Summary
Vi præsenterer protokoller for tre forskellige metoder til homogenisering af fire forskellige muskelgrupper af rotteskeletmuskelvæv for at måle og sammenligne niveauerne af nitrat og nitrit. Desuden sammenligner vi forskellige prøvevægte for at undersøge, om vævsprøvestørrelse påvirker resultaterne af homogenisering.
Abstract
Nitrationer (NO3-) blev engang anset for at være inerte slutprodukter af nitrogenoxid (NO) metabolisme. Tidligere undersøgelser viste imidlertid, at nitrationer kan omdannes tilbage til NO hos pattedyr gennem en totrinsreduktionsmekanisme: nitrat reduceres til nitrit (NO2-) hovedsagelig af orale kommensale bakterier, hvorefter nitrit reduceres til NO ved flere mekanismer, herunder via hæm- eller molybdænholdige proteiner. Denne reduktive nitratvej bidrager til at forbedre NO-medierede signalveje, især i det kardiovaskulære system og under muskeltræning. Niveauerne af nitrat i kroppen før en sådan udnyttelse bestemmes af to forskellige kilder: endogen NO-oxidation og nitratindtag i kosten, hovedsageligt fra planter. For at belyse den komplekse NO-cyklus under fysiologiske omstændigheder har vi yderligere undersøgt dynamikken i dets metabolitter, nitrat og nitritioner, som er relativt stabile sammenlignet med NO. I tidligere undersøgelser blev skeletmuskulatur identificeret som et vigtigt opbevaringsorgan for nitrationer hos pattedyr samt en direkte kilde til NO under træning. Derfor er det vigtigt at etablere en pålidelig metode til måling af nitrat- og nitritniveauer i skeletmuskulaturen, og det bør være nyttigt at udvide dets anvendelse til andre vævsprøver. Dette papir forklarer detaljeret forberedelsen af skeletmuskelprøver ved hjælp af tre forskellige homogeniseringsmetoder til nitrat- og nitritmålinger og diskuterer vigtige spørgsmål relateret til homogeniseringsprocesser, herunder størrelsen af prøverne. Nitrat- og nitritkoncentrationer er også blevet sammenlignet på tværs af fire forskellige muskelgrupper.
Introduction
Nitrogenoxid (NO), et lille gasformigt signalmolekyle, spiller en kritisk rolle i fysiologiske og patofysiologiske processer1. NO kan fremstilles af L-arginin ved hjælp af endogene enzymer af nitrogenoxidsyntase (NOS) familien, før de undergår hurtig oxidation til nitrat (NO 3-) og muligvis nitrit (NO 2-) i blod og væv 2,3. For nylig har disse anioner vist sig at være reduceret tilbage til NO i pattedyrsystemer4. Nitrat omdannes til nitrit, hovedsagelig ved hjælp af kommensale bakterielle nitratreduktaser i mundhulen, der virker på ioner, der udskilles af spytkirtlerne og direkte indtages 5, og til en vis grad af pattedyrenzymer såsom xanthinoxidoreduktase 6,7. Nitrit kan reduceres yderligere til NO ved flere mekanismer, herunder deoxyhemoglobin8, deoxymyoglobin9, molybdænholdige enzymer 10 og ikke-enzymatisk reduktion i tilstedeværelsen af protoner11,12.
Denne nitrat-nitrit-NO-vej forbedres under hypoxiske forhold, hvor NOS-aktiviteten mindskes, fordi NOS kræver ilt til INGEN generation4. Mange nylige undersøgelser har rapporteret gavnlige virkninger af diætnitrat på blodtryksregulering og træningsevne, hvilket tyder på, at nitratreduktionsveje bidrager til forøgelsen af NO-signalering13,14,15. Tidligere undersøgelser har vist, at nogle skeletmuskler sandsynligvis er de største nitratopbevaringssteder i kroppen16. Sammenlignet med blod eller andre indre organer såsom lever indeholder skeletmuskulatur (gluteus maximus) signifikant højere niveauer af nitrat og har en betydelig masse i pattedyrkroppen. Løbebåndsøvelse viste sig at øge nitratreduktionen til nitrit og til NO i gluteus i en rotte model7. Disse resultater indebærer, at nogle skeletmuskler kan være vigtige kilder til NO gennem nitratreduktionsveje i fysiologiske situationer. Nyere undersøgelser tyder på, at disse resultater, herunder ændringer i muskelnitratniveauer under træning, også forekommer hos mennesker17.
To af de nuværende forfattere havde tidligere etableret en metode til måling af nitrat- og nitritniveauer i blod og andre væskeprøver18. Men da niveauerne af disse anioner i vævshomogenater oprindeligt blev analyseret, var detaljerede protokoller ikke tilgængelige. For at forstå nitrat-nitrit-NO-dynamikken i flere forskellige organer var vores mål at udvikle en nøjagtig og effektiv metode til at måle nitrat- og nitritniveauer i pattedyrvæv, herunder skeletmuskulatur. I tidligere undersøgelser blev gnavervæv brugt til at udvikle pålidelige homogeniseringsprocesser og derefter analysere nitrat- og nitritindhold i disse homogenater 7,16,19. Anvendelsen af denne homogeniseringsmetode blev udvidet til humane skeletmuskelbiopsiprøver, hvorved værdierne blev bekræftet, og vigtigst af alt var de observerede værdier for muskler sammenlignet med blod / plasma i lignende intervaller og forhold som dem, der blev observeret hos gnavere17. I de senere år er andre grupper også begyndt at måle nitrat- og nitritniveauer i skeletmuskelhomogenater og rapportere sammenlignelige værdier med dem, der er rapporteret af vores gruppe20,21.
Formålet med dette protokolpapir er i detaljer at beskrive fremstillingen af skeletmuskelhomogenater ved hjælp af tre forskellige homogeniseringsmetoder til efterfølgende måling af nitrat- og nitritniveauer. Derudover blev virkningerne af vævsvægt, der blev anvendt til homogenisering på værdier af nitrat og nitrit i skeletmuskelprøver, undersøgt. Vi mener, at disse metoder let kan anvendes på andre typer pattedyrvæv. For nylig, især inden for træningsfysiologi, var der blevet lagt vægt på de mulige forskelle i nitrat / nitrit / INGEN fysiologi i henhold til muskelgrupper. Vi rapporterer også mængderne af nitrat og nitrit i fire forskellige gnavermuskler og finder en uensartet fordeling af begge ioner mellem disse forskellige muskler; en observation, der kræver yderligere undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprotokol blev godkendt af NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Dyr blev håndteret og behandlet i henhold til den nuværende vejledning til pleje og brug af forsøgsdyr, der er frit tilgængelig på AAALAC's hjemmeside.
1. Samling af rotteskeletmuskler
- Mens en rotte er under dyb anæstesi (5% isofluran, bekræftet ved manglende reaktion på hale / benklemme), skal du starte perfusion med saltvand indeholdende heparin ved at placere en 19 G nål i en spids af venstre ventrikel og lave et hak på højre atrium. Lad saltvand med heparin sive gennem de indre organer, indtil mindst 1,5 liter / kg er strømmet gennem vævet. På dette tidspunkt er dyr døde af exsanguination, og slagtekroppe er klar til at blive behandlet til prøveindsamling.
BEMÆRK: At opnå god perfusion er kritisk, især for nøjagtige målinger af nitrit, fordi nitrit oxideres til nitrat af ethvert resterende hæmoglobin. - Identificer målmuskelvæv og fjern dem fra bagbenene22 ved hjælp af rene kirurgiske instrumenter. Fjern så meget fedt og bindevæv fra muskelvævet som muligt.
- Placer den ønskede mængde muskler i et mikrocentrifugerør og læg derefter på tøris. Opbevar rørene fyldt med væv i -80 °C fryseren.
BEMÆRK: I tilfælde af humane biopsiprøver skal du straks tørre dem grundigt efter indsamling med rent gasbind for at fjerne overskydende blod.
2. Forberedelse til homogenisering
- Fremstilling af nitritbevarende opløsning (stopopløsning)
- Der fremstilles en klar gul opløsning indeholdende 890 mM kaliumferricyanid (K3Fe(CN)6) og 118 mM NEM (N-ethylmaleimid) i destilleret vand, hvilket sikrer ingen krystaller. Tilsæt ikke-ionisk overfladeaktivt stof (vaskemiddel) i forholdet 1: 9 (v / v, materialebord), og bland forsigtigt for at undgå skumdannelse.
- Fortynd stopopløsningen i forholdet 1:9 med destilleret vand. Den fortyndede stopopløsning (1:5 forhold mellem muskelvæv og fortyndet stopopløsning) anbringes i homogeniseringsrøret.
BEMÆRK: Tyve milligram væv vil kræve 100 μL stopopløsning, og 200 mg væv vil kræve 1000 μL stopopløsning i røret. Tilstedeværelse af vaskemiddel i tilsat opløsning er afgørende for forstyrrelse af cellemembraner. Ethvert ikke-ionisk vaskemiddel kan bruges, men man skal sørge for at kontrollere, at det ikke forstyrrer kemiluminescensmetoden.
- Væv forberedelse
- Tag vævet ud af -80 °C fryseren og tø langsomt op i is. Fjern det resterende fedt og bindevæv fra skeletmuskulaturen. Skær stykker skeletmuskulatur af og blød på gasbind for at tørre.
- Vej mængden af væv (20, 50 og 200 mg). Placer den forvejede skeletmuskel i stopopløsningen i homogeniseringsrørene, eller læg det forvejede væv i et rent mikrocentrifugerør til senere brug.
3. Homogenisering
- Roterende homogenisator (figur 1)
- Anbring M-røret indeholdende den forvejede skeletmuskel og den forudmålte stopopløsning i maskinen. Homogeniser hver prøve to gange (indstilling på den mest destruktive homogeniseringscyklus) og læg røret på is umiddelbart efter hver homogenisering i 5 minutter for at køle ned.
- Centrifuge kort ved 2.000 × g og 4 °C i 5 min. Hele røret lægges på is igen, og der tilsættes den passende mængde methanol (≥ 99,9 %, 10 gange vævsvægt). Vortex grundigt i 15 s.
BEMÆRK: For 20 mg væv skal du bruge 200 μL methanol. Methanol bruges til at udfælde proteiner fra vævshomogenat og forstyrrer ikke kemiluminescensmetoden. Hvis der anvendes anden proteinudfældningsmetode, skal du teste dens kompatibilitet med kemiluminescens. - Homogeniser igen og inkuber på is i 30 min. Prøverne centrifugeres i 35 minutter ved 4 °C og 3 500 × g. Supernatanten aspireres, og nitrit/nitratniveauer måles, eller opbevares ved -80 °C til senere brug.
- Perlehomogenisator (figur 2)
- Skeletmuskelvævet anbringes i et perleholdigt rør (1:5-forhold for væv: fortyndet stopopløsning) og homogeniseres to gange i 45 s ved den højeste hastighed, der er tilgængelig på det anvendte instrument. Placer røret på is umiddelbart efter hver homogenisering i 5 minutter for at køle ned.
- Centrifuger kortvarigt ved hjælp af en lille skrivebordscentrifuge (2.000 x g) i 5 sek. Rør lægges på is igen, og der tilsættes en passende mængde methanol (renhed ≥ 99,9 %, 10 gange vævsvægt). Vortex grundigt i 15 s.
NOTE 1: Til 20 mg væv anvendes 200 μL methanol.
NOTE 2: Methanol bruges til at udfælde proteiner fra vævshomogenat og forstyrrer ikke kemiluminescensmetoden. Hvis der anvendes anden proteinudfældningsmetode, skal du teste dens kompatibilitet med kemiluminescens. - Homogeniser endnu en gang i 45 s ved den højeste hastighed, der er tilgængelig på det anvendte instrument. Inkuberes på is i 30 min. Centrifuge ved 17.000 x g, 4 °C, 30 min. Supernatanten aspireres, og nitrit/nitratniveauer måles, eller opbevares ved -80 °C til senere brug.
- Pulverisator (figur 3)
- Forbered rør indeholdende fortyndet stopopløsning (5x vævsvægt) og vej dem. Optag vægten (rør + stopopløsning).
- Placer værktøjet til flydende nitrogenpulverisator på tøris, og vent i ca. 30 minutter på, at det når den ønskede temperatur.
- Ved hjælp af pincet afkølet i flydende nitrogen overføres en prøve (vævsvægt målt allerede) til pulverisatoren. Tilsæt en lille skefuld flydende nitrogen for at sikre, at vævet har flydende nitrogentemperatur.
- Når 95% af det flydende nitrogen er fordampet, skal du placere knuseværktøjet oven på vævet og trykke fast. Du skal føle prøven knuse. Brug hammeren til at slå knuseværktøjet 3-5x.
- Kontroller prøven for eventuelle resterende bidder ved hjælp af en ske afkølet i flydende nitrogen. Efter afkøling i flydende nitrogen skal du bruge et stykke silkepapir til at tørre frosset vand væk, før du rører ved vævet. Hvis der er en klump, skal du flytte den ind i midten og derefter slå 5-6 gange mere med hammeren.
- Når hele prøven er blevet pulveriseret, anvendes den flydende nitrogenkølede ske til direkte overførsel af det knuste væv til det forvejede rør indeholdende den fortyndede stopopløsning (trin 3.3.1). Sørg for at udføre dette trin hurtigt, da når den knuste skeletmuskel opvarmes, bliver den klæbrig og vanskelig at overføre.
- Vortex til 15 s. Kontroller, at intet væv sidder fast øverst på røret ved at åbne røret. Hvis der er, så prøv at løsne det og derefter hvirvel igen.
- Centrifuger prøven i 2-3 s ved hjælp af en lille skrivebordscentrifuge. Vej røret igen. Vævsvægten beregnes ved at trække den oprindelige rørvægt (trin 3.3.1) fra denne nye vægt. Placer røret på is.
BEMÆRK: De nøjagtige vægte hjælper med at bestemme den nøjagtige vævsvægt, og hvor meget væv der gik tabt under pulverisering. - Når alle prøver er blevet behandlet op til trin 3.3.8, tilsættes en passende mængde methanol (≥ 99,9 %, 10 gange vævsvægt). Vortex grundigt i 15 s, og inkuberes på is i 30 min.
BEMÆRK: For 20 mg væv skal du bruge 200 μL methanol. Methanol bruges til at udfælde proteiner fra vævshomogenat og forstyrrer ikke kemiluminescensmetoden. Hvis der anvendes anden proteinudfældningsmetode, skal du teste dens kompatibilitet med kemiluminescens. - Centrifuge ved 17.000 × g, 4 °C, 30 min. Supernatanten aspireres og nitrit/nitratniveauet, eller opbevares ved -80 °C til senere brug.
4. Nitrit/nitratmåling med nitrogenoxidanalysator (NOA)
- Alle prøver forbered ved hjælp af en af tre forskellige homogeniseringsmetoder beskrevet ovenfor, og injicer dem i en NOA til måling af nitrat og nitrit.
BEMÆRK: Detaljerede protokoller til NOA-brug blev offentliggjort tidligere19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at opnå repræsentative resultater blev skeletmuskelvæv fra 8 Wistar-rotter (mænd og kvinder, vægt 250 ± 50 g) brugt. Rotte skeletmuskelhomogenater (50 mg gluteus maximus muskel for hver metode) blev fremstillet af tre forskellige homogeniseringsværktøjer (roterende homogenisator, perlehomogenisator og pulverisator). Nitrat- og nitritindholdet i disse homogenater blev derefter bestemt ved hjælp af en nitrogenoxidanalysator (NOA) (figur 4). Nitratniveauerne (figur 4A) i disse tre homogenatprøver var meget lig hinanden og varierede fra 39,6 til 45,2 nmol/g.
Interessant nok viste nitritniveauer (figur 4B) i en homogenatprøve fremstillet af en pulverisator den højeste værdi (0,99 ± 0,15 nmol / g), og dette var statistisk forskelligt fra de to andre prøveværdier. For at teste, om vævets størrelse ville påvirke homogeniseringseffektiviteten og de resulterende nitrat- og nitritværdier, blev tre forskellige skeletmuskelvævsstørrelser (gluteusmuskelvæv på 20, 50 og 200 mg) anvendt til homogenisering af en perlehomogenisator (figur 5). Hverken nitrat (figur 5A) eller nitrit (figur 5B) niveauer var signifikant forskellige mellem muskelprøvestørrelser. Imidlertid blev der observeret lidt lavere nitratkoncentrationer, når prøvestørrelsen blev øget, i flere forsøg af årsager, der er uklare.
Dernæst blev nitrat- og nitritniveauer i forskellige former for gnaverbenskeletmuskelvæv målt (figur 6). Ud over gluteus maximus muskel blev tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL) og gastrocnemius muskler (50 mg hver) isoleret fra rotteben og homogeniseret ved hjælp af en perlehomogenisator. Overraskende nok var nitratniveauerne af gluteusmuskel (40,4 nmol / g) ca. to gange højere end de tre andre muskelvæv, selvom disse forskelle i dette særlige eksperiment ikke nåede statistisk signifikans (figur 6A). Nitritkoncentrationen i gluteusmusklen var også højere end for de tre andre muskelvæv og var signifikant højere end i gastrocnemius-prøven (figur 6B).
Vi har fastlagt variationskoefficienten for alle tre anvendte metoder, og resultaterne er i vedhæftede tabel. Til sammenligning viser tabellen også variationskoefficienter bestemt af Troutman et al21.
Figur 1: Roterende homogenisator. a) homogenisator B) rør indeholdende væv og stopopløsning. Skeletmuskelvævsprøver placeres i et rør med fortyndet stopopløsning og homogeniseres tre gange. Prøverne skal straks lægges på is efter hvert homogeniseringstrin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Perlehomogenisator. a) homogenisator B) perler indeholdende rør. Skeletmuskelvævsprøver anbringes i et perleholdigt rør (5 keramiske perler) med fortyndet stopopløsning og homogeniseres tre gange i alt (45 s ved højeste hastighed for hver gang). Prøverne skal straks lægges på is efter hvert homogeniseringstrin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Pulverisator. (A) pulverisatordele (B) pulverisatorlegeme - mørtel og pistil samlet. (C) detaljer om mørtel og pistil samling. Pulverisatordele afkøles på tøris i 30 minutter. Flydende nitrogen sættes i mørtelen, og derefter tilsættes forvejet skeletmuskelvæv. Efter at 90 procent af det flydende nitrogen er væk, indsættes den øverste del - pistlen - i bassinet. Pistlen bankes med en hammer 5-6 gange, indtil prøven er pulverformet. Det pulveriserede væv overføres derefter til et rør med stopopløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: (A) Nitrat- og (B) nitritindhold i gluteusmuskelhomogenater fremstillet ved tre forskellige homogeniseringsmetoder. Halvtreds milligram gluteus muskel blev homogeniseret ved tre forskellige homogeniseringsmetoder. Methanol (500 μL) blev tilsat til homogenaterne for at udfælde proteiner. En standard kemiluminescensmetode med vanadiumchlorid eller tri-iodidopløsning blev anvendt til at måle henholdsvis nitrat- og nitritniveauer i den klare supernatant efter centrifugering; n=7 (nitrat); n=8 (nitrit); data præsenteres som gennemsnit ± SD, * p < 0,05 ved hjælp af envejs ANOVA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: (A) Nitrat- og (B) nitritindhold i forskellige prøvestørrelser af gluteusmuskel. Tre forskellige størrelser af gluteus muskelhomogenater blev fremstillet ved hjælp af en perlehomogenisator. En standard kemiluminescensmetode med vanadiumchlorid eller tri-iodidopløsning blev anvendt til at måle henholdsvis nitrat- og nitritniveauer i den klare supernatant efter centrifugering; n=7 (nitrat); n=8 (nitrit); data præsenteres som gennemsnit ± SD, Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: (A) Nitrat- og (B) nitritindhold i fire forskellige muskler. Hver muskel (50 mg) blev homogeniseret ved anvendelse af en perlehomogenisator, og en standard kemiluminescensmetode med vanadiumchlorid eller tri-iodidopløsning blev anvendt til måling af henholdsvis nitrat- og nitritniveauer; n=4-7 (nitrat); n=3-8 (nitrit); data præsenteres som gennemsnit ± SD, * p < 0,05 ved hjælp af envejs ANOVA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at overvåge ændringer i NO-metabolitter, nitrat og nitrit som en funktion af fysiologiske interventioner er det bydende nødvendigt at måle niveauerne af disse ioner i de forskellige organer, der er kritiske i deres metabolisme. Da hæmoglobin i blod vil reagere med NO og dets metabolitter, er det også vigtigt at fjerne blod hurtigt fra vævsprøver så meget som muligt. Således blev dyr perfunderet med saltvand, før de opsamlede skeletmuskelvæv (gluteus, TA, EDL, gastrocnemius muskel), og bindevæv og fedt omkring målmusklen blev straks fjernet. Til homogeniseringsopløsningen blev en 'stopopløsning' specielt formuleret med ferricyanid, NAM og ikke-ionisk overfladeaktivt stof til konservering af nitrit i forskellige væv19. Tilstedeværelsen af ikke-ionisk vaskemiddel er afgørende for fuld forstyrrelse af cellemembraner. I tilfælde af de to homogeniseringsmaskiner, der blev anvendt i denne undersøgelse, den roterende homogenisator og perlehomogenisator, var volumenet af stopopløsning, der kræves til homogenisering, 5x vævsvægten, således at hele vævet blev helt nedsænket i opløsningen og behandlet homogent.
Homogeniseringsprocessen blev udført tre gange i alt (to gange før tilsætning af methanol og endnu en gang efter tilsætning af methanol til udfældede proteiner), hver gang ved hjælp af en programmeret indstilling bestemt af instrumentproducenterne. Det er vigtigt at placere prøver på is umiddelbart efter hver homogenisering for at forhindre prøveforringelse ved den milde opvarmning, som kan genereres under homogenisering. Til pulveriseringsmetoden blev vævsprøver oprindeligt knust til pulver, mens de blev frosset ved hjælp af flydende nitrogen, hvorefter prøver blev blandet med stopopløsning (5x vævsvægt). I alle tre metoder blev methanol (10x vævsvægt) tilsat prøverne, og blandingen blev inkuberet på is i 30 minutter for at udfælde proteiner og fuldt ud ekstrahere nitrat og nitrit fra vævene. Tilstedeværelsen af proteiner i prøven kan forårsage overdreven skumdannelse af reaktionsopløsningen i kammeret ved anvendelse af kemiluminescens, så det er nødvendigt at udfælde proteiner fra prøverne. Ethvert udfældningsmiddel kan anvendes, men det er nødvendigt at bekræfte, at sådanne midler hverken vil forstyrre kemiluminescensmetoden eller forårsage ændringer i nitrit/nitratkoncentrationer ved at reagere med disse ioner.
Nitratniveauerne i alle gluteusprøver fremstillet ved de tre metoder var meget ens (39,6-45,2 nmol/g, figur 4A), hvilket tyder på, at disse tre homogeniseringsmetoder er lige anvendelige til fremstilling af muskelprøver til nitratanalyse. Selv om nitritniveauerne var lidt højere i prøver fremstillet ved pulverisering sammenlignet med de to andre metoder (figur 4B), lå alle målte værdier i et begrænset interval (0,64-0,99 nmol/g). Effekten af vævsprøvestørrelse på nitrat- og nitritværdier i skeletmuskelprøver blev undersøgt, fordi forskere ofte beskæftiger sig med meget små prøver, især fra små dyr eller menneskelige muskelbiopsier. Hverken nitrat- eller nitritniveauer var signifikant forskellige i området fra 20 til 200 mg skeletmuskelvæv i disse forsøg (figur 5).
Det er dog bemærkelsesværdigt, at selv om nitratindholdet ikke er statistisk signifikant, har det en tendens til at være lidt lavere, når det måles i større prøver (figur 5). Vi har bemærket dette fænomen i løbet af vores offentliggjorte og upublicerede undersøgelser, men vi forstår ikke årsagerne til det. Derfor er det sandsynligvis vigtigt at overveje prøvevægtene og ideelt set holde dem konsistente gennem hele en undersøgelse, når man forbereder homogenater fra flere vævsprøver. En anden overvejelse, når man arbejder med mindre prøver (20 mg), er, at den endelige samlede mængde forarbejdet prøve kun er ~ 300 μL, hvilket reducerer muligheden for at måle den samme prøve flere gange betydeligt. Men især til humane undersøgelser er 20 mg den sædvanlige acceptable størrelse for muskelbiopsier.
For at undersøge, om forskellige muskler i rotteben ville have forskelligt indhold af nitrat/nitrit, blev koncentrationerne af disse ioner sammenlignet i fire forskellige benmuskler (figur 6). Både nitrat- og nitritniveauer var højest i gluteusmusklen sammenlignet med tre andre muskelvæv, selvom forskellene ikke nåede statistisk signifikans i denne undersøgelse, hvilket tyder på, at nitratmetabolisme i forskellige muskeltyper kan styres forskelligt. Dette fænomen undersøges mere detaljeret i øjeblikket.
Andre forskningsgrupper har også rapporteret skeletmuskelnitratkoncentrationer, hvilket afslører betydelig variation i disse værdier. Coggan-gruppen viste, at nitratniveauerne i Sprague Dawley rotte soleus muskel varierer fra 62 til 124 nmol / g afhængigt af muskelforberedelsesmetoder21. Den samme gruppe rapporterede nitratværdier i SD rotte vastus lateralis (ca. 60 nmol/g) og soleus (ca. 215 nmol/g) i en anden undersøgelse23. Ohtake et al. målte nitratkoncentrationer i mus gastrocnemius muskel på >300 nmol/g; Der blev imidlertid ikke beskrevet præcise metoder til fremstilling af muskelhomogenat24. Verdijk-gruppen rapporterede nitratindhold i humane muskelbiopsier (vastus lateralis) fra 54 til 80 nmol/g afhængigt af deltagerens alder20 år; i en lignende undersøgelse rapporterer Wylie et al. 226 nmol / g for samme muskelgruppe17. Disse resultater tyder på, at koncentrationerne af nitrat/nitrit i skeletmuskelprøver afspejler mange faktorer - fysiologiske (f.eks. træningsstatus), miljømæssige (f.eks. kost) og tekniske (analysedetaljer) - som alle formodentlig bidrager til målevariation.
Vi bestemte variabilitetskoefficienten (CV) for alle tre metoder, der præsenteres her - se vedhæftede supplerende fil. Selvom CV langt fra er ideelt og varierer mellem de anvendte metoder, er vores CV-værdier sammenlignelige med dem, der er offentliggjort af Troutman et al. 21 ved hjælp af lignende metoder med forskellig behandling af prøver. Desværre er der stadig ingen klar forklaring på, hvorfor der fortsat er så stor variation. Dette papir er den eneste offentliggjorte detaljerede protokol, vi kender til behandling af muskelprøver til bestemmelse af nitrat og nitrit.
Vi målte også linearitet og grad af nitratgenvinding fra nitrat-spikede muskelprøver (se vedhæftede supplerende fil). Da vi tilføjede tre forskellige koncentrationer af nitrat i gluteusprøver til homogenisering, opnåede vi et godt lineært respons i stigning i nitratkoncentrationer med ~ 80% genvinding af tilsat nitrat til både perle- og roterende homogenisatorer. Disse resultater viser, at begge homogeniseringsmetoder med god sikkerhed kan anvendes til bestemmelse af nitrat- og nitritniveauer i biologiske prøver. Tabet af 20% tilsat nitrat sker sandsynligvis under deproteinisering og centrifugering af muskelvævshomogenat, når nogle ioner kan udfældes sammen med ladede proteiner eller andre celledele.
Generelt håber vi, at vores foreslåede metode til forberedelse af muskelprøver til målinger af nitrat og nitrit vil vise sig nyttig ikke kun i træningsforskningsområdet, men også i kliniske undersøgelser. Der er neuromuskulære og / eller metaboliske lidelser, der påvirker store populationer, der kan relateres til nitrogenoxidcyklusfejl og kan drage fordel af nitratforsyning. Man skal dog først fastslå, om der faktisk ikke findes nogen mangel, og om den kan afhjælpes ved diætintervention. Vi håber, at den metode, der er beskrevet her, vil gøre det muligt at overvåge skæbnen for nitrat og andre metabolitter i NO-cyklussen i skeletmuskulatur og andre organer
Vi er klar over, at metoder til forberedelse af skeletmuskulatur til nitrat- og nitritmålinger ved hjælp af kemiluminescens (den mest kvantitative af alle bestemmelser af nitrogenoxiderne selv) på dette tidspunkt af dets udvikling stadig har ukendte variabler, hvoraf nogle er diskuteret ovenfor. Selv med sine begrænsninger tillader de beskrevne metoder imidlertid en rimelig nøjagtig sammenligning af nitrat / nitritniveauer i forskellige organer, herunder forskellige skeletmuskler, og bør muliggøre formulering af hypoteser, der derefter kan testes med rimelig nøjagtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter. Alan N. Schechter er opført som medopfinder på flere patenter udstedt til National Institutes of Health til brug af nitritsalte til behandling af hjerte-kar-sygdomme. Han modtager royalties baseret på NIH-licensering af disse patenter til klinisk udvikling, men ingen anden kompensation. Disse arrangementer påvirker ikke hans overholdelse af JoVE journalpolitikker.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af intramural NIH/NIDDK-bevilling ZIA DK 0251041-14 til Alan N Schechter, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
References
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A.
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al.
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
