diferentes músculos en patas de rata tendrían diferentes contenidos de nitrato / nitrito, las concentraciones de esos iones se compararon en cuatro músculos diferentes de las piernas (Figura 6). Tanto los niveles de nitrato como de nitrito fueron más altos en el músculo glúteo en comparación con otros tres tejidos musculares, aunque las diferencias no alcanzaron significación estadística en este estudio, lo que sugiere que el metabolismo del nitrato en varios tipos musculares puede gobernarse de manera diferente. Este fenómeno está siendo investigado con más detalle actualmente.
Otros grupos de investigación también han reportado concentraciones de nitrato de músculo esquelético, revelando una variabilidad significativa en esos valores. El grupo Coggan demostró que los niveles de nitrato en el músculo sóleo de rata Sprague Dawley varían de 62 a 124 nmol/g dependiendo de los métodos de preparación muscular21. El mismo grupo reportó valores de nitrato en SD rata vastus lateralis (aproximadamente 60 nmol/g) y sóleo (aproximadamente 215 nmol/g) en otro estudio23. Ohtake et al. midieron concentraciones de nitrato en músculo gastrocnemio de ratón de >300 nmol/g; sin embargo, no se describieron métodos precisos para la preparación de homogeneización muscular24. El grupo de Verdijk informó contenidos de nitratos en biopsias musculares humanas (vasto lateral) que variaron de 54 a 80 nmol/g dependiendo de la edad del participantede 20 años; en un estudio similar, Wylie et al. reportan 226 nmol/g para el mismo grupo muscular17. Estos resultados sugieren que las concentraciones de nitrato/nitrito en muestras de músculo esquelético reflejan muchos factores: fisiológicos (por ejemplo, estado de ejercicio), ambientales (por ejemplo, dieta) y técnicos (detalles del ensayo), todos los cuales presumiblemente contribuyen a la variabilidad de la medición.
Determinamos el coeficiente de variabilidad (CV) para los tres métodos presentados aquí - ver archivo complementario adjunto. Incluso si los CV están lejos de ser ideales, y varían entre los métodos utilizados, nuestros valores CV son comparables con los publicados por Troutman et al. 21 utilizando métodos similares con diferente tratamiento de muestras. Desafortunadamente, todavía no hay una explicación clara de por qué persiste una variabilidad tan alta; Este documento es el único protocolo detallado publicado que conocemos para procesar muestras musculares para la determinación de nitratos y nitritos.
También medimos la linealidad y el grado de recuperación de nitratos de muestras musculares con nitratos (ver archivo suplementario adjunto). Cuando agregamos tres concentraciones diferentes de nitrato en muestras de glúteos para homogeneización, obtuvimos una buena respuesta lineal en el aumento de las concentraciones de nitrato con ~ 80% de recuperación de nitrato agregado para homogeneizadores rotativos y de perlas. Estos resultados demuestran que ambos métodos de homogeneización se pueden utilizar para la determinación de los niveles de nitrato y nitrito en muestras biológicas con buena confianza. La pérdida del 20% del nitrato añadido es probable que ocurra durante la desproteinización y centrifugación del tejido muscular homogeneizado cuando algunos iones podrían coprecipitar con proteínas cargadas u otras partes celulares.
En general, esperamos que nuestro método propuesto de preparación de muestras musculares para mediciones de nitrato y nitrito resulte útil no solo en el campo de la investigación del ejercicio, sino también en estudios clínicos. Existen trastornos neuromusculares y / o metabólicos que afectan a grandes poblaciones que podrían relacionarse con el mal funcionamiento del ciclo del óxido nítrico y podrían beneficiarse del suministro de nitratos. Sin embargo, primero hay que establecer si existe una deficiencia de NO, de hecho, y si puede corregirse mediante una intervención dietética. Esperamos que el método descrito aquí permita monitorear el destino del nitrato y otros metabolitos del ciclo de NO en el músculo esquelético y otros órganos.
Somos conscientes de que, en este punto de su desarrollo, los métodos de preparación del músculo esquelético para mediciones de nitratos y nitritos mediante quimioluminiscencia (la más cuantitativa de todas las determinaciones de los propios óxidos de nitrógeno) todavía tienen variables desconocidas, algunas de las cuales se discutieron anteriormente. Sin embargo, incluso con sus limitaciones, los métodos descritos permiten una comparación razonablemente precisa de los niveles de nitrato/nitrito de diferentes órganos, incluidos los diferentes músculos esqueléticos, y deben permitir la formulación de hipótesis que luego puedan probarse con una precisión razonable.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses. Alan N. Schechter figura como coinventor en varias patentes emitidas a los Institutos Nacionales de Salud para el uso de sales de nitrito para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Recibe regalías basadas en la licencia de los NIH de estas patentes para el desarrollo clínico, pero ninguna otra compensación. Estos arreglos no afectan su adhesión a las políticas de la revista JoVE.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención intramuros de NIH / NIDDK ZIA DK 0251041-14 a Alan N Schechter, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
References
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A.
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al.
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
