Summary
نقدم بروتوكولات لثلاث طرق مختلفة لتجانس أربع مجموعات عضلية مختلفة من الأنسجة العضلية الهيكلية للفئران لقياس ومقارنة مستويات النترات والنتريت. علاوة على ذلك ، نقارن أوزان العينات المختلفة للتحقق مما إذا كان حجم عينة الأنسجة يؤثر على نتائج التجانس.
Abstract
كان يعتقد في السابق أن أيونات النترات (NO3-) هي منتجات نهائية خاملة لعملية التمثيل الغذائي لأكسيد النيتريك (NO). ومع ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة أنه يمكن تحويل أيونات النترات مرة أخرى إلى NO في الثدييات من خلال آلية اختزال من خطوتين: يتم تقليل النترات إلى النتريت (NO2-) في الغالب عن طريق البكتيريا المتعايشة عن طريق الفم ، ثم يتم تقليل النتريت إلى NO بواسطة عدة آليات بما في ذلك عن طريق البروتينات المحتوية على الهيم أو الموليبدينوم. يساهم مسار النترات الاختزالي هذا في تعزيز مسارات الإشارات بدون وساطة ، لا سيما في نظام القلب والأوعية الدموية وأثناء ممارسة العضلات. يتم تحديد مستويات النترات في الجسم قبل هذا الاستخدام من خلال مصدرين مختلفين: عدم الأكسدة الذاتية وتناول النترات الغذائية ، بشكل أساسي من النباتات. لتوضيح دورة NO المعقدة في الظروف الفسيولوجية ، قمنا بفحص ديناميكيات مستقلباتها وأيونات النترات والنتريت ، والتي تكون مستقرة نسبيا مقارنة ب NO. في الدراسات السابقة ، تم تحديد العضلات الهيكلية كعضو تخزين رئيسي لأيونات النترات في الثدييات ، وكذلك مصدر مباشر ل NO أثناء التمرين. لذلك ، فإن إنشاء منهجية موثوقة لقياس مستويات النترات والنتريت في العضلات الهيكلية أمر مهم ويجب أن يكون مفيدا في توسيع نطاق تطبيقه ليشمل عينات الأنسجة الأخرى. يشرح هذا البحث بالتفصيل إعداد عينات العضلات الهيكلية ، باستخدام ثلاث طرق تجانس مختلفة ، لقياسات النترات والنتريت ويناقش القضايا المهمة المتعلقة بعمليات التجانس ، بما في ذلك حجم العينات. كما تمت مقارنة تركيزات النيترات والنتريت عبر أربع مجموعات عضلية مختلفة.
Introduction
يلعب أكسيد النيتريك (NO) ، وهو جزيء إشارات غازي صغير ، دورا مهما في العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية1. لا يمكن إنتاج NO من L-arginine بواسطة إنزيمات داخلية من عائلة سينسيز أكسيد النيتريك (NOS) قبل الخضوع للأكسدة السريعة للنترات (NO 3-) ، وربما النتريت (NO 2-) في الدم والأنسجة 2,3. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن هذه الأنيونات قد تم اختزالها مرة أخرى إلى NO في أنظمة الثدييات4. يتم تحويل النترات إلى نتريت ، بشكل رئيسي عن طريق اختزال النترات البكتيرية المتعايشة في تجويف الفم التي تعمل على الأيونات التي تفرزها الغدد اللعابية وتبتلع مباشرة 5 ، وإلى حد ما ، عن طريق إنزيمات الثدييات مثل أوكسيدوريكتاز الزانثين 6,7. يمكن تقليل النتريت إلى NO من خلال عدة آليات بما في ذلك deoxyhemoglobin8 ، deoxymyoglobin9 ، الإنزيمات المحتوية على الموليبدينوم 10 ، والاختزال غير الأنزيمي في وجود البروتونات11,12.
يتم تعزيز مسار النترات - النتريت - NO في ظل ظروف نقص الأكسجين حيث يتضاءل نشاط NOS لأن NOS يتطلب الأكسجين لتوليدNO 4. أبلغت العديد من الدراسات الحديثة عن آثار مفيدة للنترات الغذائية على تنظيم ضغط الدم وأداء التمارين الرياضية ، مما يشير إلى أن مسارات تقليل النترات تساهم في زيادة إشارات NO13،14،15. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن بعض العضلات الهيكلية هي على الأرجح أماكن تخزين النترات الرئيسية في الجسم16. بالمقارنة مع الدم أو الأعضاء الداخلية الأخرى مثل الكبد ، تحتوي العضلات الهيكلية (gluteus maximus) على مستويات أعلى بكثير من النترات ولها كتلة كبيرة في جسم الثدييات. تبين أن تمرين جهاز المشي يعزز تقليل النترات إلى النتريت و NO في الألوية في نموذجالفئران 7. تشير هذه النتائج إلى أن بعض العضلات الهيكلية يمكن أن تكون مصادر مهمة ل NO من خلال مسارات تقليل النترات في المواقف الفسيولوجية. تشير الدراسات الحديثة إلى أن هذه النتائج ، بما في ذلك التغيرات في مستويات نترات العضلات أثناء التمرين ، تحدث أيضا في البشر17.
كان اثنان من المؤلفين الحاليين قد وضعا سابقا طريقة لقياس مستويات النترات والنتريت في الدم وعينات سائلة أخرى18. ومع ذلك ، عندما تم تحليل مستويات هذه الأنيونات في تجانس الأنسجة في البداية ، لم تكن البروتوكولات التفصيلية متاحة. لفهم ديناميكيات النترات - النتريت - NO في العديد من الأعضاء المختلفة ، كان هدفنا هو تطوير طريقة دقيقة وفعالة لقياس مستويات النترات والنتريت في أنسجة الثدييات بما في ذلك العضلات الهيكلية. في الدراسات السابقة ، تم استخدام أنسجة القوارض لتطوير عمليات تجانس موثوقة ثم تحليل محتويات النترات والنتريت في تلك التجانسات7،16،19. تم توسيع استخدام طريقة التجانس هذه لتشمل عينات خزعة العضلات الهيكلية البشرية ، حيث تم تأكيد القيم ، والأهم من ذلك ، كانت القيم التي لوحظت للعضلات مقارنة بالدم / البلازما في نطاقات ونسب مماثلة لتلك التي لوحظت في القوارض17. في السنوات الأخيرة ، بدأت مجموعات أخرى أيضا في قياس مستويات النترات والنتريت في تجانس العضلات الهيكلية ، وأبلغت عن قيم قابلة للمقارنة لتلك التي أبلغت عنها مجموعتنا20,21.
الهدف من ورقة البروتوكول هذه هو وصف تفصيلي لإعداد متجانسات العضلات الهيكلية باستخدام ثلاث طرق تجانس مختلفة للقياس اللاحق لمستويات النترات والنتريت. بالإضافة إلى ذلك ، تم فحص تأثيرات وزن الأنسجة المستخدمة للتجانس على قيم النترات والنتريت في عينات العضلات الهيكلية. نعتقد أن هذه الطرق يمكن تطبيقها بسهولة على أنواع أخرى من أنسجة الثدييات. في الآونة الأخيرة ، وخاصة في مجال فسيولوجيا التمرين ، تم إيلاء الاهتمام للاختلافات المحتملة في فسيولوجيا النترات / النتريت / NO وفقا لمجموعات العضلات. نبلغ أيضا عن كميات النترات والنتريت في أربع عضلات مختلفة للقوارض ونجد توزيعا غير منتظم لكلا الأيونات بين هذه العضلات المختلفة. ملاحظة تتطلب مزيدا من الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان NIDDK (ASP K049-MMB-20). تم التعامل مع الحيوانات ومعالجتها وفقا للدليل الحالي لرعاية واستخدام المختبر المتاح مجانا على موقع AAALAC.
1. جمع العضلات الهيكلية الفئران
- بينما يكون الجرذ تحت التخدير العميق (5٪ إيزوفلوران ، يؤكده رد الفعل الغائب لقرص الذيل / الساق) ، ابدأ التروية بمحلول ملحي يحتوي على الهيبارين عن طريق وضع إبرة 19 جم في قمة البطين الأيسر وعمل شق على الأذين الأيمن. اترك المحلول الملحي مع الهيبارين يتخلل الأعضاء الداخلية حتى يتدفق 1.5 لتر / كجم على الأقل عبر الأنسجة. في هذه المرحلة ، تموت الحيوانات من الاستنزاف وتكون الجثث جاهزة للمعالجة لجمع العينات.
ملاحظة: يعد تحقيق التروية الجيدة أمرا بالغ الأهمية ، خاصة بالنسبة للقياسات الدقيقة للنتريت ، لأن النتريت يتأكسد إلى نترات بواسطة أي هيموجلوبين متبقي. - تحديد الأنسجة العضلية المستهدفة واستئصالها من الساقين الخلفيتين22 باستخدام أدوات جراحية نظيفة. إزالة أكبر قدر ممكن من الدهون والأنسجة الضامة من أنسجة العضلات.
- ضع الكمية المطلوبة من العضلات في أنبوب طرد مركزي دقيق ثم ضعها على ثلج جاف. قم بتخزين الأنابيب المملوءة بالأنسجة في الفريزر -80 درجة مئوية.
ملاحظة: في حالة عينات الخزعة البشرية ، قم بمسحها جيدا فور جمعها بشاش نظيف لإزالة الدم الزائد.
2. التحضير للتجانس
- تحضير محلول الحفاظ على النتريت (محلول التوقف)
- تحضير محلول أصفر صاف يحتوي على 890 mM من فيريسيانيد البوتاسيوم (K3Fe (CN) 6) و 118 mM NEM (N-ethylmaleimde) في الماء المقطر ، مما يضمن عدم وجود بلورات. أضف الفاعل بالسطح غير الأيوني (المنظفات) بنسبة 1: 9 (v / v ، جدول المواد) ، واخلطه برفق لتجنب الرغوة.
- تمييع محلول التوقف بنسبة 1: 9 بالماء المقطر. ضع محلول التوقف المخفف (نسبة 1: 5 من الأنسجة العضلية إلى محلول التوقف المخفف) في أنبوب التجانس.
ملاحظة: سيتطلب عشرون ملليغرام من الأنسجة 100 ميكرولتر من محلول التوقف ، وسيتطلب 200 مجم من الأنسجة 1000 ميكرولتر من محلول التوقف في الأنبوب. يعد وجود المنظفات في محلول مضاف أمرا بالغ الأهمية لتعطيل أغشية الخلايا. يمكن استخدام أي منظف غير أيوني ، ولكن يجب توخي الحذر للتحقق من أنه لا يتداخل مع طريقة التلألؤ الكيميائي.
- تحضير الأنسجة
- أخرج المنديل من الفريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية وقم بإذابته ببطء في الثلج. إزالة الدهون المتبقية والنسيج الضام من العضلات والهيكل العظمي. قطع قطع من العضلات والهيكل العظمي وصمة عار على الشاش حتى يجف.
- وزن كمية الأنسجة (20 و 50 و 200 ملغ). ضع العضلة الهيكلية الموزونة مسبقا في محلول التوقف في أنابيب التجانس أو ضع الأنسجة التي تم وزنها مسبقا في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف لاستخدامها لاحقا.
3. التجانس
- الخالط الدوار (الشكل 1)
- ضع الأنبوب من النوع M الذي يحتوي على العضلات الهيكلية الموزونة مسبقا ومحلول التوقف المقاس مسبقا في الجهاز. قم بتجانس كل عينة مرتين (الإعداد على دورة التجانس الأكثر تدميرا) وضع الأنبوب على الثلج مباشرة بعد كل تجانس لمدة 5 دقائق ليبرد.
- جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة عند 2000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. ضع الأنبوب الكامل مرة أخرى على الثلج وأضف الحجم المناسب من الميثانول (≥ 99.9٪ ، 10x من وزن الأنسجة). دوامة تماما لمدة 15 ثانية.
ملاحظة: للحصول على 20 ملغ من الأنسجة، استخدم 200 ميكرولتر من الميثانول. يستخدم الميثانول لترسيب البروتينات من تجانس الأنسجة ولا يتداخل مع طريقة التلألؤ الكيميائي. إذا تم استخدام طريقة ترسيب البروتين الأخرى ، فاختبر توافقها مع التلألؤ الكيميائي. - تجانس مرة أخرى واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي للعينات لمدة 35 دقيقة عند 4 درجات مئوية و 3500 × جم. استنشاق المادة الطافية ، وقياس مستويات النتريت / النترات ، أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
- الخالط حبة (الشكل 2)
- ضع النسيج العضلي الهيكلي في أنبوب يحتوي على حبة (نسبة 1: 5 للأنسجة: محلول توقف مخفف) وتجانس مرتين لمدة 45 ثانية بأعلى سرعة متوفرة على الأداة المستخدمة. ضع الأنبوب على الثلج مباشرة بعد كل تجانس لمدة 5 دقائق ليبرد.
- جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير لسطح المكتب (2000 × جم) لمدة 5 ثوان. ضع الأنبوب مرة أخرى على الثلج وأضف حجما مناسبا من الميثانول (نقاء ≥ 99.9٪ ، 10x من وزن الأنسجة). دوامة تماما لمدة 15 ثانية.
ملاحظة 1: للحصول على 20 ملغ من الأنسجة ، استخدم 200 ميكرولتر من الميثانول.
ملاحظة 2: يستخدم الميثانول لترسيب البروتينات من تجانس الأنسجة ولا يتداخل مع طريقة التلألؤ الكيميائي. إذا تم استخدام طريقة ترسيب البروتين الأخرى ، فاختبر توافقها مع التلألؤ الكيميائي. - تجانس مرة أخرى لمدة 45 ثانية بأعلى سرعة متاحة على الأداة المستخدمة. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 17000 × جم ، 4 درجات مئوية ، 30 دقيقة. استنشاق المادة الطافية ، وقياس مستويات النتريت / النترات ، أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
- الطاحن (الشكل 3)
- تحضير أنابيب تحتوي على محلول توقف مخفف (5x من وزن الأنسجة) ووزنها. سجل الوزن (أنبوب + محلول إيقاف).
- ضع أداة طاحن النيتروجين السائل على الثلج الجاف وانتظر لمدة 30 دقيقة تقريبا حتى تصل إلى درجة الحرارة المطلوبة.
- باستخدام ملاقط مبردة في النيتروجين السائل ، انقل عينة واحدة (تم قياس وزن الأنسجة بالفعل) إلى آلة السحق. أضف ملعقة صغيرة من النيتروجين السائل للتأكد من أن الأنسجة في درجة حرارة النيتروجين السائل.
- بعد تبخر 95٪ من النيتروجين السائل ، ضع أداة التكسير فوق الأنسجة ، واضغط بقوة. يجب أن تشعر بسحق العينة. باستخدام المطرقة ، اضرب أداة التكسير 3-5x.
- افحص العينة بحثا عن أي قطع متبقية باستخدام ملعقة مبردة في النيتروجين السائل. بعد التبريد في النيتروجين السائل ، استخدم قطعة من المناديل الورقية لمسح أي ماء مجمد قبل لمس المنديل. في حالة وجود قطعة ، انقلها إلى المركز ، ثم اضرب 5-6 مرات أخرى بالمطرقة.
- عندما يتم سحق العينة بأكملها ، استخدم الملعقة المبردة بالنيتروجين السائل لنقل الأنسجة المسحوقة مباشرة إلى الأنبوب الذي تم وزنه مسبقا والذي يحتوي على محلول التوقف المخفف (الخطوة 3.3.1). تأكد من تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لأنه عندما ترتفع درجة حرارة العضلات الهيكلية المسحوقة ، تصبح لزجة ويصعب نقلها.
- دوامة لمدة 15 ثانية. تأكد من عدم وجود نسيج عالق في الجزء العلوي من الأنبوب عن طريق فتح الأنبوب. إذا كان هناك ، حاول إزاحته ثم دوامة مرة أخرى.
- الطرد المركزي العينة لمدة 2-3 ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي صغير لسطح المكتب. وزن الأنبوب مرة أخرى. احسب وزن الأنسجة عن طريق خصم وزن الأنبوب الأصلي (الخطوة 3.3.1) من هذا الوزن الجديد. ضع الأنبوب على الثلج.
ملاحظة: ستساعد الأوزان الدقيقة في تحديد وزن الأنسجة الدقيق ومقدار الأنسجة المفقودة أثناء السحق. - بمجرد معالجة جميع العينات حتى الخطوة 3.3.8 ، أضف حجما مناسبا من الميثانول (≥ 99.9٪ ، 10x من وزن الأنسجة). دوامة جيدا لمدة 15 ثانية ، واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: للحصول على 20 ملغ من الأنسجة، استخدم 200 ميكرولتر من الميثانول. يستخدم الميثانول لترسيب البروتينات من تجانس الأنسجة ولا يتداخل مع طريقة التلألؤ الكيميائي. إذا تم استخدام طريقة ترسيب البروتين الأخرى ، فاختبر توافقها مع التلألؤ الكيميائي. - جهاز طرد مركزي عند 17000 × جم ، 4 درجات مئوية ، 30 دقيقة. استنشاق المادة الطافية وقياس مستويات النتريت / النترات ، أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
4. قياس النتريت / النترات باستخدام محلل أكسيد النيتريك (NOA)
- تحضير جميع العينات بأي من طرق التجانس الثلاث المختلفة الموضحة أعلاه وحقنها في NOA لقياس النترات والنتريت.
ملاحظة: تم نشر بروتوكولات مفصلة لاستخدام NOA سابقا19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للحصول على نتائج تمثيلية ، تم استخدام أنسجة العضلات الهيكلية من 8 فئران Wistar (ذكور وإناث ، وزن 250 ± 50 جم). تم تحضير تجانس عضلات الهيكل العظمي للفئران (50 ملغ من عضلة الألوية القصوى لكل طريقة) بواسطة ثلاث أدوات تجانس مختلفة (الخالط الدوار ، الخالط الخرز ، والسحق). ثم تم تحديد محتويات النترات والنتريت لهذه التجانسات باستخدام محلل أكسيد النيتريك (NOA) (الشكل 4). كانت مستويات النترات (الشكل 4 أ) في تلك العينات الثلاث المتجانسة متشابهة جدا مع بعضها البعض ، حيث تراوحت من 39.6 إلى 45.2 نانومول / جم.
ومن المثير للاهتمام ، أن مستويات النتريت (الشكل 4 ب) في عينة متجانسة محضرة بواسطة آلة سحق أظهرت أعلى قيمة (0.99 ± 0.15 نانومول / جم) ، وكان هذا مختلفا إحصائيا عن قيمتي العينة الأخريين. لاختبار ما إذا كان حجم الأنسجة سيؤثر على كفاءة التجانس وقيم النترات والنتريت الناتجة ، تم استخدام ثلاثة أحجام مختلفة من الأنسجة العضلية الهيكلية (الأنسجة العضلية الألوية من 20 و 50 و 200 ملغ) للتجانس بواسطة الخالط الخرزي (الشكل 5). لم تكن مستويات النترات (الشكل 5 أ) ولا النتريت (الشكل 5 ب) مختلفة بشكل كبير بين أحجام عينات العضلات. ومع ذلك ، لوحظت تركيزات أقل قليلا من النترات عند زيادة حجم العينة ، في تجارب متعددة لأسباب غير واضحة.
بعد ذلك ، تم قياس مستويات النترات والنتريت في أنواع مختلفة من أنسجة العضلات الهيكلية لساق القوارض (الشكل 6). بالإضافة إلى عضلة الألوية المكسيمة، تم عزل عضلات الظنبوب الأمامية (TA)، وعضلة الباسطة الطويلة (EDL)، وعضلات الساق (50 ملغ لكل منهما) من أرجل الفئران وتجانسها باستخدام الخالط الخرزية. والمثير للدهشة أن مستويات النترات في عضلة الألوية (40.4 نانومول / جم) كانت أعلى بمرتين تقريبا من تلك الموجودة في الأنسجة العضلية الثلاثة الأخرى على الرغم من أن هذه الاختلافات في هذه التجربة بالذات لم تصل إلى دلالة إحصائية (الشكل 6 أ). كان تركيز النتريت في عضلة الألوية أعلى أيضا من تركيز الأنسجة العضلية الثلاثة الأخرى وكان أعلى بكثير من ذلك الموجود في عينة الساق (الشكل 6 ب).
حددنا معامل الاختلاف لجميع الطرق الثلاث المستخدمة والنتائج في الجدول المرفق. للمقارنة ، يوضح الجدول أيضا معاملات الاختلاف التي حددها Troutman et al21.
الشكل 1: الخالط الدوار. (أ) الخالط؛ ب: أنبوب يحتوي على نسيج ومحلول توقف. توضع عينات الأنسجة العضلية الهيكلية في أنبوب بمحلول توقف مخفف ومتجانسة ثلاث مرات. يجب وضع العينات على الفور على الجليد بعد كل خطوة تجانس. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: الخالط حبة . (أ) الخالط؛ ب: خرز يحتوي على أنبوب. توضع عينات الأنسجة العضلية الهيكلية في أنبوب يحتوي على حبة (5 حبات خزفية) مع محلول توقف مخفف ومتجانسة ثلاث مرات في المجموع (45 ثانية بأعلى سرعة لكل مرة). يجب وضع العينات على الفور على الجليد بعد كل خطوة تجانس. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: الطاحن. (أ) أجزاء الطاحن (ب) جسم الطاحن - تجميع الملاط والمدقة. (ج) تفاصيل تجميع الملاط والمدقة. يتم تبريد أجزاء الطاحن على الثلج الجاف لمدة 30 دقيقة. يتم وضع النيتروجين السائل في الهاون ثم يضاف نسيج عضلي هيكلي قبل الوزن. بعد اختفاء 90 في المائة من النيتروجين السائل ، يتم إدخال الجزء العلوي - المدقة - في الحوض. يتم قصف المدقة بمطرقة 5-6 مرات حتى تصبح العينة مسحوقية. ثم يتم نقل الأنسجة المسحوقة إلى أنبوب بمحلول توقف. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: (أ) محتويات النيترات و(ب) النيتريت في متجانسات عضلات الألوية المحضرة بثلاث طرق تجانس مختلفة. تم تجانس خمسين ملليغرام من عضلة الألوية بثلاث طرق تجانس مختلفة. تمت إضافة الميثانول (500 ميكرولتر) إلى التجانس لترسيب البروتينات. واستخدمت طريقة تلألؤ كيميائي قياسية مع كلوريد الفاناديوم أو محلول ثلاثي اليوديد لقياس مستويات النترات والنتريت، على التوالي، في المادة الطافية الصافية بعد الطرد المركزي؛ ن = 7 (نترات) ؛ ن = 8 (النتريت) ؛ يتم تقديم البيانات كمتوسطات ± SD ، * p < 0.05 باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: (أ) محتوى النيترات و(ب) النيتريت في أحجام عينات مختلفة من عضلة الألوية. تم تحضير ثلاثة أحجام مختلفة من تجانس عضلات الألوية باستخدام الخالط الخرزي. واستخدمت طريقة تلألؤ كيميائي قياسية مع كلوريد الفاناديوم أو محلول ثلاثي اليوديد لقياس مستويات النترات والنتريت، على التوالي، في المادة الطافية الصافية بعد الطرد المركزي؛ ن = 7 (نترات) ؛ ن = 8 (النتريت) ؛ يتم عرض البيانات كمتوسطات ± SD ، يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: (أ) النيترات و(ب) محتويات النيتريت في أربع عضلات مختلفة. تم تجانس كل عضلة (50 ملغ) باستخدام خالط حبة ، وتم استخدام طريقة التلألؤ الكيميائي القياسية مع كلوريد الفاناديوم أو محلول ثلاثي يوديد لقياس مستويات النترات والنتريت ، على التوالي. ن = 4-7 (نترات) ؛ ن = 3-8 (النتريت) ؛ يتم تقديم البيانات كمتوسطات ± SD ، * p < 0.05 باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
ملف تكميلي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لمراقبة التغيرات في مستقلبات NO والنترات والنتريت ، كدالة للتدخلات الفسيولوجية ، من الضروري قياس مستويات هذه الأيونات في الأعضاء المختلفة التي تعتبر حاسمة في عملية التمثيل الغذائي. نظرا لأن الهيموجلوبين في الدم سوف يتفاعل مع NO ومستقلباته ، فمن المهم أيضا إزالة الدم بسرعة من عينات الأنسجة قدر الإمكان. وهكذا تم رش الحيوانات بالمحلول الملحي قبل جمع أنسجة العضلات الهيكلية (الألوية ، TA ، EDL ، عضلة الساق) ، وتمت إزالة الأنسجة الضامة والدهون حول العضلات المستهدفة على الفور. بالنسبة لمحلول التجانس ، تم صياغة "محلول التوقف" خصيصا باستخدام ferricyanide و NEM وخافض للتوتر السطحي غير الأيوني للحفاظ على النتريت في الأنسجة المختلفة19. يعد وجود المنظفات غير الأيونية أمرا بالغ الأهمية للتعطيل الكامل لأغشية الخلايا. في حالة آلتي التجانس المستخدمتين في هذه الدراسة ، الخالط الدوار والخالط الخرز ، كان حجم محلول التوقف المطلوب للتجانس 5 أضعاف وزن الأنسجة بحيث تم غمر الأنسجة بالكامل في المحلول ومعالجتها بشكل متجانس.
تم إجراء عملية التجانس ثلاث مرات في المجموع (مرتين قبل إضافة الميثانول ومرة أخرى بعد إضافة الميثانول إلى البروتينات المترسبة) ، في كل مرة باستخدام إعداد مبرمج يحدده مصنعو الأجهزة. من المهم وضع عينات على الثلج مباشرة بعد كل تجانس لمنع تدهور العينة عن طريق التسخين المعتدل ، والذي قد يتولد أثناء التجانس. بالنسبة لطريقة السحق ، تم سحق عينات الأنسجة في البداية إلى مسحوق مع الاحتفاظ بها مجمدة باستخدام النيتروجين السائل ، ثم تم خلط العينات بمحلول التوقف (5x وزن الأنسجة). في جميع الطرق الثلاث ، تمت إضافة الميثانول (10x وزن الأنسجة) إلى العينات ، وتم تحضين الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة لترسيب البروتينات واستخراج النترات والنتريت بالكامل من الأنسجة. يمكن أن يتسبب وجود البروتينات في العينة في رغوة مفرطة لمحلول التفاعل في الغرفة عند استخدام التلألؤ الكيميائي ، لذلك من الضروري ترسيب البروتينات من العينات. يمكن استخدام أي عامل ترسيب ، ولكن من الضروري التأكد من أن هذه العوامل لن تتداخل مع طريقة التلألؤ الكيميائي أو تسبب أي تغييرات في تركيزات النتريت / النترات من خلال التفاعل مع هذه الأيونات.
كانت مستويات النترات في جميع عينات الألوية المحضرة بالطرق الثلاث متشابهة جدا (39.6-45.2 نانومول / جم ، الشكل 4 أ) ، مما يشير إلى أن طرق التجانس الثلاثة هذه قابلة للتطبيق بالتساوي في تحضير عينات العضلات لتحليل النترات. على الرغم من أن مستويات النتريت كانت أعلى قليلا في العينات المحضرة عن طريق السحق مقارنة بالطريقتين الأخريين (الشكل 4 ب) ، إلا أن جميع القيم المقاسة كانت في نطاق محدود (0.64-0.99 نانومول / جم). تم فحص تأثير حجم عينة الأنسجة على قيم النترات والنتريت في عينات العضلات الهيكلية لأن الباحثين غالبا ما يتعاملون مع عينات صغيرة جدا ، خاصة من الحيوانات الصغيرة أو خزعات العضلات البشرية. لم تكن مستويات النترات أو النتريت مختلفة بشكل كبير في النطاق من 20 إلى 200 ملغ من الأنسجة العضلية الهيكلية في هذه التجارب (الشكل 5).
ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أنها ليست ذات دلالة إحصائية ، فإن مستويات النترات تميل إلى أن تكون أقل قليلا عند قياسها في عينات أكبر (الشكل 5). لقد لاحظنا هذه الظاهرة على مدار دراساتنا المنشورة وغير المنشورة ، لكننا لا نفهم أسبابها. لذلك ، ربما يكون من المهم مراعاة أوزان العينات والحفاظ عليها متسقة بشكل مثالي طوال الدراسة عند تحضير التجانس من عينات أنسجة متعددة. هناك اعتبار آخر عند العمل مع عينات أصغر (20 مجم) وهو أن الحجم الإجمالي النهائي للعينة المعالجة هو ~ 300 ميكرولتر فقط ، مما يقلل بشكل كبير من إمكانية قياس نفس العينة عدة مرات. ومع ذلك ، خاصة بالنسبة للدراسات البشرية ، 20 ملغ هو الحجم المعتاد المقبول لخزعات العضلات.
لفحص ما إذا كانت العضلات المختلفة في أرجل الفئران سيكون لها محتويات نترات / نتريت مختلفة ، تمت مقارنة تركيزات هذه الأيونات في أربع عضلات ساق مختلفة (الشكل 6). كانت مستويات كل من النترات والنتريت أعلى في عضلة الألوية مقارنة بثلاثة أنسجة عضلية أخرى ، على الرغم من أن الاختلافات لم تصل إلى دلالة إحصائية في هذه الدراسة ، مما يشير إلى أن استقلاب النترات في أنواع العضلات المختلفة قد يحكم بشكل مختلف. ويجري حاليا التحقيق في هذه الظاهرة بمزيد من التفصيل.
كما أبلغت مجموعات بحثية أخرى عن تركيزات نترات العضلات الهيكلية ، مما كشف عن تباين كبير في تلك القيم. أظهرت مجموعة Coggan أن مستويات النترات في عضلة نعل الفئران Sprague Dawley تختلف من 62 إلى 124 نانومول / جم اعتمادا على طرق تحضير العضلات21. أبلغت نفس المجموعة عن قيم النترات في SD الفئران vastus lateralis (حوالي 60 نانومول / جم) والنعل (حوالي 215 نانومول / جم) في دراسة أخرى23. قام Ohtake et al. بقياس تركيزات النترات في عضلة الفأر المعدي >300 نانومول / جم ؛ ومع ذلك ، لم يتم وصف الطرق الدقيقة لإعداد تجانس العضلات24. أبلغت مجموعة Verdijk عن محتويات النترات في خزعات العضلات البشرية (الأوعية الدوائية الجانبية) تتراوح من 54 إلى 80 نانومول / جم اعتمادا على عمر المشارك20. في دراسة مماثلة ، أبلغ Wylie et al. عن 226 نانومول / جم لنفس المجموعة العضلية17. تشير هذه النتائج إلى أن تركيزات النترات / النتريت في عينات العضلات الهيكلية تعكس العديد من العوامل - الفسيولوجية (على سبيل المثال ، حالة التمرين) ، والبيئية (مثل النظام الغذائي) ، والتقنية (تفاصيل الفحص) - والتي من المفترض أن تساهم جميعها في تباين القياس.
حددنا معامل التباين (CV) لجميع الطرق الثلاث المعروضة هنا - انظر الملف التكميلي المرفق. حتى لو كانت السيرة الذاتية بعيدة عن المثالية ، وتختلف بين الطرق المستخدمة ، فإن قيم السيرة الذاتية لدينا قابلة للمقارنة مع تلك التي نشرها Troutman et al. 21 باستخدام طرق مماثلة مع معالجة مختلفة للعينات. لسوء الحظ ، لا يوجد حتى الآن تفسير واضح لاستمرار هذا التباين الكبير. هذه الورقة هي البروتوكول التفصيلي الوحيد المنشور الذي نعرفه لمعالجة عينات العضلات لتحديد النترات والنتريت.
قمنا أيضا بقياس الخطية ودرجة استرداد النترات من عينات العضلات المسننة بالنترات (انظر الملف التكميلي المرفق). عندما أضفنا ثلاثة تركيزات مختلفة من النترات إلى عينات الألوية للتجانس ، حصلنا على استجابة خطية جيدة في زيادة تركيزات النترات مع ~ 80٪ استعادة النترات المضافة لكل من الخالطات الخرزية والدوارة. توضح هذه النتائج أنه يمكن استخدام كلتا طريقتي التجانس لتحديد مستويات النترات والنتريت في العينات البيولوجية بثقة جيدة. من المحتمل أن يحدث فقدان 20٪ من النترات المضافة أثناء إزالة البروتين والطرد المركزي لتجانس الأنسجة العضلية عندما تترسب بعض الأيونات مع البروتينات المشحونة أو أجزاء الخلية الأخرى.
بشكل عام ، نأمل أن تكون طريقتنا المقترحة لإعداد عينة العضلات لقياسات النترات والنتريت مفيدة ليس فقط في مجال أبحاث التمرين ، ولكن أيضا في الدراسات السريرية. هناك اضطرابات عصبية عضلية و / أو استقلابية تؤثر على مجموعات كبيرة من السكان قد تتعلق بخلل في دورة أكسيد النيتريك ويمكن أن تستفيد من إمدادات النترات. ومع ذلك ، يتعين على المرء أولا تحديد ما إذا كان لا يوجد نقص ، في الواقع ، موجود وما إذا كان يمكن تصحيحه عن طريق التدخل الغذائي. نأمل أن تمكن الطريقة الموضحة هنا من مراقبة مصير النترات والمستقلبات الأخرى لدورة NO في العضلات الهيكلية والأعضاء الأخرى
نحن ندرك أنه في هذه المرحلة من تطورها ، لا تزال طرق تحضير العضلات الهيكلية لقياسات النترات والنتريت باستخدام التلألؤ الكيميائي (الأكثر كمية من بين جميع تحديدات أكاسيد النيتروجين نفسها) تحتوي على متغيرات غير معروفة ، بعضها تمت مناقشته أعلاه. ومع ذلك ، حتى مع قيودها ، تسمح الطرق الموصوفة بمقارنة دقيقة بشكل معقول لمستويات النترات / النتريت للأعضاء المختلفة ، بما في ذلك العضلات الهيكلية المختلفة ، ويجب أن تسمح بصياغة فرضيات يمكن اختبارها بعد ذلك بدقة معقولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح. تم إدراج Alan N. Schechter كمخترع مشارك في العديد من براءات الاختراع الصادرة إلى المعاهد الوطنية للصحة لاستخدام أملاح النتريت لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية. يتلقى إتاوات بناء على ترخيص المعاهد الوطنية للصحة لبراءات الاختراع هذه للتطوير السريري ولكن دون تعويض آخر. لا تؤثر هذه الترتيبات على التزامه بسياسات مجلة JoVe.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH / NIDDK الداخلية ZIA DK 0251041-14 إلى Alan N Schechter ، MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
References
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A.
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al.
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
